H2O2對黑曲霉氧化脅迫機理的研究

陳浩宇 徐瑞濤 程志翔 高強 張健

（工業(yè)發(fā)酵微生物教育部重點實驗室 天津科技大學生物工程學院，天津 300457）

黑曲霉是一種重要的工業(yè)發(fā)酵微生物，可為人類創(chuàng)造價值［1］；黑曲霉也是一種腐生真菌，可侵染農(nóng)產(chǎn)品和食品，造成極大的經(jīng)濟損失。某些黑曲霉菌株還能夠產(chǎn)生真菌毒素，直接威脅人類健康［2-3］。為了有效地控制黑曲霉的生長與產(chǎn)毒，有必要深入研究環(huán)境脅迫條件下黑曲霉的生長代謝情況。

在氧化脅迫條件下，黑曲霉會產(chǎn)生過多的活性氧自由基（Reaetive oxygen speeies，ROS），如超氧陰離子（·）、羥基自由基（·HO）和過氧化氫（H2O2），這會對菌體細胞的許多重要生物大分子發(fā)生不可逆轉(zhuǎn)的氧化損傷，使核酸、蛋白質(zhì)、膜多不飽和脂肪酸等出現(xiàn)交聯(lián)或斷裂，導致細胞結(jié)構(gòu)和功能的破壞，甚至引起細胞死亡［4-7］。為了能在氧化脅迫下不受傷害，黑曲霉會通過表達抗氧化酶和產(chǎn)生小分子抗氧化物有效地清除活性氧自由基?？寡趸钢饕ǔ趸锲缁福⊿OD）、過氧化氫酶（CAT）和谷胱甘肽過氧化物酶（GPX）；而小分子抗氧化物很多都是真菌次級代謝產(chǎn)物［8-10］。

真菌毒素是常見的次級代謝產(chǎn)物［11］，關于“真菌為何要合成真菌毒素”有多種解釋。真菌在氧化脅迫條件下通過產(chǎn)生真菌毒素來清除活性氧自由基，保持細胞內(nèi)氧化平衡就是其中的一種，因為很多真菌毒素的合成都有大量氧原子的參與［12］。Cresposempere等［13］研究表明，氧化脅迫可抑制炭黑曲霉的生長并且刺激真菌毒素的產(chǎn)生，如在培養(yǎng)基中加入甲萘醌可以導致炭黑曲霉生長變緩，且產(chǎn)生更多的赭曲霉毒素A（Ochratoxin A，OTA）；Fountain等［14］發(fā)現(xiàn)在培養(yǎng)基中加入H2O2可以導致黃曲霉生長變緩，且產(chǎn)生更多的黃曲霉毒素。這些研究均表明氧化脅迫確實能夠促進真菌毒素的合成。

黑曲霉在工業(yè)生產(chǎn)上有重要價值，在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中也可能造成巨大危害［15］。然而，關于氧脅迫對黑曲霉生長和OTA生物合成的影響卻鮮有報道。為了探究黑曲霉合成OTA的目的，也為了控制黑曲霉的侵染和產(chǎn)毒。本研究以H2O2作為外源活性氧來源，探究黑曲霉的氧化應激響應，主要包括菌體的生長、OTA的合成，胞內(nèi)活性氧和脂質(zhì)過氧化，以及抗氧化酶活性的變化，旨在為黑曲霉侵染和產(chǎn)毒的控制奠定理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株與培養(yǎng)基 黑曲霉1062（具有產(chǎn)OTA的能力）為實驗室保存菌株。培養(yǎng)黑曲霉所用的PDA培養(yǎng)基，察氏酵母膏瓊脂培養(yǎng)基（CYA）的配制參考文獻［16］。

1.1.2 主要試劑與儀器 OTA標品購于Fermentas公司，色譜甲醇，色譜乙腈購于Fisher公司，冰乙酸（分析純）購于天津市北方天醫(yī)化學試劑廠，H2O2（30%），硫代巴比妥酸（TBA），考馬斯亮藍G-250，氮藍四唑（NBT），核黃素等購于北京索萊寶科技有限公司；GPX酶試劑盒購于南京建成生物試劑有限公司；高效液相色譜儀Agilent1100，購自美國安捷倫科技有限公司；恒溫式電熱水浴鍋H1650-W購于天津市中環(huán)實驗電爐有限公司；高速離心機5418購于美國Eppendorf公司。

