稻曲病菌基因組DNA提取方法比較與小文庫構(gòu)建

伏榮桃 王劍 陳誠 龔學(xué)書 盧代華 羅曦 鄭愛萍

（1. 四川省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所 農(nóng)業(yè)部西南作物有害生物綜合治理重點實驗室，成都 610066；2. 四川農(nóng)業(yè)大學(xué)水稻研究所，成都 611130）

水稻稻曲病（Rice false smut）是由麥角菌科稻曲病菌Ustilaginoidea virens引起的真菌病害［1-2］。此病害已上升為水稻重要真菌病害之一［3］。稻曲病不但對水稻的產(chǎn)量和質(zhì)量造成重大的影響，其稻曲球還產(chǎn)生對人和牲畜有劇毒作用的真菌毒素，毒素可抑制微管蛋白和細(xì)胞的有絲分裂［4-5］。近年來，對稻曲病菌的侵染過程、有性生殖類型、分子生物學(xué)等方面的研究有了較大的進(jìn)展［6-8］。前人研究表明，稻曲病菌的菌絲能產(chǎn)生分生孢子和厚垣孢子，其分生孢子是病害的主要侵染源；分生孢子在水稻穎殼上附生，萌發(fā)生長成菌絲，隨后菌絲通過內(nèi)稃和外稃進(jìn)入小穗內(nèi)部，侵染雄蕊花絲，進(jìn)而侵染整個花器官［9-10］。Fu等［11］研究報道，稻曲病菌的有性類型為同宗配合，通過同宗配合方式產(chǎn)生有性子囊孢子。子囊孢子也是稻曲病發(fā)生的初侵染源之一［12］。稻曲病菌的BAC（Bacterial artificial chromosome）文庫［13］和cDNA文庫［14］的構(gòu)建，為致病基因的鑒定、比較基因組學(xué)等研究就奠定了基礎(chǔ)。Zhang等［8］對稻曲病菌全基因組和功能基因的分析，為該菌侵染水稻機理提供了重要線索。

目前，稻曲病菌的基因組序列仍有許多gap，同時與致病相關(guān)的效能因子仍不明確。深入研究該菌的分子生物學(xué)水平的前提是獲得理想的總DNA或RNA材料，而稻曲病菌的本身會產(chǎn)生大量的次生代謝產(chǎn)物，影響基因組DNA提取。雖然提取真菌DNA的方法比較多，但是不同真菌類群有不同的適宜提取方法［15］。江潔等［16］研究報道CTAB法對里氏木霉的基因組DNA提取效果優(yōu)于SDS法；張寶俊等［17］通過比較試驗發(fā)現(xiàn)SDS法對尖孢鐮刀菌和禾谷鐮刀菌的DNA提取效果優(yōu)于CTAB法；賀羽等［18］研究結(jié)果表明CTAB法對蘋果球殼孢腐爛病菌的DNA提取效果優(yōu)于試劑盒法。本研究旨在篩選出一種適用于大量稻曲病菌基因組DNA提取的方法，進(jìn)行測序，構(gòu)建基因組小文庫，并對文庫數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，為稻曲病菌的基因組gap的填補和致病相關(guān)基因的鑒定提供數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試菌株 稻曲病菌UV-cd2菌株為本實驗室提供，采用馬鈴薯蔗糖固體培養(yǎng)基（PSA）進(jìn)行培養(yǎng)。挑取PSA上培養(yǎng)的幼嫩菌絲于PS液體培養(yǎng)基中，置于28℃培養(yǎng)箱中進(jìn)行振蕩（150 r/min）培養(yǎng)，7 d后過濾收集菌絲；用無菌水洗滌菌絲2次，收集菌絲，-70℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.2 主要試劑 3% CTAB提取液（3% CTAB、1 mol/L NaCl、1 mol/L Tris-HCl（PH8.0）、0.5 mol/L EDTA、1% PVP、0.5% β-巰基乙醇）、3% SDS 提取液（3% SDS、1 mol/L NaCl、1 mol/L Tris-HCl（PH8.0）、0.5 mol/L EDTA、1% PVP、0.5% β-巰基乙醇）、蛋白酶K（1 mg蛋白酶K溶于5 mL無菌雙蒸水）、TE緩沖液（1 mmol/L EDTA（pH 8.0）、10 mmol/L Tris-Cl（pH 8.0））、醋酸鉀溶液（5 mol/L KAC，-20℃預(yù)冷）、酚 /氯仿 /異戊醇（25：24：1）、氯仿 /異戊醇（24：1）（-20℃預(yù)冷）、RNase溶液（5mg RNase溶于5 mL無菌水，混勻，-20℃保存）、75%乙醇水溶液、無水乙醇。

