黃曲霉核糖體蛋白基因在不同生長(zhǎng)時(shí)期的表達(dá)分析

耿龍潑 王鑫旺 黃路華 鄧基利 汪世華 張峰

（福建農(nóng)林大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院 福建省病原真菌與真菌毒素重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福州 350002）

黃曲霉是一種常見的腐生真菌，它在緯度為16°-35°的溫帶地區(qū)極易從土壤中分離得到［1］。黃曲霉能以菌核的形式存在于土壤中并且抵御極端環(huán)境，而后產(chǎn)生分生孢子在炎熱干旱的環(huán)境條件下爆發(fā)［2］。黃曲霉作為人、動(dòng)物和植物的共同病原菌，可引起人和動(dòng)物的曲霉病。有報(bào)道稱北美地區(qū)65%的兒童曲霉病是由黃曲霉引起的［3］。此外，黃曲霉還會(huì)侵染花生、玉米、棉籽、堅(jiān)果、茶葉等作物［4］。全世界約有25%的谷物因污染真菌而不可食用，其中以黃曲霉的污染較為嚴(yán)重［5］。

黃曲霉除了自身能引起曲霉病和污染糧食作物的危害外，其另一個(gè)主要的危害是在生長(zhǎng)發(fā)育的過程中產(chǎn)生的次級(jí)代謝產(chǎn)物黃曲霉毒素（Aflatoxin，AFT）。黃曲霉毒素是聚酮化合物衍生的二呋喃香豆素，其合成由靠近3號(hào)染色體端粒處的一個(gè)含29個(gè)基因的基因簇調(diào)控［6］。黃曲霉毒素在酸性和中性條件下較為穩(wěn)定，難溶于水，而易溶于有機(jī)溶劑，且具有熒光特性［7］。常見的黃曲霉毒素有AFB1、AFB2、AFG1、AFG2、AFM1、AFM2等， 其 中 AFB1可以耐高溫，并且AFB1也是毒性和致癌性較強(qiáng)的物質(zhì)［8-9］。研究表明，當(dāng)黃曲霉的分生孢子和菌核的發(fā)育受到影響時(shí)，菌株幾乎失去毒素合成的能力［10］。此外，當(dāng)黃曲霉的分生孢子產(chǎn)量增多時(shí)，菌株的毒素合成量也有所提高［11］。這暗示黃曲霉的生長(zhǎng)發(fā)育能夠影響其毒素的產(chǎn)生。

核糖體蛋白作為核糖體的主要組成成分，除了在細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)生物合成中發(fā)揮著重要作用外，還具有其他的生物學(xué)功能。有研究表明抗黃曲霉品種的花生種子在發(fā)育時(shí)核糖體蛋白L41的表達(dá)比敏感品種中多，說明核糖體蛋白與植物的抗逆境能力息息相關(guān)［12］。也有研究表明核糖體蛋白L13可以結(jié)合去乙?；窼irT1，促進(jìn)其泛素化，從而抑制細(xì)胞周期和細(xì)胞凋亡［13］。在蛋白質(zhì)組水平對(duì)黃曲霉可變剪接的檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，核糖體蛋白L32存在著不同的剪接方式，這暗示了黃曲霉核糖體蛋白的不同表達(dá)方式可能在細(xì)胞中擔(dān)負(fù)著不同的生物學(xué)功能［14］。利用穩(wěn)定的同位素標(biāo)記法對(duì)產(chǎn)毒和非產(chǎn)毒狀態(tài)的黃曲霉總蛋白進(jìn)行標(biāo)記，分析發(fā)現(xiàn)核糖體蛋白L27的表達(dá)量存在差異，說明黃曲霉特定核糖體蛋白的表達(dá)量與其產(chǎn)毒存在著重要聯(lián)系［15］。

基于此，我們通過熒光定量RT-PCR對(duì)黃曲霉各個(gè)發(fā)育時(shí)期的74個(gè)核糖體蛋白mRNA進(jìn)行定量，以期找出與黃曲霉生長(zhǎng)發(fā)育緊密聯(lián)系的核糖體蛋白，為今后揭示核糖體蛋白調(diào)控黃曲霉生長(zhǎng)發(fā)育的機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

