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    黃孢原毛平革菌漆酶基因lac1680的克隆、表達及產(chǎn)酶研究

    2018-05-07 08:33:13陳建軍劉梁濤曹香林
    生物技術(shù)通報 2018年4期
    關(guān)鍵詞:工程菌漆酶克隆

    陳建軍 劉梁濤 曹香林

    (1. 河南師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,新鄉(xiāng) 453007;2. 河南師范大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院,新鄉(xiāng) 453007)

    我國年產(chǎn)秸稈總量位居世界第一,但由于缺少有效的技術(shù)手段,導(dǎo)致這一生物資源的嚴(yán)重浪費,同時也污染環(huán)境[1-2]。秸稈的主要成分是纖維,主要集中于細胞壁,細胞壁含量占70%以上,由纖維素、半纖維素和木質(zhì)素組成;其中纖維素、半纖維素可在牛羊的瘤胃中被纖維分解菌酸解,生成揮發(fā)性脂肪酸,如乙酸、丙酸、丁酸等,被牛羊吸收作為能源利用[3-5]。已有研究表明這類物質(zhì)的有機物消化率很低,一般牛羊很少超過50%[6]。因此要提高秸稈的吸收利用率,對木質(zhì)素的降解已是重中之重。

    在眾多秸稈處理的方法中,微生物降解有著獨特的優(yōu)勢。木質(zhì)素的完全降解是真菌、細菌、微生物群落共同作用的結(jié)果,其中真菌起著重要的作用。在降解秸稈木質(zhì)素方面主要包括三類酶,漆酶(Laccase)、木質(zhì)素過氧化物酶(Lignin peroxidase)、錳過氧化物酶(Manganese peroxidase),目前研究最多的是真菌漆酶[7]。漆酶是一種多銅氧化酶,可以氧化分解木質(zhì)素中的酚類物質(zhì),近年來,對漆酶的研究也越來越多,并已經(jīng)取得了顯著的結(jié)果,在環(huán)境保護、造紙、食品等行業(yè)中也變現(xiàn)出極大的研究價值和應(yīng)用潛力[8-9]。盡管漆酶的研究已經(jīng)取得一定的進展,但自然界中漆酶的產(chǎn)量較少,目前國內(nèi)對產(chǎn)漆酶的菌種培養(yǎng)研究還處于起步階段[10],因此利用分子生物學(xué)方法研究漆酶基因并制備表達漆酶的工程菌,對實現(xiàn)漆酶的大規(guī)模生產(chǎn)和漆酶在各行業(yè)應(yīng)用具有重要的意義[11]。

    漆酶在造紙、環(huán)保、能源及食品等領(lǐng)域極富利用價值[12],目前漆酶的發(fā)酵主要來自于真菌,但工業(yè)化生產(chǎn)卻較難實現(xiàn),究其原因,主要是因為易污染、酶活不穩(wěn)定且活力相對較低所致[13-15]。此外,大部分真菌漆酶只有在中溫且弱酸條件下才能表現(xiàn)出較高的催化活性,限制了真菌漆酶在某些工業(yè)領(lǐng)域的應(yīng)用[16-17]。因此,通過克隆性質(zhì)優(yōu)良的新型漆酶基因,構(gòu)建高效異源表達載體及蛋白質(zhì)改造等,是解決漆酶資源短缺、增強酶在較高溫度下的穩(wěn)定性及在堿性條件下的高催化活性的重要途徑[18-19]。

