結(jié)直腸癌組織間隙連接蛋白29表達(dá)變化及其與患者臨床病理參數(shù)的關(guān)系

張永盟，張姍姍，袁明，趙衛(wèi)星，鮑永華，楊萬才

(1 新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，河南新鄉(xiāng)453003；2 濟(jì)寧醫(yī)學(xué)院精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)研究院)

細(xì)胞間隙連接是普遍存在于細(xì)胞間的膜通道結(jié)構(gòu)，由相鄰細(xì)胞膜上的兩個(gè)連接子相互連接而成。每個(gè)連接子由6個(gè)相同的連接蛋白亞單位構(gòu)成，每個(gè)亞單位即為細(xì)胞間隙連接蛋白(Cx)。Cx是一類同源四次跨膜結(jié)構(gòu)蛋白家族，具有傳遞細(xì)胞信息、協(xié)調(diào)新陳代謝、控制細(xì)胞增殖和分化以及維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定等多種生理功能[1]；其功能在不同的器官或組織具有特異性。Cx29是Cx家族成員之一，我們通過對(duì)大數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析發(fā)現(xiàn)，其可能與結(jié)直腸癌的發(fā)生、發(fā)展有一定相關(guān)性，但具體機(jī)制尚不清楚。本研究觀察了結(jié)直腸癌組織Cx29表達(dá)變化，現(xiàn)分析其與患者臨床病理參數(shù)的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 材料 選擇濟(jì)寧醫(yī)學(xué)院精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)研究院標(biāo)本庫收集的2012～2014年結(jié)直腸組織蠟塊標(biāo)本48例份，其中43例份包含結(jié)直腸癌組織、癌旁正常組織和轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)組織，5例份包含結(jié)直腸癌組織和癌旁正常組織。標(biāo)本來源患者男22例、女26例，年齡39～85歲、中位年齡68歲，結(jié)腸癌22例、直腸癌26例；腫瘤形態(tài)：隆起型5例，潰瘍型41例，浸潤(rùn)型2例；浸潤(rùn)深度：未浸透漿膜層20例，浸透漿膜層28例；組織分化程度：高中分化38例，低未分化10例；有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移43例，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移5例。

1.2 Cx29表達(dá)檢測(cè)

1.2.1 組織芯片構(gòu)建 將48例份組織蠟塊切成厚度為4 μm切片。切片經(jīng)60 ℃烘箱烤片1 h，行HE染色。顯微鏡下標(biāo)出每張切片對(duì)應(yīng)的結(jié)直腸癌組織、癌旁正常組織或轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)組織，同時(shí)在蠟塊上圈出其對(duì)應(yīng)位置。將組織蠟塊送武漢谷歌生物科技有限公司制成組織芯片蠟塊，然后對(duì)其切片，再將切片轉(zhuǎn)移至載玻片上制成組織芯片。為方便統(tǒng)計(jì)分析，將同一患者結(jié)直腸癌組織、癌旁正常組織或轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)組織依次標(biāo)記位置。

1.2.2 免疫組化染色 采用SABC法。將上述制作的組織芯片于60 ℃烘箱中烤片1 h，經(jīng)二甲苯和梯度乙醇脫蠟水化，蒸鍋中加熱0.01 mol枸櫞酸鈉緩沖液至95 ℃左右，放入組織芯片加熱5 min進(jìn)行抗原熱修復(fù)，自然冷卻至室溫；PBS漂洗5 min×3次，滴加3%過氧化氫室溫孵育30 min；PBS漂洗5 min×3次，山羊血清室溫封閉30 min，加入兔抗人Cx29單克隆抗體(1∶100)，4 ℃孵育過夜；取出保濕盒晾至室溫，PBS漂洗5 min×3次，加入生物素標(biāo)記的山羊抗兔二抗(1∶200)室溫孵育60 min；PBS漂洗5 min×3次，加入SABC室溫孵育60 min；PBS漂洗5 min×3次，DAB顯色，蘇木素復(fù)染，PBS返藍(lán)，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹脂封固。免疫組化染色過程中癌旁正常組織6例份、轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)組織2例份丟失，共獲取結(jié)直腸癌組織48例份、癌旁正常組織42例份、轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)組織41例份。

1.2.3 Cx29表達(dá)判定 Cx29陽性染色定位于細(xì)胞膜和細(xì)胞質(zhì)，呈淡黃色、黃色或棕褐色。根據(jù)染色強(qiáng)度對(duì)Cx29表達(dá)進(jìn)行判定：淡黃色為1分，低表達(dá)；黃色為2分，中表達(dá)；棕褐色為3分，高表達(dá)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)數(shù)資料比較采用χ2檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 結(jié)直腸癌組織、癌旁正常組織和轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)組織Cx29表達(dá)比較 見表1。

表1 不同組織類型Cx29表達(dá)比較[例(%)]