1.2 方法

1.2.1 H2O2對黑曲霉1062生長影響 將PDA斜面上生長5 d的黑曲霉1062孢子利用無菌水洗下，并通過血球計數(shù)板計數(shù)，得到105個/mL的孢懸液，取5 μL分別加到含有0 mmol/L，5 mmol/L，10 mmol/L H2O2的CYA固體培養(yǎng)基上（H2O2過膜后在培養(yǎng)基未凝之前添加）。25℃培養(yǎng)7 d，觀察菌落生長情況并測定菌落直徑。

1.2.2 HPLC-FLD檢測黑曲霉1062 OTA產(chǎn)量 25℃培養(yǎng)箱中取出0 mmol/L，5 mmol/L，10 mmol/L H2O2的CYA平板上生長3-7 d黑曲霉菌株，使用直徑為6 mm的打孔器從菌落邊緣到中心依次取出3塊含有菌體的瓊脂塊，加入500 μL甲醇，避光靜置2 h，使用孔徑為2 μm有機濾膜過濾，HPLC-FLD進行檢測OTA。HPLC-FLD檢測OTA條件見文獻［17］。

1.2.3 粗提液的制備及蛋白含量的測定 將平板上生長3-7 d的菌體刮下，稱取0.5 g，液氮研磨至粉末狀，使用5 mL 0.05 mol/L磷酸緩沖液（pH7.0）提??；4℃ 12 000 r/min離心15 min，取上清液，用于測定·產(chǎn)生速率，H2O2及MDA含量和SOD，CAT，GPX酶活性。蛋白質(zhì)含量參照Bradford法測定，以牛血清蛋白為標準。

1.2.4 黑曲霉胞內(nèi)活性氧指標測定 （1）H2O2含量測定：取粗提液1 mL，加1 mL預冷的丙酮，0.1 mL 5%硫酸化鈦和0.2 mL的濃氨水溶液，混勻后靜置5 min，4℃ 12 000 r/ min離心5 min，棄上清留沉淀。加入2 mL 2 mol/L硫酸溶解沉淀，沉淀完全溶解后在412 nm下測定吸光度。同時利用H2O2制作標準曲線，根據(jù)回歸方程計算樣品中HO的含量。（2）·22產(chǎn)生速率的測定：取1.0 mL粗提液加1.0 mL鹽酸羥胺，混勻后30℃水浴30 min，再加入1.0 mL對氨基苯磺酸和1.0 mL α-萘胺，30℃水浴15 min，12 000 r/min離心10 min，在530 nm下測定吸光度。以NaNO2制備標準曲線，通過測定反應液中生成濃度從而得出·的產(chǎn)生速率，具體參照王愛國等［18］的方法。

1.2.5 丙二醛（MDA）含量的測定 取1 mL待測液，加入3 mL 0.5% TBA，沸水浴20 min，迅速冷卻，12 000 r/min，離心10 min，分別測定上清液A450、A532和A600；按照如下公式進行計算MDA含量：c（μmol/L）= 6.45 ×（A532-A600）-0.56×A450。 其 中A450，A532，A600分別為在 450，532，600 nm 下吸光值。1.2.6 黑曲霉胞內(nèi)抗氧化酶活性測定 （1）SOD 活性的測定：采用氮藍四唑比色法。酶活性單位采用抑制光化還原NBT 50%為一個酶活性單位。（2）CAT 活性測定：參照Aebi法［19］，略加改進。反應體系包括：50 mmol /L 磷酸緩沖液（pH 7.0）、20 mmol/L H2O2和100 μL酶提取液。以緩沖液作對照，加酶液后立即測定1 min內(nèi)A240。以1 min內(nèi)A240減少0.1的酶量為1個酶活單位。（3）GPX活性測定參照“谷胱甘肽過氧化物酶（GPX）試劑盒”的方法。

2 結(jié)果

2.1 H2O2對黑曲霉1062生長的影響

為了研究H2O2對黑曲霉生長的影響，采用5 mmol/L和10 mmol/L的 H2O2對黑曲霉進行脅迫培養(yǎng)。通過測定菌落生長直徑發(fā)現(xiàn)5 mmol/L、10 mmol/L H2O2處理下的黑曲霉菌株在1-7 d菌落直徑明顯小于對照組（0 mmol/L H2O2），且10 mmol/L處理下的黑曲霉菌株菌落直徑總體小于5 mmol/L；另外，10 mmol/L處理下的黑曲霉在1-2 d內(nèi)無菌落產(chǎn)生，5 mmol/L處理下的黑曲霉在第1天無菌落產(chǎn)生，說明隨著H2O2含量的增加，對黑曲霉菌落生長的抑制作用愈加明顯（圖1）。

