一株分離自鈾礦酸性浸出液霉菌的鑒定與碳源代謝分析

劉歡 徐玲玲，2 李江，2

（1. 東華理工大學，南昌 330013；2. 東華理工大學省部共建核資源與環(huán)境國家重點實驗室培育基地，南昌 330013）

霉菌是一種廣泛存在于自然界中的多細胞微生物，是絲狀真菌的統(tǒng)稱，可分為毛霉屬、根霉屬、曲霉屬、木霉屬和青霉屬等幾大類。近幾年內在工業(yè)方面占有重要地位。除生產(chǎn)淀粉酶、酸性蛋白酶、木聚糖酶、植酸酶［1-2］等超過30種酶制劑外，還生產(chǎn)有機酸（如檸檬酸［3］、葡萄糖酸和沒食子酸等）及抗生素等，以及各種傳統(tǒng)食品（如醬油、釀酒和制醋等），并且在污水處理等方面都有涉及。因此霉菌是一類很有經(jīng)濟價值的微生物。

近年，隨著環(huán)境友好的生物冶金技術的深度發(fā)展，人們認識到已被廣泛應用的自養(yǎng)型鐵/硫氧化微生物在非硫化礦浸出中的局限性，與此同時，生產(chǎn)有機酸的霉菌進入生物冶金研究者的視野。有研究表明部分霉菌生長過程中生產(chǎn)的有機酸可與礦物中的有用金屬形成可溶性絡合物，從而將其從礦石中浸出，可作用于硫化礦物的浸出［4］，也適用于氧化礦物、磷酸鹽礦物的浸出，且有機酸基本屬于弱酸，對環(huán)境的影響小，同時這些有機酸可被自然界中的微生物分解，有利于環(huán)保。王永東［5］等就曾利用黑曲霉浸出某鈾礦，刁寧寧［6］等研究了黑曲霉發(fā)酵液浸出高堿性氧化銅尾礦。與其他浸礦方法相比，開發(fā)應用霉菌浸出具有一定發(fā)展前景，而從溶浸體系中分離適合冶金的霉菌菌株則是首要工作。

本研究從新疆某鈾礦酸性浸出液分離得到一株霉菌，本實驗中命名為MJ 5，一方面為霉菌浸出鈾礦做菌種儲備，另一方面為開展耐酸的霉菌胞外酶研究做準備。本研究結合形態(tài)學特征、rDNA ITS 序列分析以及Biolog鑒定系統(tǒng)對這株霉菌進行鑒定，通過構建系統(tǒng)進化樹得出親緣關系，通過碳源代謝分析了解該菌的生長情況及優(yōu)勢碳源，為后續(xù)的優(yōu)化培育等實驗提供有用的參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株 來自常年15-18℃ 新疆某鈾礦礦層、深度為328-335 m之間酸性浸出溶液中分離的霉菌，該浸出液pH為1.82，鈾濃度為65 mg/L。

1.1.2 培養(yǎng)基 2%麥芽汁培養(yǎng)基：2%麥芽汁，2%瓊脂，冷卻后調整pH值至5.5±0.2（28℃），于1×105Pa滅菌20 min；Dox培養(yǎng)基（g/L）：NaNO32.0，KH2PO41.0，MgSO4·7H2O 0.5，KCl 0.5，F(xiàn)eSO4·5H2O 微量，蔗糖 30.0，酵母提取物 0.5%，瓊脂粉 20.0，倒平板時加入0.5 mL溴甲酚紫指示劑。

1.2 方法

1.2.1 菌株的分離、純化與保存 分離與純化：用滅菌后的涂布棒將100 μL適當處理的鈾礦酸性浸出液均勻涂布于固體培養(yǎng)基的平板上，倒置放于30℃恒溫培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)，待固體培養(yǎng)基上長出菌落時，用接種環(huán)挑取少量菌絲在平板上進行劃線分離。反復3 次以獲得微生物純種，將獲得的純種單菌落挑取至100 mL液體培養(yǎng)基，放入搖床30℃，150 r/min進行培養(yǎng)。保存：將分離出的真菌進行平板劃線，并置于恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，直至菌絲頂端產(chǎn)生孢子后（3 d），在潔凈工作臺內將滅菌的棉簽（或接種環(huán)）用含1%Tween-20的滅菌雙蒸水沾濕，輕輕刮取孢子，盡量避免沾染菌絲，將刮取的孢子洗脫到含2 mL滅菌培養(yǎng)基的離心管中洗脫，震蕩5 min，過濾，去除菌體，從而制得孢子懸液，取500 μL孢子懸液至1.5 mL的保種管中，加入滅菌的20%甘油500 μL，將保種管置于-80℃冰箱中保存。