真菌DNA提取試劑盒（產(chǎn)品編號：D3390-02）（Omega Bio-Tek公司，美國）。試劑盒主要成分：緩沖液1、緩沖液2、緩沖液3、平衡緩沖液、RNA酶、DNA洗滌緩沖液和洗脫緩沖液。

1.2 方法

1.2.1 稻曲病菌DNA提取

1.2.1.1 CTAB提取法 取1 g稻曲病菌菌絲，加液氮研磨至粉狀，加入4 mL 3%CTAB提取緩沖液；65℃水浴45 min（每隔10 min振蕩1次，讓菌絲細(xì)胞充分裂解），10 000 r/min離心8 min，取上清液于一新離心管中，加入等體積的5 mol/L KAC（-20℃預(yù)冷），在冰上冰浴30 min，加入等體積的酚/氯仿/異戊醇（25∶24∶1）抽提2次；取上清液，加入等體積的氯仿/異戊醇（24∶1）抽提2次；取上清液，加入2/3體積的-20℃冰凍的異丙醇，-20℃沉淀30 min以上（或過夜），直到出現(xiàn)白色絮狀沉淀為止，10 000 r/min離心8 min，收集沉淀；用75%酒精洗滌沉淀2次；再用無水乙醇洗滌1次，風(fēng)干；加適量體積的無菌超純水溶解沉淀DNA；加2 μL RNase，37℃水浴30 min；加等體積氯仿/異戊醇（24∶1）抽提1次；取上清液，10 000 r/min離心8 min；取沉淀，加適量的雙蒸水，65℃水浴，溶解DNA；電泳檢測DNA的量和純度。并用分光光度計測量OD值。

1.2.1.2 SDS提取法 取1 g稻曲病菌菌絲，加液氮研磨至粉狀，加入4 mL 3% SDS，其它步驟同1.2.1.1 CTAB提取法。

1.2.1.3 試劑盒提取法 真菌DNA具體提取方法參照Omega真菌DNA提取試劑盒說明書（產(chǎn)品編號：D3390-02）。1.2.2 構(gòu)建文庫、測序 取1 μg DNA利用超聲儀（Fisher）打斷，切膠回收180 bp的片段，隨后純化DNA片段用TruSeqTMDNA Sample Prep Kit-Set A（Illumina，美國）制備文庫，并利用TruSeq PE Cluster Kit（Illumina，美國）進(jìn)行擴增，最后在Illumina機器上進(jìn)行測序反應(yīng)。

1.2.3 數(shù)據(jù)裝配與分析 使用Velvet（V1.2.03）軟件進(jìn)行組裝，再使用ABySS分析基因組數(shù)據(jù)的雜合率、重復(fù)度和GC含量等。

2 結(jié)果

2.1 稻曲病菌基因組DNA制備

采用CTAB法、SDS法和真菌DNA試劑盒法3種方法提取稻曲病菌基因組DNA，進(jìn)行電泳，成像。可以看出采用CTAB提取稻曲病菌DNA（圖1-A）的效果優(yōu)于SDS和真菌DNA試劑盒（圖1-B和1-C）。用分光光度計測OD值，CTAB法和試劑盒法的OD260/OD280在1.8-2.0之間，表明沒有雜質(zhì)污染；而SDS法的OD260/OD280＜1.6，表明有蛋白質(zhì)、糖類等雜質(zhì)污染。對樣品濃度進(jìn)行計算，其中CTAD法DNA濃度最大，濃度達(dá)到750 ng/μL；其次為SDS法，DNA濃度達(dá)350 ng/μL；最小為試劑盒法DNA濃度，只有 100-120 ng/μL。

圖1 稻曲病菌基因組DNA提取

2.2 稻曲菌基因組180 bp文庫質(zhì)量分布

用Solexa測序PE（pair end）庫，一共得到18 187 350堿基對序列，總堿基數(shù)為3.6 G。在測序的堿基識別（Base calling）過程中，堿基的正確識別率是98.59%即Q20為98.59%（圖2）。