    人們對漆酶基因的克隆研究也有近百年的歷史,雖然很多學(xué)者克隆出不少漆酶基因,也都在酵母和大腸桿菌等表達體系中進行表達,但表達分泌均較弱,到現(xiàn)在為止并沒有可以應(yīng)用于大規(guī)模生產(chǎn)的工程菌[20]。究其原因,可能在于未獲得酶活較高菌株作為克隆模板,表達穩(wěn)定性差等[21-22]。課題組前期研究了黃孢原毛平革菌Phanerochaete chrysosporium產(chǎn)漆酶的生化性質(zhì)和生產(chǎn)性能。該菌株與報道過的其他菌株相比,酶活力高,降解性能較好,同時產(chǎn)酶的條件也好控制,為研究漆酶基因的克隆表達和漆酶的純化奠定了基礎(chǔ),對構(gòu)建好的工程菌產(chǎn)生的漆酶進行了分離純化和酶學(xué)性質(zhì)研究,為后續(xù)運用蛋白質(zhì)工程的方法改造酶的催化活力和穩(wěn)定性奠定了基礎(chǔ)。

    1 材料與方法

    1.1 材料

    1.1.1 菌株 黃孢原毛平革菌Phanerochaete chrysosporium由河南師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院從菌肥中分離獲得,大腸桿菌Escherichia coliBL21(DE3)由本實驗保存,pET24a載體,來自上海生工公司。1.1.2 工具酶與其他試劑 限制性內(nèi)切酶NdeⅠ、XhoⅠ、T4 DNA連接酶、Taq DNA聚合酶購自TaKaRa公司;小提質(zhì)粒試劑盒及膠回收試劑盒購自TaKaRa;卡那霉素購于Ameresco公司;IPTG購自Merck公司;丙烯酰胺(Acr)及甲叉雙丙烯酰胺(Bis)購自Promega公司;引物合成和克隆質(zhì)粒測序由上海英駿生物工程公司完成;其余試劑均為國產(chǎn)分析純。

    1.2 方法

    1.2.1 白腐真菌漆酶基因的克隆及序列分析 根據(jù)根據(jù)NCBI中公布的白腐真菌的漆酶的基因序列(GenBank:AY225437.1),應(yīng)用 NCBI-Blast進行保守結(jié)構(gòu)域分析,表明該基因有3個保守的結(jié)構(gòu)域:即Cu-oxidase_3、Sufl和CuRO_2_MCO_like_1。其中Sufl是多銅氧化酶三蛋白結(jié)構(gòu)域,與細胞周期調(diào)控、細胞分裂、染色體分離、無機離子轉(zhuǎn)運與代謝有關(guān);第二個是Cu-oxidase_3的結(jié)構(gòu)域,這項包含許多不同的銅氧化酶樣結(jié)構(gòu)域;第3個是CuRO_2_MCO_like_1的結(jié)構(gòu)域,包含未知的多銅氧化酶二蛋白結(jié)構(gòu)域;根據(jù)該基因的基因組序列和PET24a表達載體的MCS位點,設(shè)計特異性PCR primers為:

    其中F1中含有NdeⅠ酶切位點;R1中含有XhoⅠ酶切位點。提取黃孢原毛平革菌總DNA為模板,PCR擴增條件為94℃,5 min預(yù)變性;94℃,1 min,58℃ ;30 s,72℃,2 min;29個循環(huán) ;72℃延伸10 min。所得片段膠回收后與克隆載體pET24a載體連接,轉(zhuǎn)化E. coliBL21(DE3),挑取陽性轉(zhuǎn)化子,提取質(zhì)粒酶切鑒定后測序,測序由上海生工公司完成。

    1.2.2 大腸桿菌表達載體的構(gòu)建及漆酶基因的誘導(dǎo)表達 將克隆好的漆酶基因用NdeI和XhoI進行雙酶切,膠回收漆酶基因片段,將其與經(jīng)相同酶切線性化的pET24a(+)載體連接,并將其轉(zhuǎn)化大腸桿菌E.coliBL21(DE3),篩選出陽性轉(zhuǎn)化子。酶切驗證正確后,挑選陽性轉(zhuǎn)化子接種于含50 μg/ml Kan的4 ml LB培養(yǎng)液的試管中,37℃ 220 r/min搖過夜并凍存;次日按1∶100接種于50 μg/ml Kan的30 mL LB培養(yǎng)液中,37℃ 220 r/min振搖至菌體OD600為0.4(約2 h);取出1 mL培養(yǎng)物,12 000 r/min室溫離心2 min,棄上清,用100 μL 1×上樣緩沖液重懸菌體沉淀;向剩余的培養(yǎng)物中加入IPTG至終濃度為0.5 mmol/L,25℃ 220 r/min振搖5 h,誘導(dǎo)CPE融合蛋白表達;取出1 mL培養(yǎng)物,12 000 ×g室溫離心2 min,棄上清,用100 μL 1×上樣緩沖液重懸菌體沉淀,剩余培養(yǎng)物4℃ 4 000×g離心12 min,棄上清,沉淀置-20℃凍存。