1.2.2 菌體的形態(tài)學觀察 固體平板劃線分離的純菌株經(jīng)過48 h恒溫培養(yǎng)后，挑取少量菌絲于載玻片上，用0.5%的品紅染色液進行簡單染色，加蓋玻片后用光學顯微鏡進行顯微觀察。

1.2.3 rDNA ITS序列以及進化樹的構建

1.2.3.1 樣品預處理 將100 mg純化后的菌體重懸于1 mL TE（pH8.0）中，反復吹打均勻，將菌體培養(yǎng)基殘液洗去，12 000 r/min，常溫，離心10 min，去除上清液，反復幾次使上清pH大于7.5，菌體可直接使用或保存于-80℃冰柜，作為總DNA的提取材料。

利用Ezup柱式真菌基因組DNA抽提試劑盒（上海生工，B518259）提取霉菌DNA，收集的產(chǎn)物可用1%瓊脂糖凝膠電泳驗證。

1.2.3.2 菌株的基因組序列測定 實驗擴增選用以下ITS系列［7］引物：

以總DNA模板進行PCR擴增，總體積為25 μL，PCR擴增反應體系為：18.3 μL的雙蒸水，2.5 μL 10×Extaq Buffer，2.0 μL dNTP（2.5 mmol/L），引物 ITS1（20 μmol/L）和 ITS4（20 μmol/L）各 0.5 μL，0.2 μL Extaq 酶，1 μL 模板 DNA。

PCR反應程序：94℃預熱處理4 min；94℃變性1 min，55℃退火45 s，72℃延伸90 s，32個循環(huán)；72℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物用1%的瓊脂糖凝膠驗證后，通過離心柱型瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒DP209切膠回收，回收產(chǎn)物送生物工程（上海）股份有限公司測序。

1.2.3.3 MEGA 5［8］軟件構建系統(tǒng)進化樹 測序結果在NCBI網(wǎng)站進行同源性序列比對，并且利用MEGA 5軟件構建系統(tǒng)進化樹。

1.2.4 Biolog鑒定系統(tǒng)（美國Biolog公司） 在Biolog FF鑒定板培養(yǎng) 24 h、48 h、72 h、96 h和120 h時，分別放置到 Biolog菌種鑒定儀上，讀取不同孔的OD490與OD750值。利用Excel 2016和OriginPro8.0對菌株利用不同碳源的吸光值 Ci 進行均值統(tǒng)計分析。

利用碳源的平均活性：菌株利用碳源的能力，可用平均吸光值（Average well color development，AWCD［9］）表示，通過計算和繪制菌株的AWCD值隨時間的變化，得到菌株利用碳源的平均活性。AWCD計算公式：AWCD=［Σ（Ci-R）］/n。其中，Ci是除對照孔外各孔吸光度值，R是板內對照孔吸光度值，n為碳源數(shù)量，本研究中n為95［10］。繪制AWCD隨時間變化的曲線，得出碳源利用情況。

2 結果

2.1 平板單菌落以及在光學顯微鏡下的形態(tài)特征觀察

從圖1中單菌落平板可知，菌叢黑褐色，菌絲為白色，背面呈現(xiàn)褶皺狀，嗅甲酚紫是一種酸堿指示劑，在酸性環(huán)境下由紫色變黃色。圖1中為加入該指示劑的平板，并且很明顯看出顏色變?yōu)辄S色，說明MJ 5具有一定的產(chǎn)酸能力。由圖2可看出分生孢子梗從壁厚而膨大的菌絲細胞垂直生出，菌絲有隔膜，光滑，上部較粗大，頂端膨大成球形的泡囊，從泡囊的全部表面以放射狀生出小梗分生孢子串生于小梗頂端，呈柱形輻射狀，分生孢子穗為黑色；并且可以很明顯看出菌絲內有隔膜，被隔膜隔開的一段菌絲成一個細胞，菌絲體由很多細胞組成，菌絲發(fā)達，多分枝，有多核的多細胞真菌，小梗雙層。通過查閱真菌鑒定手冊［11］初步確定為叢梗孢科，曲霉屬。

圖1 MJ 5在Dox固體平板上培養(yǎng)72 h后的單菌落形態(tài)

2.2 rDNA ITS序列鑒定結果

圖2 MJ 5在Dox固體平板培養(yǎng)基培養(yǎng)48 h后的形態(tài)