2.2 H2O2對黑曲霉產(chǎn)OTA的影響

為了驗證OTA的生物合成是否與氧脅迫有關，本研究對不同濃度H2O2脅迫下的黑曲霉合成OTA的水平進行了測定。結(jié)果如圖2所示，總體上菌體產(chǎn)OTA在第4天達到最大值，此后逐漸減少，原因可能是由于OTA被降解。H2O2的添加促進了菌體合成OTA，尤其是第4天，10 mmol/L H2O2處理組OTA產(chǎn)量達到3.64 ng/mm2，是對照組OTA產(chǎn)量的2.3倍；5 mmol/L H2O2處理組OTA產(chǎn)量達到2.42 ng/mm2，是對照組OTA產(chǎn)量的1.55倍。這說明過氧化氫能夠刺激菌體產(chǎn)毒。

圖1 H2O2的添加對黑曲霉1062生長的影響

圖2 H2O2的添加對黑曲霉1062 OTA產(chǎn)量的影響

2.3 H2O2脅迫下黑曲霉1062胞內(nèi)活性氧水平分析

2.3.1 H2O2對黑曲霉1062胞內(nèi)H2O2含量的影響 H2O2是反應胞內(nèi)活性氧的重要指標，通過測定黑曲霉胞內(nèi)H2O2含量發(fā)現(xiàn)對照組在黑曲霉生長的3-7 d過程中整體趨于穩(wěn)定態(tài)勢，而處理組胞內(nèi)H2O2波動較大，圖3顯示在第3天時處理組明顯高于正常生長的對照組，此時經(jīng)5 mmol/L H2O2脅迫生長的黑曲霉胞內(nèi)H2O2含量為對照組的3.67倍，經(jīng)10 mmol/L H2O2脅迫生長的黑曲霉胞內(nèi)H2O2含量為對照組的4.19倍；這說明H2O2的添加明顯提高了胞內(nèi)H2O2的含量，此后呈現(xiàn)降低并趨于穩(wěn)定的趨勢，這可能是由于胞內(nèi)抗氧化酶的作用降低了胞內(nèi)H2O2的含量。

圖3 外源H2O2的添加對黑曲霉1062胞內(nèi)H2O2含量的影響

22響 圖4顯示處理組在生長的3-7 d中，胞內(nèi)·產(chǎn)生速率呈現(xiàn)波動狀態(tài)，且整體高于對照組，其中在生長第3 天時最為顯著，經(jīng)5 mmol/L H2O2脅迫生長的處理組·產(chǎn)生速率是對照組的1.62 倍，10 mmol/L H2O2脅迫生長的處理組·產(chǎn)生速率是對照組的1.89 倍；以上結(jié)果可知由于外源H2O2脅迫作用，造成內(nèi)源性活性氧物質(zhì)H2O2以及·的產(chǎn)生在菌體生長前期均有明顯升高。

圖4 外源H2O2的添加對黑曲霉1062·產(chǎn)生速率的影響

2.4 H2O2對黑曲霉胞內(nèi)脂質(zhì)過氧化的影響

圖5反映了不同濃度H2O2脅迫下，黑曲霉胞內(nèi)MDA的變化情況。對照組MDA含量呈現(xiàn)逐漸升高并在生長第7天略有減少的態(tài)勢，這可能與菌體胞內(nèi)抗氧化酶活性及菌體生長代謝狀態(tài)相關；黑曲霉胞內(nèi)MDA含量測定結(jié)果顯示處理組在生長第3 天顯著高于對照組，此時5 mmol/L H2O2脅迫生長的黑曲霉胞內(nèi)MDA在第3 天為對照組的2.37 倍，10 mmol/L H2O2脅迫生長的黑曲霉胞內(nèi)MDA為對照組的2.71倍，此后與對照組的差異逐漸減小。