    1.2.3 SDS-PAGE確定表達產(chǎn)物的分布 分別取10 μL經(jīng)誘導(dǎo)的重組菌的上清及沉淀物,利用10%SDS-PAGE進行電泳分離,電壓130 V,考馬斯亮藍R250染色顯帶,Gel Doc2000成像系統(tǒng)分析。

    1.2.4 漆酶融合蛋白的純化 將過夜誘導(dǎo)表達的菌液于12 000 r/min,4℃離心15 min,收集菌體,采用超聲波細胞破碎法,用pH7.4 PBS緩沖液懸浮菌體,經(jīng)0.45 μm濾膜過濾后上柱,經(jīng)Ni-IDA-Sepharose CL-6B親和層析柱純化得到純化后的漆酶蛋白,收集流出液,進行12% SDS-PAGE分析。

    1.2.5 表達產(chǎn)物的Western blotting 鑒定 收集不同誘導(dǎo)表達時間的表達產(chǎn)物100 μL,加入100 μL 2×Sample Buffer重懸,開水煮沸5 min。各取10 μL上樣進行10% SDS-PAGE電泳。然后以半干法電轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上,取下硝酸纖維素膜利用TBST緩沖液短暫漂洗后經(jīng)5%光明脫脂奶粉室溫封閉l h,再用TBST漂洗3次后,與His-Tag單抗孵育過夜,次日TBST漂洗3次后,與IRDye800標(biāo)記的羊抗鼠IgG孵育l h,最后TBST 3次洗膜經(jīng)Odyssey紅外激光成像系統(tǒng)掃描實驗結(jié)果。

    2 結(jié)果

    2.1 漆酶基因的克隆及分析

    提取黃孢原毛平革菌基因組DNA,用Lac-F1和Lac-R1引物進行擴增,連接pET24a載體后,測序得到長度為1 680 bp的基因內(nèi)部片段,將其命名為lac1680(圖1)。測得擴增獲得的基因lac1680核苷酸序列與GenBank公布的漆酶基因的全基因組核苷酸序列(GenBank:AY225437.1)同源性達98%。

    2.2 質(zhì)粒圖譜的構(gòu)建

    根據(jù)載體序列和lac基因的序列最終構(gòu)建成完整的全質(zhì)粒圖譜,lac基因通過NdeI和XhoI兩個酶切位點插入到PET24a-lac里面全質(zhì)粒圖譜如圖2所示。

    2.3 重組表達質(zhì)粒雙酶切

    提取質(zhì)粒后,用NdeI和XhoI進行雙酶切。如圖3所示,在2號泳道出現(xiàn)1 600 bp左右和5 000 bp左右的片段,其中較小條帶與目的條帶相似,較大條帶為質(zhì)粒載體,說明表達載體連接成功。

    2.4 重組菌預(yù)表達的全菌裂解物SDS-PAGE檢測

    將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至大腸桿菌進行誘導(dǎo)表達,結(jié)果如圖4 所示,經(jīng)IPTG誘導(dǎo)的泳道出現(xiàn)了一條大小約75 kD的蛋白條帶,而未誘導(dǎo)的沒有條帶,進而說明誘導(dǎo)表達成功。

