核糖體成熟因子RimP、Era和RimJ的研究進(jìn)展

張樹(shù)軍，張國(guó)文，白 靚，曹瑞珍

（內(nèi)蒙古民族大學(xué) 醫(yī)學(xué)院，內(nèi)蒙古 通遼 028043）

核糖體是所有生物進(jìn)行蛋白質(zhì)合成的場(chǎng)所，無(wú)論是原核細(xì)胞還是真核細(xì)胞，核糖體的產(chǎn)生、組裝和成熟都是一個(gè)快速、復(fù)雜且能量消耗巨大的細(xì)胞過(guò)程，包括幾種rRNA和幾十種核糖體蛋白質(zhì)的合成、加工、折疊、成熟和結(jié)合。它沿著多條平行途徑進(jìn)行，并受到核糖體成熟（組裝）因子的引導(dǎo)，雖然已經(jīng)研究多年，但核糖體成熟（組裝）因子在指導(dǎo)核糖體組裝和成熟中的作用機(jī)制仍然不是很清楚［1］。RimP、Era和RimJ是大腸桿菌核糖體30S小亞基的成熟因子，促進(jìn)30S小亞基的組裝和成熟。此外，在細(xì)菌中一種蛋白質(zhì)具有幾種功能是普遍現(xiàn)象，除了促進(jìn)30S小亞基的組裝和成熟，RimP、Era和RimJ還對(duì)大腸桿菌的生長(zhǎng)起著重要作用，RimP可影響翻譯過(guò)程的保真性，Era參與細(xì)胞周期調(diào)控和凋亡，RimJ參與細(xì)胞對(duì)環(huán)境信號(hào)的反應(yīng)等。筆者總結(jié)了RimP、Era和RimJ在30S小亞基組裝和成熟過(guò)程中的作用以及它們的其他作用，為進(jìn)一步揭示30S小亞基組裝和成熟的過(guò)程以及RimP、Era和RimJ的其他功能提供依據(jù)。

1 大腸桿菌核糖體的組成與功能

原核和真核生物的核糖體都是由大小兩個(gè)獨(dú)立的亞基組成的精密分子機(jī)器。原核生物大腸桿菌核糖體的沉降系數(shù)為70S，其中，小亞基為30S，大亞基為50S，小亞基和大亞基都是由核酸和蛋白質(zhì)構(gòu)成的復(fù)合物，蛋白質(zhì)占總重量的1/3，核酸主要是rRNA。30S小亞基由1個(gè)16S rRNA（1 542個(gè)核苷酸）和21個(gè)蛋白質(zhì)（S1-S21）構(gòu)成；50S大亞基由5S（120個(gè)核苷酸）和23S（2 904個(gè)核苷酸）2個(gè)rRNA和33個(gè)蛋白質(zhì)（L1-L33）構(gòu)成，大小亞基構(gòu)成的核糖體負(fù)責(zé)解析mRNA上的遺傳密碼，并將tRNA上的氨基酸依次連接成肽鏈。

2 大腸桿菌核糖體小亞基的組裝和成熟

大腸桿菌核糖體小亞基的組裝和成熟過(guò)程主要包括細(xì)胞內(nèi)rRNA和核糖體蛋白的合成、加工和組裝?？煞譃樗姆矫妫海?）rRNA的轉(zhuǎn)錄、剪切以及堿基修飾。（2）核糖體蛋白的翻譯以及翻譯后修飾。（3）rRNA及核糖體蛋白的正確折疊。（4）核糖體蛋白與rRNA結(jié)合成為成熟的30S小亞基。

核糖體的組裝和成熟是由十幾種蛋白質(zhì)指導(dǎo)的，包括伴侶（DnaK、RbfA、RimM）、GTPases（Era、Der、CgtE）、RNA重塑蛋白，如RNA解旋酶（DeaD、SrmB、DbpA）和RNA修飾酶，如甲基轉(zhuǎn)移酶（KsgA、RrmJ）等［2］。研究發(fā)現(xiàn)，細(xì)菌內(nèi)核糖體小亞基的組裝是以16S rRNA的前體，即17S rRNA為初始物開(kāi)始的，并且核糖體的組裝過(guò)程與rRNA的轉(zhuǎn)錄過(guò)程相偶聯(lián)，即在16S rRNA的轉(zhuǎn)錄合成還未完成時(shí)，核糖體的組裝已經(jīng)開(kāi)始，這樣可以加快核糖體的合成效率。所以，核糖體的組裝是從rRNA的5’端開(kāi)始的。為了確保核糖體的組裝和成熟高效正確地進(jìn)行，細(xì)胞內(nèi)的一些蛋白有序地參與了核糖體的組裝過(guò)程，這些蛋白被稱為核糖體成熟（組裝）因子。盡管它們的具體分子作用尚不清，但這些核糖體成熟因子被認(rèn)為通過(guò)引導(dǎo)核糖體蛋白與rRNA結(jié)合，并通過(guò)動(dòng)力學(xué)效應(yīng)來(lái)引導(dǎo)rRNA折疊，從而促進(jìn)核糖體的組裝和成熟［2］。RimP、Era和RimJ是大腸桿菌核糖體30S小亞基的成熟因子，促進(jìn)30S小亞基的組裝和成熟。