本研究所用的黃曲霉菌株為Aspergillus flavusNRLL3357（由中山大學(xué)賀竹梅教授惠贈(zèng)）。將少量黃曲霉孢子接種于PDA（Difco）培養(yǎng)基上，于37℃黑暗恒溫培養(yǎng)5 d后收集孢子，制備成孢子懸液。取106個(gè)孢子均勻涂布于鋪有玻璃紙的Wickerham［16］培養(yǎng)基上，分別于37℃黑暗恒溫培養(yǎng)1 d、3 d、7 d后收集樣品，命名為菌絲期、孢子期、菌核期，每組3個(gè)平行，樣品收集后用液氮迅速冷凍，于-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

黃曲霉核糖體蛋白mRNA序列從NCBI（National Center for Biotechnology Information）網(wǎng)站獲得，熒光定量PCR引物設(shè)計(jì)使用軟件Primer 5.0，引物合成由北京六合華大基因科技股份有限公司完成。

1.2 方法

1.2.1 總RNA的提取 稱取0.15 g菌體，加入1 mL冰上預(yù)冷的Trizol（Invitrogene），再加入0.2 mL直徑1.5 mm的磁珠，在組織破碎儀上65 Hz震蕩破碎90 s，5 000 r/min低溫離心2 min。取上清，加入200 μL氯仿，劇烈震蕩1 min，冰上放置10 min，12 000 r/min低溫離心15 min。取500 μL上清液至新的EP（RNase free）管中，加入500 μL異丙醇，顛倒混勻，冰上放置10 min，12 000 r/min低溫離心15 min。棄上清，加入1 mL 75%的乙醇（DEPC水配制）洗滌沉淀，10 000 r/min低溫離心5 min。棄上清，靜置晾干沉淀，加入30 μL DEPC水溶解沉淀，使用瓊脂糖凝膠和Nanodrop 2000分光光度計(jì)檢測(cè)總RNA的質(zhì)量和純度，-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA 取2 μg的RNA加入2 μL oligo（dT）18（10 mmol/L）引物并用DEPC水補(bǔ)齊至15 μL，70℃變性5 min，迅速轉(zhuǎn)移至冰上，冷卻2 min。向上述溶液中加入 0.5 μL RTase（Promega）、0.2 μL RNase Inhibitor（TaKaRa）、1.5 μL dNTP、5 μL RT buffer 和 2.8 μL DEPC 水，混勻，42℃反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)2 h，即得到cDNA。

1.2.3 熒光定量RT-PCR 將上述反轉(zhuǎn)錄得到的cDNA稀釋10倍用于熒光定量RT-PCR反應(yīng)，體系為 ：3 μL cDNA，1 μL 引物 F（5 μmol/L），1 μL 引物R（5 μmol/L），5 μL 2×SYBR Green Mix（ABI），總體積10 μL。熒光定量RT-PCR擴(kuò)增條件如下：預(yù)變性，95℃ 7 min；PCR 反應(yīng)，95℃ 15 s，56℃ 15 s，72℃ 45 s，循環(huán)40次。在72℃采集和記錄熒光。然后保持95℃ 15 s，60℃ 1 min，每10 s 加0.5℃直到95℃擴(kuò)增結(jié)束。反應(yīng)在ABI StepSnePlus 實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀上進(jìn)行。選擇β-tubulin作為內(nèi)參基因，每組樣品3個(gè)平行，目標(biāo)基因的相對(duì)表達(dá)量采用2-ΔΔCt法計(jì)算［17］。使用GraphPad Prism 5進(jìn)行統(tǒng)計(jì)和顯著性分析，Tukey多重比較用于顯著性分析，如果P＜0.05，則認(rèn)為顯著。

1.2.4 黃曲霉核糖體蛋白基因功能預(yù)測(cè) Gene Ontology功能分析數(shù)據(jù)在DAVID網(wǎng)站獲得（https://david.ncifcrf.gov/），GO功能富集分析使用OmicShare工具（www.omicshare.com/tools）。

2 結(jié)果

2.1 黃曲霉不同生長(zhǎng)時(shí)期的菌落形態(tài)