    2.5 SDS-PAGE檢測純化的lac-c-His6蛋白

    通過SDS-PAGE檢測純化后的蛋白,結(jié)果如圖5所示,4號泳道明顯呈現(xiàn)出一條與目的蛋白大小一致的單一蛋白條帶,幾乎看不到任何雜帶,說明純化效果良好。

    2.6 Western blotting驗證lac-c-His6蛋白

    利用Western blotting技術(shù),進一步驗證漆酶蛋白的可靠性。結(jié)果如圖6所示,4號未經(jīng)誘導(dǎo)的菌株在目的位置沒有條帶;相反,無論洗脫純化后還是濃縮后的溶液中均出現(xiàn)了目的條帶,從而證明該條帶即為誘導(dǎo)純化后的漆酶蛋白。

    2.7 野生型菌株與工程菌產(chǎn)漆酶能力研究

    圖1 漆酶基因核苷酸序列以及推導(dǎo)的氨基序列

    圖2 pET24a質(zhì)粒圖譜

    圖3 pET24a-lac重組表達質(zhì)粒雙酶切驗證的瓊脂糖凝膠電泳

    為了解重組菌的產(chǎn)酶活力,以野生型黃孢原毛平革菌為對照,比較了不同時間兩株菌的產(chǎn)酶活力。結(jié)果顯示,二者酶活力都是隨著培養(yǎng)時間的增加而增加,其中野生菌株菌株在第6天達到最大值(圖7-A),構(gòu)建好的工程菌株活力在第48 小時即可達到最大值(圖7-B),產(chǎn)酶時間大大縮短。此外,收集了菌株產(chǎn)酶能力最高時的細胞懸液,經(jīng)細胞破碎后,通過SDS-PAGE分析表明,構(gòu)建好的工程菌在蛋白水平上比原野生型菌株有了明顯的提高,而且其酶活力比野生菌株提高了近39%。

    3 討論

    圖4 pET24a-lac-BL21(DE3)重組菌預(yù)表達的全菌裂解物SDS-PAGE檢測

    圖5 SDS-PAGE檢測純化的lac-c-His6蛋白

    圖6 WB驗證lac-c-His6蛋白(用His的抗體)

    決定生物學(xué)功能的潛在因素是基因的分子特征,本研究前期對黃孢原毛平革菌漆酶基因進行了載體的構(gòu)建,成功克隆了黃孢原毛平革菌漆酶基因的cds區(qū)。序列分析表明,lac1680基因編碼的漆酶蛋白具有3個保守的結(jié)構(gòu)域,通過與其它已報道的漆酶的保守結(jié)構(gòu)相比較,經(jīng)PCR擴增、SDS-PAGE及Western blotting雙重驗證,證實了我們所篩選得到的陽性轉(zhuǎn)化子表達的重組蛋白能夠被分泌,同時明確證實了基因lac1680能夠編碼分泌漆酶蛋白。

    圖7 黃孢原毛平革菌(A)和工程菌(B)產(chǎn)漆酶能力折線圖

    與目前國際上所采用的漆酶基因的克隆方法而言,傳統(tǒng)基因克隆一般采用探針雜交來獲得其全長的cDNA序列,也有運用RACE技術(shù)進行克隆基因的例子,但其最終目的都是為了提高漆酶基因的表達量,或者是提高漆酶活性。近年來對菌株產(chǎn)酶條件、降解條件的優(yōu)化、漆酶載體的研究仍是研究熱點,例如鄧寒梅等[23]通過對固定化漆酶載體的研究來提高酶活性,張雪玲等[24]對漆酶Lac1338的酶學(xué)特性測定分析酶解染料影響。大腸桿菌重組菌具有生長快速、分泌能力強、易工業(yè)化生產(chǎn)等優(yōu)點,雖然也有構(gòu)建失敗的事例[25],但迄今為止還是被人們認(rèn)為是最具市場前景的前沿技術(shù)[26-27]。如楊建強等將野生革耳來源的漆酶基因在大腸桿菌中表達,得到可溶性漆酶蛋白,在可溶性漆酶蛋白中添加CuSO4并在室溫下孵育復(fù)性,獲得有活性的漆酶。