圖5 外源H2O2的添加對黑曲霉1062胞內(nèi)MDA含量的影響

2.5 H2O2脅迫下黑曲霉胞內(nèi)抗氧化酶活性分析

2.5.1 H2O2對CAT酶活性的影響 H2O2脅迫生長7 d測定胞內(nèi)CAT活性結(jié)果（圖6）顯示處理組CAT活性均高于對照組，隨著生長時間的延長，黑曲霉酶活整體呈現(xiàn)出先增長，后期降低的趨勢，且在第5 d CAT酶活達到最高，此時5 mmol/L H2O2脅迫生長的黑曲霉的CAT酶活是對照組約1.53倍，10 mmol/L H2O2脅迫生長的黑曲霉的CAT酶活是對照組約1.83倍?？梢娫贖2O2的脅迫下，黑曲霉為了適應生存而提升了CAT酶活性來平衡胞內(nèi)過多的H2O2。

圖6 外源H2O2的添加對黑曲霉1062 CAT酶活的影響

2.5.2 H2O2對SOD酶活性的影響 黑曲霉菌體生長的3-7 d過程中，胞內(nèi)SOD的酶活呈現(xiàn)與CAT酶活相似的變化趨勢，即：前期增長，后期降低，且在第5 天達到最大值；但是5 mmol/L和10 mmol/L H2O2處理的黑曲霉與對照組相比，整體差異不大（圖7）；以上結(jié)果表明對于外源H2O2來說，黑曲霉CAT對氧化脅迫響應表現(xiàn)的更為強烈，而胞內(nèi)的SOD酶的活性升高較為緩慢。

圖7 外源H2O2的添加對黑曲霉1062 SOD酶活的影響

2.5.3 H2O2對GPX酶活性的影響 在整個黑曲霉生長過程，經(jīng)H2O2處理的黑曲霉GPX酶活性整體高于對照組。且在第6 天達到最高值，此時5 mmol/L H2O2脅迫生長的黑曲霉GPX酶活為對照組的1.51倍，經(jīng)10 mmol/L H2O2脅迫生長的黑曲霉GPX酶活為對照組的1.57倍（圖8）；CAT酶雖能將H2O2轉(zhuǎn)變?yōu)镠2O和O2，但是胞質(zhì)中的O2如果超過一定量后，會產(chǎn)生過氧化物，所以仍需GPX協(xié)助才能徹底清除H2O2。

圖8 外源H2O2的添加對黑曲霉1062 GPX酶活的影響

GPX 酶活性的升高有助于清除 H2O2以及由ROS誘發(fā)的脂類過氧化物，從而減輕對細胞的損傷。

3 討論

黑曲霉是一種重要的真核微生物，它在生長過程中會面臨各種各樣的脅迫，氧化脅迫是最主要的脅迫之一［20-21］。H2O2作為強氧化劑，能夠穿過細胞膜在細胞內(nèi)自由移動，并且能夠透過細胞器膜，使其在細胞內(nèi)的毒性擴展，進而會導致自由基的產(chǎn)生與積累，造成細胞內(nèi)的氧化損傷，甚至引起細胞死亡［22］。本文以H2O2來創(chuàng)造氧脅迫條件，系統(tǒng)地研究了黑曲霉在此條件下的應激響應。從表型看，氧脅迫會抑制菌體生長，且具有顯著的劑量依賴性；氧脅迫會促進黑曲霉合成OTA，且OTA的合成與氧脅迫程度具有相關性，但是氧脅迫不會造成OTA合成與代謝的動力學趨勢變化。分析胞內(nèi)的H2O2水平，可以看出其與外部的H2O2添加水平是一致的，明顯高于對照組，證明其可以滲透進細胞膜，且H2O2添加劑量尚未完全氧化破壞細胞膜。胞內(nèi)·O2-的含量在氧脅迫條件下有顯著增加，但由于其代謝途徑復雜，其含量與H2O2添加量的相關性并不明顯，尤其是黑曲霉生長5 d以后，添加5 mmol/L 和10 mmol/L的H2O2對胞內(nèi)·O2-含量的影響趨于一致。H2O2脅迫下·O2

-產(chǎn)生速率的加快和黑曲霉胞內(nèi)H2O2含量的增加是導致MDA水平增加的主要原因［23-24］。在黑曲霉生長7 d的過程中，外部的H2O2添加對MDA水平的影響與對照組相比逐漸趨于一致。這說明黑曲霉在隨著生長時間的延長，遭受氧化脅迫損傷程度在逐漸減弱直至與對照組一致。SOD是特異清除·O2