3 RimP的結(jié)構(gòu)和功能

核糖體成熟因子P（RimP），以前稱為YhbC或P15a，基因長(zhǎng)度為453 bp，編碼由150個(gè)氨基酸組成的分子量為16.7 kDa的蛋白，該蛋白由3個(gè)α螺旋和8個(gè)β折疊組成［4］。RimP促進(jìn)核糖體組裝和成熟的作用最初是在rimP基因缺失突變體中發(fā)現(xiàn)的，在突變的細(xì)菌內(nèi)，成熟且具有翻譯活性的70S核糖體的數(shù)量減少，而游離的30S和50S亞基積累增多。重要的是游離的30S亞基顯示出未成熟的特征，因?yàn)?0S亞基中的rRNA是17S前體，而不是成熟的16S rRNA［5］。這些觀察結(jié)果表明，作為一種核糖體成熟因子，RimP的功能是促進(jìn)30S小亞基的組裝和成熟。體外重構(gòu)實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)RimP可提高大多數(shù)核糖體蛋白與pre-30S小亞基（30S小亞基前體）的結(jié)合速率，尤其是與16S rRNA 5’端結(jié)合的核糖體蛋白S5和S12，它們的結(jié)合速度分別提高2倍和6倍，即RimP對(duì)S12與pre-30S小亞基結(jié)合的動(dòng)力學(xué)效應(yīng)最大，但是其他核糖體蛋白質(zhì)與16S rRNA 5’端的結(jié)合動(dòng)力學(xué)沒(méi)有改變，表明RimP的這些效應(yīng)是特異的［4］。這兩種核糖體蛋白質(zhì)都是最后結(jié)合到30S小亞基，由此推測(cè)RimP也在30S小亞基組裝和成熟的后期發(fā)揮作用。RimP促進(jìn)S5和S12與30S亞基結(jié)合的作用也在體內(nèi)得到了證實(shí)，從RimP缺失株分離出來(lái)的核糖體組裝中間物中缺少這兩種核糖體蛋白［6］。此外，還發(fā)現(xiàn)這些中間體的中心假結(jié)（與S5和S12結(jié)合的16S rRNA結(jié)構(gòu)域）的形成受阻，推測(cè)作為30S亞基的后期裝配因子之一的RimP是通過(guò)穩(wěn)定中心假結(jié)來(lái)促進(jìn)與S5和S12的結(jié)合。研究表明，在大腸桿菌中，RimP與S5和S12直接相互作用，而在恥垢分枝桿菌中，通過(guò)免疫共沉淀和串聯(lián)親和純化發(fā)現(xiàn)RimP與S12存在相互作用，而與S5不存在相互作用［7-8］。

此外，RimP對(duì)細(xì)菌的生存和生長(zhǎng)也很重要。研究發(fā)現(xiàn)大腸桿菌缺失rimP會(huì)導(dǎo)致生長(zhǎng)缺陷，一個(gè)rimP缺失突變株（ΔrimP135）表現(xiàn)出溫度敏感的生長(zhǎng)表型，在30℃、37℃和44℃時(shí)，其生長(zhǎng)速度分別比野生型菌株降低1.2倍、1.5倍和2.5倍，表明隨著溫度的升高，生長(zhǎng)速度顯著降低［5］。隨著溫度的升高，rimP缺失突變體中未成熟的16S rRNA、30S亞基和50S亞基也積累增多，而成熟的70S核糖體則減少，揭示rimP缺失突變體的生長(zhǎng)缺陷是由核糖體組裝和成熟受阻所致。進(jìn)一步的研究顯示，rimP缺失突變體的生長(zhǎng)緩慢不能被其他已知的30S成熟因子如RbfA、RimM、Era、DnaK、YjeQ/RsgA或KsgA逆轉(zhuǎn)，表明RimP的這種作用是特異的。肺炎鏈球菌中RimP的同源蛋白SP14.3的缺失導(dǎo)致無(wú)法生存，偶發(fā)分枝桿菌的RimP對(duì)其在較低pH值的酸性體外條件下的生存至關(guān)重要，腸炎沙門(mén)氏菌的RimP對(duì)其毒力也起著至關(guān)重要的作用［9-11］。