2.3 180 bp文庫組裝分析

圖2 稻曲病菌UV-cd2堿基質(zhì)量分布

采用velvet（V1.2.03）軟件進(jìn)行組裝，組裝結(jié)果如表1所示。稻曲病菌UV-cd2基因組180 bp文庫的contig總數(shù)為21 970個，Scaffold的總數(shù)為17 908；Contig的平均長度為1 334 bp，Scaffold的平均長度為1 639 bp；Contig的N50長度為4 766 bp，Scaffold的N50為11 662；Contig的N90長度為373 bp，Scaffold的N90為385 bp；Contig的最長堿基數(shù)為60 180 bp，Scaffold的最長堿基數(shù)為104 433 bp；Contig最短長度為52 bp，Scaffold的最短長度為200 bp；總的堿基GC含量為49.79%（圖3）。

表1 稻曲病菌UV-cd2基因組180 bp文庫組裝結(jié)果

3 討論

圖3 稻曲病菌UV-cd2總的堿基GC含量

曾有研究報道，不同方法提取的真菌基因組DNA效果不一樣，如CTAB法對小麥條銹菌［15］、水稻紋枯?。?9］、木霉［20］等真菌的提取效果好，而SDS法對部分鐮刀菌的基因組DNA提取效果好［17］。用于文庫構(gòu)建的真菌基因組DNA需要高純度、高濃度、片段在30-50 kb之間的DNA片段。在進(jìn)行提取基因組DNA的過程中，所有操作器具都要經(jīng)過滅菌處理。本實驗采用CTAB法、SDS法和真菌DNA試劑盒法3種提取方法提取稻曲病菌基因組DNA，結(jié)果表明CTAB法能獲得濃度達(dá)到750 ng/μL、OD260/ OD280在1.8-2.0之間的高質(zhì)量DNA。真菌DNA試劑盒提取法也能獲得純度較高的DNA，但是獲得的DNA量遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于CTAB，這是因為試劑盒提取DNA時需要的菌絲量較少。因此，試劑盒提取法適用于需要較少量的基因組DNA提取。SDS提取的DNA有大量的雜質(zhì)污染，這可能是因為SDS是陰離子去污劑，對多糖等雜質(zhì)沒有較好的去除效果，而CTAB是陽離子去污劑，可以很好地去除多糖等雜質(zhì)。稻曲病菌在進(jìn)行液體培養(yǎng)時，菌絲體本身會產(chǎn)生大量的次生代謝產(chǎn)物，菌絲體黏稠且呈黃綠色，因此在收集菌絲體時要用無菌水洗滌幾次，以保證稻曲病菌菌絲體潔凈。在稻曲病菌基因組DNA提取過程中，最常見的問題就是蛋白質(zhì)和多糖的污染，因此在提取時，選擇CTAB提取液能有效地去除多糖的污染，同時要加入5 mol/L KAC和蛋白酶K進(jìn)行處理去除蛋白質(zhì)，在提取DNA過程的最后，還要加入RNA酶，去除RNA的污染，以保證提取的稻曲病菌基因組DNA純凈。

高質(zhì)量的DNA是構(gòu)建基因組文庫的保障。本實驗成功構(gòu)建了稻曲病菌UV-cd2基因組180 bp小文庫。文庫總堿基數(shù)為3.6 G，堿基的正確識別率Q20為98.59%，接近于正常的Q20值（99%），表明本研究構(gòu)建的基因組文庫質(zhì)量不錯。文庫組裝分析得出總的堿基的GC含量為49.79%，這與Zhang等［8］報道相似。從稻曲菌基因組DNA小文庫構(gòu)建數(shù)據(jù)分析可得出稻曲病菌的雜合率和重復(fù)度較高，這就預(yù)示著在稻曲病菌的全基因組或染色體組裝比較困難。該文庫的成功構(gòu)建，將為稻曲病菌基因組gap的填補和致病相關(guān)基因的鑒定提供數(shù)據(jù)，促進(jìn)稻曲病菌基因組學(xué)研究。

4 結(jié)論

本研究篩選出稻曲病菌基因組DNA最佳的提取方法是CTAB提取法，并構(gòu)建了基因組小文庫，小文庫測序組裝共得29 350 288堿基（bp）和17 908 Scaffold，總堿基的GC含量為49.79%，堿基的正確識別率是98.59%。

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