根據(jù)生工生物工程（上海）股份有限公司測序結果，在NCBI網(wǎng)站內進行同源序列比對，并通過比對結果經(jīng)MEGA 5軟件構建系統(tǒng)進化樹以及進化距離矩陣數(shù)據(jù)，結果顯示菌株（MJ 5）與Aspergillus nigerAN-1的相似度達99%，并由如圖3和圖4可看出菌株與Aspergillus nigerAN-1位于同一分支。

圖3 以rDNA ITS基因序列為分子標記的霉菌菌株系統(tǒng)進化樹

2.3 碳源代謝分析

Biolog鑒定系統(tǒng)每個顯示的結果均含有3種重要的參數(shù)，即可能性Probability（PROB），相似性Similarity（SIM）和位距Distance（DIS）。SIM和DIS是最重要的2個值，SIM值表示測試結果與數(shù)據(jù)庫相應數(shù)據(jù)條的相似程度，DIS值表示測試結果與數(shù)據(jù)庫相應數(shù)據(jù)條的位距。Biolog系統(tǒng)規(guī)定：絲狀真菌培養(yǎng)24 h時SIM值≥ 0.9，培養(yǎng)48 h時SIM值≥0.70，培養(yǎng)76 h時SIM值≥ 0.65，培養(yǎng)96 h時SIM值≥ 0.60，系統(tǒng)會自動給出較為可靠的鑒定結果，SIM值越接近1.00，鑒定結果的可靠性越高［12］。

圖4 以rDNA ITS基因序列為分子標記的霉菌菌株進化距離矩陣數(shù)據(jù)

Biolog FF鑒定板培育第4天時，系統(tǒng)顯示出3個理想重要參數(shù)，SIM值=0.695＞0.60，DIST值 =4.477＜5.0，PROB 值 =0.985，接近于 1，與數(shù)據(jù)庫有一個良好的匹配，初步鑒定菌株為黑曲霉（Aspergillus niger）。

2.3.1 霉菌對不同碳源的利用情況 為了解菌株對于不同碳源的利用情況，將95種碳源劃分為8類，即糖類、酸類、氨基酸類、聚合物類、醇類、胺類、磷酸鹽、脂類［13］。通過計算每類碳源的AWCD值來知道霉菌利用情況，如圖5所示。

圖5 霉菌對8類碳源的利用結果

由圖5可知，霉菌最初對氨基酸類、脂類、酸類的使用情況較于其他碳源的情況要高一些，磷酸鹽的利用一直處于一個較平穩(wěn)且利用率較低的狀態(tài)。并且從圖5中可看出菌株在每個時期對于碳源的利用情況不用，96 h前，對于8類碳源的吸收處于上升期，到120 h后，聚合物類、糖類以及胺類的吸收基本到達穩(wěn)定期，而脂類的利用則顯現(xiàn)下滑，對碳源的利用隨著時間的變化而改變，由此可知，菌種不同的生長階段都會影響對碳源的利用，并且該菌對酸類碳源的利用率排在前幾位，說明在一定的酸性環(huán)境下菌株也能正常生長，而且其活性相較于其他類碳源高。

2.3.2 霉菌優(yōu)先利用的15種碳源 通過95種不同碳源的比較，從中挑選出利用率較好的15種碳源，以此來了解霉菌對于碳源的消耗情況，如圖6所示。

圖6 霉菌對15種碳源的利用情況

從圖6中可以看出該菌株對P-羥苯乙酸的利用率最高，但是在72 h前需求量并不大，在后期利用率提高并趨于平穩(wěn)，P-羥苯乙酸的pH一般在2.0-2.4之間，說明在低pH的環(huán)境下，該菌株可以存活，并且后期生長迅速，由此可認為菌株具有一定的耐酸性，其次為琥珀酸甲基酯、L-丙氨酰胺基乙酸、L-天冬酰胺，這幾種碳源在48 h前呈直線上升，48 h左右達到最高并穩(wěn)定，而D-核糖的消耗率一直處于一個平穩(wěn)的狀態(tài)，其他碳源的利用在72-96 h左右達到最高，隨后基本保持穩(wěn)定。