黃曲霉孢子在Wickerham培養(yǎng)基上37℃黑暗條件下培養(yǎng)1 d后，孢子在培養(yǎng)基上萌發(fā)生長(zhǎng)出白色的菌絲，為黃曲霉的菌絲期（圖1）。當(dāng)培養(yǎng)到第3天時(shí)，菌落呈現(xiàn)出綠色，顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)此時(shí)的菌絲會(huì)長(zhǎng)出分生孢子頭，為黃曲霉的孢子期（圖2）。當(dāng)培養(yǎng)到第7天時(shí)，培養(yǎng)基的營(yíng)養(yǎng)成分大部分被利用完，部分菌絲會(huì)凋亡，此時(shí)的菌落呈現(xiàn)出灰綠色。當(dāng)用75%的酒精噴洗掉菌落表面的孢子和菌絲，可以明顯看到形成的具有抗逆性的黑灰色菌核，為黃曲霉的菌核期（圖3）。

2.2 熒光定量RT-PCR分析結(jié)果

對(duì)提取的各時(shí)期的總RNA檢測(cè)顯示完整性好且質(zhì)量符合要求后，反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA，用于熒光定量RT-PCR檢測(cè)。熒光定量RT-PCR檢測(cè)結(jié)果表明，在所有檢測(cè)的核糖體蛋白基因中，沒有一個(gè)基因的表達(dá)量在3個(gè)時(shí)期是恒定的。如果以菌絲期作為參照，在孢子期共有54個(gè)核糖體蛋白基因的表達(dá)量上調(diào)，而在菌核期有57個(gè)核糖體蛋白基因的表達(dá)量上調(diào)，其中在孢子期、菌核時(shí)期表達(dá)量均上調(diào)的基因有42個(gè)（圖4-A）。但是，與菌絲期相比，只有2個(gè)核糖體蛋白的基因表達(dá)量在孢子期下調(diào)，而在菌核期表達(dá)量下調(diào)的核糖體蛋白基因有12個(gè)，在孢子期、菌核時(shí)期表達(dá)量均下調(diào)的基因有2個(gè)（圖4-B）。由此可見，黃曲霉核糖體蛋白的表達(dá)量與菌株的生長(zhǎng)發(fā)育密切相關(guān)，且在孢子期參與生命活動(dòng)的核糖體蛋白數(shù)目最多，菌核期次之，菌絲期最少。

圖1 黃曲霉菌絲時(shí)期的菌落形態(tài)

圖2 黃曲霉孢子時(shí)期的菌落形態(tài)

圖3 黃曲霉菌核時(shí)期的菌落形態(tài)

通過進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，多數(shù)核糖體蛋白基因從菌絲期發(fā)展到孢子期和菌核期后發(fā)生了明顯上調(diào)，且大致可以分為以下兩類：（1）在孢子期和菌核期有42個(gè)基因的表達(dá)量均上調(diào)，且存在顯著差異（P＜0.05）。它們可以分為3種情況：第一種情況是相比菌絲期表達(dá)量上調(diào)，但在孢子期、菌核期之間表達(dá)量無顯著差異的基因有9個(gè)，其中核糖體大亞基蛋白基因有2個(gè)，核糖體小亞基蛋白基因有7個(gè)（圖5-A）。第二種情況是在孢子期的表達(dá)量比菌核期多的基因有9個(gè)，其中核糖體大亞基蛋白基因有4個(gè)，核糖體小亞基蛋白基因有5個(gè)（圖5-B）。第3種情況是在菌核期的表達(dá)量比孢子期多的基因共有24個(gè)，其中核糖體大亞基蛋白基因有15個(gè)（圖5-C），核糖體小亞基蛋白基因有9個(gè)（圖5-D）。值得一提的是，大亞基L9、L25p、L27、L31的表達(dá)量是菌絲期的數(shù)十倍。（2）共有27個(gè)核糖體蛋白基因的表達(dá)量只在孢子期或菌核期單一時(shí)期上調(diào)，且存在顯著差異（P＜0.05）。有12個(gè)基因的表達(dá)量只在孢子期出現(xiàn)上調(diào)（圖6-A），有15個(gè)基因的表達(dá)量只在菌核期出現(xiàn)上調(diào)（圖6-B）。有趣的是，這15個(gè)只在菌核期表達(dá)上調(diào)的基因在菌絲期、孢子期的表達(dá)量都沒有明顯的差異。