    通過對比工程菌與野生型菌株所產(chǎn)生的粗酶液,酶的比活力相差不大,只是酶活力有所提高,這可能與該漆酶基因來自與同一物種有關(guān),同時檢測重組蛋白所處的環(huán)境對酶活性也有一定的影響,后續(xù)將對構(gòu)建好的工程菌酶學(xué)性質(zhì)進行研究。未來在加強分子生物學(xué)和基因工程方面的研究,實現(xiàn)高效的異源表達,更加詳細的了解其功能,將其應(yīng)用于實踐生產(chǎn)[28]。

    4 結(jié)論

    本研究以先前篩選到的高產(chǎn)漆酶的黃孢原毛平革菌為模板,利用同源克隆技術(shù)合成一個全長為1 680 bp的漆酶基因,將該基因連接到構(gòu)建好的pET-24a載體上,并轉(zhuǎn)入大腸桿菌中,通過誘導(dǎo)表達,獲得漆酶蛋白。經(jīng)過SDS-PAGE及Western Blotting雙重驗證,充分證明了我們得到的就是誘導(dǎo)純化后的漆酶,初步建立起漆酶基因的異源表達及重組蛋白純化體系。通過對比基因工程菌和野生型菌株在不同培養(yǎng)時間段內(nèi)的酶活力,結(jié)果表明,構(gòu)建好的工程菌活力比原菌酶活力提高了39%。

    [1] Heikinheimo L, Suominen P, Suominen P, et al. Treating denim fabrics withTrichoderma reesei cellulases[J]. Textile Research Journal, 2000, 70(11), 969-973.

    [2] 謝長校, 孫建中, 李成林, 等. 細菌降解木質(zhì)素研究進展[J].微生物學(xué)通報, 2015, 42(6):1122-1132.

    [3] 李彬, 陳向楠, 張建法, 等. 產(chǎn)胞外多糖菌株的篩選及胞外多糖結(jié)構(gòu)分析[J]. 生物技術(shù)通報, 2016, 32(5):165-171.

    [4] 曹文娟, 袁海生. 樺褶孔菌漆酶固定化及其對染料的降解[J].菌物學(xué)報, 2016, 35(3):343-354.

    [5] 甄靜, 李冠杰, 李偉, 等. 毛栓孔菌XYG422菌株產(chǎn)漆酶發(fā)酵條件優(yōu)化及對玉米秸稈生物降解的研究[J]. 菌物學(xué)報, 2017,36(6):718-729.

    [6] 魏炳棟, 邱玉朗, 陳群, 等. 發(fā)酵玉米秸稈對育肥羊生長性能、營養(yǎng)物質(zhì)消化率及甲烷排放的影響[J]. 中國畜牧獸醫(yī), 2016,43(12):3200-3205.

    [7] Dittmer JK, Patel NJ, Dhawale SW, et al. Production of multiple laccase isoforms byPhanerochaete chrysosporiumgrown under nutrient sufficiency[J]. FEMS Microbiol Lett, 1997, 149(1):65-70.

    [8] 張澤雄, 劉紅艷, 邢賀, 等. 漆酶可降解底物種類的研究進展[J]. 生物技術(shù)通報, 2017, 33(10):97-102.

    [9] 劉家揚, 蔡宇杰, 廖祥儒, 等. 漆酶高產(chǎn)菌的篩選及產(chǎn)酶優(yōu)化[J]. 食品與機械 , 2010, 74(26):15-16.

    [10] 司靜, 崔寶凱, 賀帥, 等. 微酸多年臥孔菌產(chǎn)漆酶條件優(yōu)化及其在染料脫色中的應(yīng)用[J]. 應(yīng)用與環(huán)境生物學(xué)報, 2011, 17(5):736-741.

    [11] 司靜, 李偉, 崔寶凱, 等. 真菌漆酶性質(zhì)、分子生物學(xué)及其應(yīng)用研究進展[J]. 生物技術(shù)通報, 2011(2):48-55.