3 討論

形態(tài)學觀察主要利用顯微鏡對菌絲的特征，子實體的形態(tài)（如孢子囊等的形態(tài)），孢子的形態(tài)（如孢囊孢子、分生孢子等）。據(jù)資料顯示rDNA 基因內轉錄區(qū)間（Internal transcribed spacer，ITS）具有變異性強和分化程度高的特性，可利用不同物種間或相同物種的不同菌株間可能存在的差異為依據(jù)，反映出生物的親緣關系及分類關系，被廣泛應用于真菌的鑒定、分類與種屬間系統(tǒng)學研究［14］。由于基因庫的完善程度、高度同源性序列的多少以及具體物種 ITS 區(qū)可變程度等因素的影響［15］，在運用ITS序菌種鑒定時可與其他鑒定方法相結合，提高鑒定結果的可信度。碳源代謝分析主要是通過菌株對Biolog微孔鑒定板上95種不同碳源的利用情況，通過計算平均吸光值（AWCD）了解霉菌的生長情況以及各類碳源的消耗量，運用數(shù)據(jù)分析霉菌的碳源利用情況。同時該系統(tǒng)可針對于絲狀真菌對不同碳源代謝率的差異，通過檢測微生物細胞利用不同碳源進行新陳代謝過程中產(chǎn)生的氧化還原酶與顯色物質發(fā)生反應而導致的顏色變化（吸光度）以及由于微生物生長造成的濁度差異（濁度），可與標準菌株數(shù)據(jù)庫進行比對，并得出一個鑒定結果［16-17］。

從霉菌的形態(tài)觀察中，可大致推斷該菌株為叢梗孢科，曲霉屬，通過Biolog 鑒定系統(tǒng)可知該菌株為黑曲霉，同時rDNA ITS序列的測序結果Blast數(shù)據(jù)比對與Aspergillus nigerAN-1的相似度達99%，綜上所述可確定從鈾礦酸性浸出液分離純化得到的菌株為黑曲霉。

形態(tài)學觀察可知菌體的大致外形以及結構，但是并不能確定具體的種類，通過rDNA ITS序列進化速率相對較快，可以提供較豐富的變異位點和信息位點，得到菌株具體的信息，但是由于同源性等因素限制，且操作過程繁瑣，有時需與其他鑒定手段相結合，可提高鑒定準確度，Biolog鑒定系統(tǒng)不僅可了解菌株的碳源代謝情況，同時還可知菌株的生長情況，操作簡便，鑒定速度快，但是相對于其他鑒定方法Biolog鑒定系統(tǒng)對菌種庫收錄的范圍較窄，有很多菌種名并沒有被擴充進去，因此，結合以上3種鑒定手段，不僅增加可信度還可以通過分析來了解菌株的碳源代謝，為后續(xù)菌體的研究提供有用的參考價值。

通過 Biolog鑒定系統(tǒng)對霉菌碳代謝特征研究得知，菌株在不同階段對碳源的消耗量以及通過比較可以了解菌株對不同碳源的利用率，以便設計出最適培養(yǎng)基，在生長過程中較先利用的碳源是氨基酸類、脂類、酸類，由圖4可看出菌株對P-羥苯乙酸的利用率最高，從不同碳源利用情況可知，菌種對碳源的利用隨生長時間的變化而改變，菌種的來源以及不同生長階段都會影響對碳源的利用，而且根據(jù)圖4和圖5可推斷菌株對酸具有一定的耐受性，在一定環(huán)境下能以酸性碳源為能源，并且后期生長比其他多數(shù)碳源迅速。在培養(yǎng)過程中發(fā)現(xiàn)該菌株的pH可以降至1.9-2.0之間，有機酸產(chǎn)量較高，在起始pH為2.5到2.0的培養(yǎng)基中依然可以存活，對酸的適應程度較高，根據(jù)譚媛［18］等對黑曲霉浸礦效果的研究，說明黑曲霉可適用于微生物浸礦方面。有些資料顯示真菌最適碳源利用為D-阿拉伯糖、L-阿拉伯糖和D-果糖等［19］大部分糖類，但是本文中利用率較高的為氨基酸類、脂類、酸類，造成兩者差異可能是由于菌株長期生長在一定的環(huán)境下，對周圍環(huán)境產(chǎn)生一定的適應性，并改變其生存的條件，因此，不同的環(huán)境可能會導致菌株代謝之間的差別。

4 結論

從新疆十紅灘某鈾礦酸性浸出液中分離得到1株霉菌，經(jīng)分子生物學、形態(tài)生物學觀察以及Biolog鑒定系統(tǒng)3種方法相結合鑒定該菌株為黑曲霉（Aspergillus niger）。菌株可產(chǎn)有機酸；對在培育96 h后對碳源的利用情況基本穩(wěn)定，其中利用率最高的為P-羥苯乙酸，說明該菌株具有一定耐酸性。

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