圖4 差異表達(dá)基因在不同時(shí)期的分布

此外，與菌絲期相比，L13、S0在孢子期、菌核期的表達(dá)量均有所降低，且存在顯著差異（P＜0.05）。雖然L17、S2、S10在菌絲期、孢子期的表達(dá)量沒有明顯差異，但在菌核期的表達(dá)量卻有所降低，且存在顯著差異（P＜0.05）（圖7）。除了這5個(gè)基因之外，L2、L5、L7、L8、L12、S3、S6等7個(gè)基因在孢子期表達(dá)上調(diào)，但是在菌核期明顯下調(diào)，且存在顯著差異（P＜0.05）。

2.3 黃曲霉核糖體蛋白基因功能富集分析

圖5 孢子期和菌核期表達(dá)量均上調(diào)的核糖體蛋白基因的表達(dá)分析

圖6 孢子期或菌核期表達(dá)量上調(diào)的核糖體蛋白基因的表達(dá)分析

圖7 表達(dá)量下調(diào)的核糖體蛋白基因的表達(dá)分析

對(duì)黃曲霉核糖體蛋白基因進(jìn)行GO分類，得到包括分子功能，細(xì)胞組分和生物過程3部分，共9個(gè)類別的結(jié)果（表1）?？偣哺患玫?種分子功能，即結(jié)構(gòu)分子活性功能（6個(gè)基因）和結(jié)合功能的（3個(gè)基因），其中S15既具有結(jié)構(gòu)分子活性又具有結(jié)合功能。富集得到包含細(xì)胞、細(xì)胞部分、大分子復(fù)合物、細(xì)胞器和細(xì)胞器部分的5種細(xì)胞組分，其中L17、S0、S1、S15、S20在這5種細(xì)胞組分中均有出現(xiàn)。富集得到包括細(xì)胞過程和代謝過程在內(nèi)的2種生物過程，P1、P2、L12、L21、L27、L34、S12、S24均參與這2種生物過程。值得注意的是，L21在所得到的分類中均有出現(xiàn)，而S15同時(shí)出現(xiàn)在分子功能和細(xì)胞組分的分類中。這暗示上述兩種核糖體蛋白可能具有較為重要的作用。

3 討論

核糖體蛋白作為核糖體的主要組成成分，除了在細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)生物合成中發(fā)揮著重要作用外，還具有其他的核糖體外生物學(xué)功能。為了探究黃曲霉核糖體蛋白與其生長(zhǎng)發(fā)育之間的關(guān)系，我們利用熒光定量RT-PCR對(duì)黃曲霉菌絲期、孢子期、菌核期的74個(gè)核糖體蛋白基因的表達(dá)量進(jìn)行分析，結(jié)果表明在黃曲霉生長(zhǎng)發(fā)育的不同時(shí)期，核糖體蛋白基因的表達(dá)量存在明顯差異。

熒光定量RT-PCR結(jié)果表明，以菌絲期作為參照，共有54個(gè)核糖體蛋白基因的表達(dá)量在孢子期出現(xiàn)上調(diào)，在菌核期表達(dá)量上調(diào)的核糖體蛋白基因也有57個(gè)，且都存在顯著差異（P＜0.05）。引起這一現(xiàn)象的原因可能是黃曲霉完成其初始生長(zhǎng)階段，以孢子的形成為代表的發(fā)育階段開始進(jìn)行，菌體的發(fā)育及代謝的增多需要多種效應(yīng)基因的響應(yīng)，因而在孢子期和菌核期表達(dá)量上調(diào)的基因數(shù)量增多。如GO功能分析得到的分子功能中發(fā)揮結(jié)合功能的L1、L9、S15的表達(dá)量在孢子期或菌核期出現(xiàn)上調(diào)，這些核糖體蛋白的增多能夠結(jié)合rRNA形成更多的核糖體來發(fā)揮功能。參與細(xì)胞過程和代謝過程的P1、P2、L12、L21、L27、L34、S12、S24的表達(dá)量在孢子期或菌核期也出現(xiàn)上調(diào)。此外，有研究表明糖體蛋白L11、L23、S7能夠誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡［18-20］，這3個(gè)基因的表達(dá)量在黃曲霉的孢子期和菌核期均出現(xiàn)上調(diào)，可能與菌體的逐漸衰老凋亡有關(guān)。