    [12] 曹文娟, 袁海生. 樺褶孔菌漆酶固定化及其對染料的降解[J].菌物學(xué)報, 2016, 35(3):343-354.

    [13] Giardina P, Faraco V, Pezzella C, et al. Laccases:a never-ending story[J]. Cellular and Molecular Life Sciences, 2010, 67(3):369-385.

    [14] Rodgers CJ, Blanford CF, Giddens SR, et al. Designer laccases:a vogue for high-potential fungal enzymes[J]. Trends in Biotechnology, 2010, 28(2):63-72.

    [15] Maestre-Reyna M, Liu WC, Jeng WY, et al. Structural and functional roles of glycosylation in fungal laccase fromLentinussp[J]. PLoS One, 2015, 10(4):e0120601.

    [16] 梁倩倩, 魏生龍, 席亞麗, 焦揚. 響應(yīng)面法優(yōu)化荷葉離褶傘菌絲體產(chǎn)漆酶條件[J]. 菌物學(xué)報, 2016, 35(3):335-342.

    [17] 劉冬忍, 田芳, 王小飛, 等. 啟動子替代構(gòu)建糙皮側(cè)耳漆酶高產(chǎn)菌株[J]. 菌物學(xué)報, 2016, 35(5):597-604.

    [18] 余小霞, 劉曉青, 田健, 等. 來源于枯草芽孢桿菌的漆酶cotA基因克隆與表達及其酶學(xué)性質(zhì)的研究[J]. 中國農(nóng)業(yè)科技學(xué)報,2015, 17(1):102-108.

    [19] Pardo I, Vicente AI, Mate DM, et al. Development of chimeric laccases by directed evolution[J]. Biotechnol Bioeng, 2012, 109(12):2978-2986.

    [20] Shekher R, Sehgal S, Kamthania M, et al. Laccase:microbial sources, production, purification, and potential biotechnological applications[J]. Enzyme Research, 2011. DOI:10.4061/2011/217861.

    [21] 甄靜, 李冠杰, 李偉, 等. 毛栓孔菌XYG422菌株產(chǎn)漆酶發(fā)酵條件優(yōu)化及對玉米秸稈生物降解的研究[J]. 菌物學(xué)報,2017, 36(6):718-729.

    [22] 鄭飛, 孟歌, 安琪, 等. 白腐真菌東方栓孔菌在兩種液體培養(yǎng)基中產(chǎn)漆酶過程的生理學(xué)研究[J]. 菌物學(xué)報, 2017, 36(5):582-597.

    [23] 鄧寒梅, 邵可, 梁家豪, 等. 漆酶的來源及固定化漆酶載體研究進展[J]. 生物技術(shù)通報, 2017, 33(6):10-15.

    [24] 張雪玲, 陳小利, 李荷. 漆酶Lac1338的酶學(xué)特性測定及定向突變對其酶解染料影響[J]. 生物技術(shù)通報, 2016, 32(7):170-177.

    [25] 高健, 關(guān)可興, 焦晶, 等. 細菌漆酶的結(jié)構(gòu)、催化性能及其應(yīng)用[J]. 分子催化 , 2014, 28(2):188-196.

    [26] 秦澎, 辜運富, 曾先富, 向泉桔. 香菇漆酶高產(chǎn)菌株篩選及漆酶基因的表達研究[J]. 菌物學(xué)報, 2017, 36(9):1243-1250.

    [27] 司靜, 崔寶凱, 戴玉成. 栓孔菌屬漆酶高產(chǎn)菌株的初步篩選及其產(chǎn)酶條件的優(yōu)化[J]. 微生物學(xué)通報, 2011, 38(3):405-416.

    [28] 閔華, 周曉舟, 林賢普, 等. 高效利用木質(zhì)素、半纖維素的草菇菌株初篩試驗[J]. 安徽農(nóng)業(yè)科學(xué), 2008, 36(23):9947-9948.

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