注：與癌旁正常組織比較，*P<0.05。

2.2 結(jié)直腸癌組織Cx29表達(dá)與患者臨床病理參數(shù)的關(guān)系 見表2。

表2 結(jié)直腸癌組織Cx29表達(dá)與患者臨床病理參數(shù)的關(guān)系

3 討論

結(jié)直腸癌是最常見的、嚴(yán)重威脅人類健康的惡性腫瘤之一。據(jù)2015年中國癌癥統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)顯示，我國結(jié)直腸癌的發(fā)病率和病死率均居所有惡性腫瘤的第五位[2]。隨著經(jīng)濟(jì)的發(fā)展，人們生活方式以及飲食結(jié)構(gòu)的改變，結(jié)直腸癌的發(fā)病率和病死率均有顯著上升趨勢(shì)。腫瘤形成是一個(gè)長(zhǎng)期的過程，需要經(jīng)歷多個(gè)階段，涉及多種基因。近年來通過人類基因組計(jì)劃研究了解人類基因組后，能夠從基因水平上認(rèn)識(shí)疾病，繼而從根本上治療或預(yù)防人類疾病。故腫瘤發(fā)生、發(fā)展的分子機(jī)制及靶向治療備受關(guān)注。為了提高結(jié)直腸癌患者的臨床治療效果和生存期，探尋特異的分子靶標(biāo)指導(dǎo)臨床決策就顯得尤為重要。

Cx幾乎存在于哺乳動(dòng)物的所有組織和細(xì)胞中，現(xiàn)已知其家族中至少有21位成員，其基因序列具有高度同源性，通常以不同的組合方式或不同的組合存在于不同組織和細(xì)胞中[3]。有研究發(fā)現(xiàn)，6個(gè)多方形的Cx組成1個(gè)半通道，2個(gè)半通道相互對(duì)接形成1個(gè)親水性孔道；而形成的半通道可以是相同的，也可以是不同的，2個(gè)半通道對(duì)接到一起，形成相同的通道(同質(zhì)連接)或不同的通道(異質(zhì)連接)[4]。這些通道能直接參與細(xì)胞內(nèi)外信息傳遞，如細(xì)胞內(nèi)代謝產(chǎn)物、第二信使以及電信號(hào)等[5]。目前已證實(shí)，在腫瘤和轉(zhuǎn)化細(xì)胞中普遍存在細(xì)胞間隙連接功能缺陷和Cx表達(dá)異常。Cx在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上可聚集合成功能型六聚連接小體[6]。亞細(xì)胞分離研究和免疫定位研究表明，Cx通過高爾基體到達(dá)細(xì)胞膜[7～9]。除此之外，Cx在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)合成，高爾基體加工修飾后進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)中，經(jīng)轉(zhuǎn)運(yùn)小體到達(dá)細(xì)胞膜[10]。目前關(guān)于Cx家族成員Cx26、Cx32、Cx43等與腫瘤的關(guān)系已有較深入研究[11]。Cx43在前列腺癌進(jìn)展的不同時(shí)期作用不同，前列腺癌早期Cx43表達(dá)缺失可促進(jìn)腫瘤進(jìn)展，而在晚期骨轉(zhuǎn)移過程中Cx43表達(dá)可增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞的侵襲力和附著力，這種現(xiàn)象在體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)均得到驗(yàn)證[12]。在乳腺癌中同樣發(fā)現(xiàn)Cx43表達(dá)可促進(jìn)腫瘤細(xì)胞遷移[13]。而在肝細(xì)胞癌中Cx32可通過Snail介導(dǎo)的EMT信號(hào)通路來抑制肝癌細(xì)胞侵襲[14]?，F(xiàn)已證實(shí)，Cx43與結(jié)直腸癌、乳腺癌及前列腺癌的發(fā)生、發(fā)展和患者預(yù)后有關(guān)[15～19]。Cx29定位于人類染色體7q22.1，由279個(gè)氨基酸組成，分子量為31.299 kD。有研究發(fā)現(xiàn)，Cx29基因突變可導(dǎo)致Cx在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中表達(dá)增高，從而促進(jìn)非綜合征型耳聾的發(fā)生[20]。亦有報(bào)道，Cx29蛋白并沒有形成功能性間隙蛋白通道，而是增強(qiáng)HeLa細(xì)胞中能量釋放[21]。但Cx29與腫瘤的關(guān)系，特別是與結(jié)直腸癌發(fā)生、發(fā)展的關(guān)系，國內(nèi)外鮮見報(bào)道。

本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，結(jié)直腸癌組織及轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)組織Cx29高表達(dá)明顯高于癌旁正常組織，結(jié)直腸癌組織Cx29高表達(dá)與腫瘤組織分化程度有關(guān)，提示Cx29高表達(dá)可能促進(jìn)結(jié)直腸癌的發(fā)生、發(fā)展。本研究同期分析了人類蛋白圖譜數(shù)據(jù)庫、美國癌癥基因圖譜TCGA中438例結(jié)直腸癌患者臨床資料，其中Cx29低表達(dá)者138例、Cx29高表達(dá)者300例，在長(zhǎng)達(dá)12年的隨訪中，Cx29高表達(dá)者生存時(shí)間明顯短于Cx29低表達(dá)者，說明Cx29表達(dá)變化有可能作為結(jié)直腸癌患者預(yù)后判斷的生物學(xué)標(biāo)志物。但由于本研究未對(duì)患者進(jìn)行隨訪觀察，這個(gè)結(jié)論尚需進(jìn)一步驗(yàn)證。

綜上所述，結(jié)直腸癌組織Cx29高表達(dá)，其表達(dá)變化與腫瘤組織分化程度有關(guān)。但目前對(duì)Cx29的具體作用機(jī)制尚不清楚，今后還需要進(jìn)一步深入研究。

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