表1 黃曲霉核糖體蛋白基因GO分類

與菌絲期相比，有2個(gè)核糖體蛋白基因的表達(dá)量在孢子期是下調(diào)的，而到了菌核時(shí)期表達(dá)量下調(diào)的核糖體蛋白基因有12個(gè)。引起這一變化的原因可能是隨著發(fā)育的進(jìn)行菌體內(nèi)活性氧水平逐漸升高，高水平的活性氧促進(jìn)了菌核的形成，但菌體中的氧化應(yīng)激引起了內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)，在核糖體蛋白基因的表達(dá)上表現(xiàn)出效應(yīng)［21-22］，因而使得在表達(dá)的核糖體蛋白基因減少。此外，有實(shí)驗(yàn)表明核糖體蛋白L7的表達(dá)量下調(diào)明顯與細(xì)胞的衰老有關(guān)［23］。黃曲霉進(jìn)入菌核期后，核糖體蛋白L7的表達(dá)量出現(xiàn)明顯下調(diào)，可能與該時(shí)期菌體的衰老有關(guān)。李紅艷［24］發(fā)現(xiàn)核糖體蛋白S3的表達(dá)減少導(dǎo)致細(xì)胞凋亡而引起果蠅幼蟲發(fā)育的遲緩。當(dāng)黃曲霉進(jìn)入生長(zhǎng)發(fā)育的孢子期，核糖體蛋白S3的表達(dá)量明顯比菌絲期上調(diào)，而進(jìn)入生長(zhǎng)發(fā)育緩慢的菌核期后，核糖體蛋白S3的表達(dá)量明顯下調(diào)，暗示了核糖體蛋白S3在果蠅和黃曲霉中可能發(fā)揮相同的作用。

用可引起DNA損傷的重金屬鎘處理香魚肝細(xì)胞，熒光定量RT-PCR檢測(cè)結(jié)果表明核糖體蛋白P0的表達(dá)增加，表明核糖體蛋白P0與DNA的損傷修復(fù)有關(guān)［25］。黃曲霉進(jìn)入菌核期后，核糖體蛋白P0的表達(dá)量明顯上調(diào)，可能是這一時(shí)期菌體中高水平的活性氧引起DNA的損傷，因而使得具有修復(fù)功能的蛋白P0的表達(dá)量上調(diào)。在應(yīng)激條件下，去乙酰化酶SirT1可以增強(qiáng)細(xì)胞的自我修復(fù)，延長(zhǎng)細(xì)胞壽命，而核糖體蛋白L13可以結(jié)合SirT1，促進(jìn)其泛素化降解［13］。在黃曲霉的孢子期和菌核期，核糖體蛋白L13的表達(dá)量逐漸出現(xiàn)下調(diào)，可能與響應(yīng)應(yīng)激及延長(zhǎng)菌體壽命有關(guān)。

雖然本研究從轉(zhuǎn)錄水平證實(shí)了黃曲霉核糖體蛋白與其生長(zhǎng)發(fā)育之間存在著緊密聯(lián)系，但每個(gè)核糖體蛋白在生長(zhǎng)發(fā)育過程中的具體作用還有待進(jìn)一步的鑒定。

4 結(jié)論

本研究通過對(duì)黃曲霉菌絲期、孢子期、菌核期的74個(gè)核糖體蛋白基因的表達(dá)量分析發(fā)現(xiàn)，沒有一個(gè)被檢測(cè)的核糖體蛋白基因的表達(dá)量在三個(gè)時(shí)期都是恒定的。分析結(jié)果表明在孢子期參與生命活動(dòng)的核糖體蛋白數(shù)目最多，菌核期次之，菌絲期最少。對(duì)黃曲霉核糖體蛋白基因進(jìn)行GO功能分析表明，9個(gè)基因富集于2種分子功能，10個(gè)基因富集于5種細(xì)胞組分，有8個(gè)基因參與到細(xì)胞過程和代謝過程的生物過程中?？梢姾颂求w蛋白與黃曲霉的生長(zhǎng)發(fā)育具有緊密聯(lián)系，而其在生長(zhǎng)發(fā)育中具體的調(diào)控機(jī)制還有待進(jìn)一步的研究。

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