-的抗氧化酶，而CAT能以H2O2為底物催化其分解［25］，GPX則能催化H2O2以及脂質(zhì)過氧化物［26-27］。CAT，SOD及GPX相互配合能夠有效清除過量的有毒活性氧，是黑曲霉抗氧化防御體系的主要抗氧化酶［28］。在H2O2脅迫生長7 d過程中，抗氧化酶均有不同程度的升高，是黑曲霉胞內(nèi)ROS含量在生長5-7 d過程中逐漸趨于對照組的主要原因。黑曲霉OTA合成在ROS含量增加期間明顯升高說明次級代謝也是排泄胞內(nèi)活性氧的有效途徑。

Fountain等［29］通過體外添加H2O2誘導氧化脅迫研究其對黃曲霉次級代謝生物合成及抗氧化酶的影響，經(jīng)轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果發(fā)現(xiàn)黃曲霉毒素生物合成基因及抗氧化酶基因等均有不同程度的上調(diào)，這說明真菌產(chǎn)毒及抗氧化基因的表達與菌體遭受氧化脅迫有很大的相關性，這與本研究結(jié)果顯示的OTA產(chǎn)量和抗氧化酶如CAT，SOD以及GPX酶活的升高相吻合。Jayashree等［30］通過比較寄生曲霉產(chǎn)毒菌株與不產(chǎn)毒菌株對氧的需求以及體內(nèi)氧化脅迫和抗氧化酶狀態(tài)，發(fā)現(xiàn)產(chǎn)毒菌株在顯示出更高的需氧量的同時，抗氧化酶酶活及氧化脅迫程度均高于不產(chǎn)毒菌株，由此得出毒素的產(chǎn)生可能是氧化脅迫的增加提升了脂質(zhì)過氧化及ROS的結(jié)果。本研究通過增加H2O2加入量來提升氧化脅迫的程度，結(jié)果顯示毒素的產(chǎn)量與氧化脅迫的程度成正相關，較好闡述了氧化脅迫可能是毒素產(chǎn)生的主要原因，這也與Zaccaria等［31］研究的結(jié)論一致。這些研究報道都說明了氧化脅迫在提升菌體抗氧化防御能力的同時也影響了菌體的生長及次級代謝，本研究也很好的證實了這一點。

正常生物體內(nèi)的自由基的產(chǎn)生和清除是處在動態(tài)平衡狀態(tài)，當各種外源或內(nèi)源性因素引起的ROS超過體內(nèi)的清除能力時，就會導致ROS水平升高，引起氧化應激，氧化細胞內(nèi)不飽和脂、蛋白質(zhì)和DNA等大分子結(jié)構(gòu)，從而破壞他們的生物學功能［32］。體外H2O2可透過細胞膜進入胞內(nèi)，使胞內(nèi)H2O2含量增加的同時提高了·O2-的含量，造成脂質(zhì)過氧化和多種氧化損傷；為了減輕和修復氧化損傷，細胞通過自身抗氧化系統(tǒng)和增強次級代謝來對體內(nèi)多余的活性氧自由基進行“解毒”與“排泄”［33-34］。

本研究的結(jié)果較好地解釋了上述現(xiàn)象，抗氧化酶的表達和次級代謝物OTA的合成可能都是黑曲霉在氧脅迫條件下生存的應激響應。為了排除H2O2對黑曲霉菌體除氧化脅迫外的其它影響，可以通過采用除H2O2外其他氧脅迫試劑來創(chuàng)造氧化脅迫的環(huán)境，從而驗證黑曲霉的應激響應。本研究結(jié)果對控制黑曲霉的侵染和OTA的合成提供了新的思路，對以黑曲霉為細胞工廠的工業(yè)生產(chǎn)和以黑曲霉為主要侵染菌的農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的健康發(fā)展有重要意義。

4 結(jié)論

通過5 mmol/L 和10 mmol/L H2O2對黑曲霉1062脅迫生長7 d過程中，隨著H2O2濃度增加，菌體胞內(nèi)ROS及 MDA含量在生長前期明顯升高，菌體生長亦隨之遲緩，菌落直徑減少，這說明H2O2能夠加重黑曲霉胞內(nèi)氧化脅迫水平從而抑制菌體的生長；菌體在氧脅迫下，通過提升抗氧化酶活性，增加毒素的合成來有效的緩解活性氧的毒害，這也與 ROS及 MDA含量在生長5-7 d逐漸與對照組趨于一致相符合。

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