但也有研究發(fā)現(xiàn)rimP的缺失導(dǎo)致細(xì)菌的生長(zhǎng)速度加快，因?yàn)閞imP的缺失可以提高其他的依賴NADPH的生物轉(zhuǎn)化活性，提高木糖醇的產(chǎn)生而加快生長(zhǎng)速度［12］。

作為一種核糖體組裝的輔助因子，RimP還可能影響翻譯效率。RimP可能會(huì)引起密碼子的誤讀，降低翻譯的準(zhǔn)確性。RimP的突變?cè)鰪?qiáng)了MetK（S-腺苷甲硫氨酸合成酶）的表達(dá)和蛋白翻譯的準(zhǔn)確性，從而增加了抗生素的產(chǎn)量［13］。

4 Era的結(jié)構(gòu)與功能

核糖體成熟因子Era（E.coli ras-like protein），又稱為RbaA或SdgE，基因長(zhǎng)度為906 bp，編碼一種類似Ras的GTP酶（GTPase），與核糖體30S小亞基相互作用，并促進(jìn)30S小亞基的成熟［14］。刪除era的細(xì)胞提取物沒(méi)有翻譯活性，加入Era蛋白也不能恢復(fù)其翻譯活性［15］。Era是一種雙結(jié)構(gòu)域蛋白，具有一個(gè)C端KH RNA結(jié)合域和一個(gè)N端GTPase結(jié)構(gòu)域。KH結(jié)構(gòu)域可識(shí)別16S rRNA的3’端反義SD（Shine-Dalgarno）序列附近的GAUCA核酸序列，并與之結(jié)合［16］。結(jié)合GTP的Era與pre-16S rRNA（16S rRNA前體）結(jié)合，改變pre-16S rRNA的構(gòu)象，尤其是pre-16S rRNA頭區(qū)的h23和h24螺旋的折疊，以利于RNases對(duì)其進(jìn)行加工，并提高其他核糖體成熟因子的活性，如KsgA。KsgA使pre-16S rRNA的h45中相鄰的兩個(gè)腺苷殘基甲基化［17-18］。16S rRNA的甲基化發(fā)生在其加工和成熟的后期，此時(shí)的30S小亞基還不具備翻譯能力，待16S rRNA成熟，Era通過(guò)水解GTP將其釋放。Era與pre-16S rRNA的結(jié)合可以阻止30S和50S亞基結(jié)合成為70S核糖體，提示Era是檢測(cè)16S rRNA是否成熟的重要蛋白［18］。金黃色葡萄球菌era的刪除導(dǎo)致成熟的30S小亞基數(shù)量明顯減少于50S大亞基，70S核糖體數(shù)量也減少，表明30S小亞基的成熟受阻［19］。體外組裝實(shí)驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)Era可以將核糖體蛋白S9、S11、S5和S12的結(jié)合速率提高2倍，3’結(jié)構(gòu)域蛋白S7、S10、S13、S14和S19等的結(jié)合速率也出現(xiàn)不同程度的提高［18］。

Era是一種高度保守的蛋白質(zhì)，在原核生物和真核生物中具有多種作用，除了參與核糖體組裝和成熟，還參與細(xì)胞周期調(diào)控和凋亡。Era是細(xì)菌細(xì)胞生存所必需的，通過(guò)耦合細(xì)胞生長(zhǎng)速率和胞質(zhì)分裂，在細(xì)胞周期調(diào)控中發(fā)揮重要作用。大腸桿菌的Era的表達(dá)受到抑制或Era的GTPase活性缺失，導(dǎo)致細(xì)胞周期中具有2個(gè)或4個(gè)類核的細(xì)胞分裂受阻。Era的完全刪除對(duì)細(xì)菌是致命的，缺失Era的大腸桿菌出現(xiàn)生長(zhǎng)受阻，無(wú)法進(jìn)行細(xì)胞分裂［20］。

Era通過(guò)其GTPase/GTP結(jié)合域在凋亡信號(hào)通路調(diào)控中發(fā)揮重要作用，Era GTPase結(jié)構(gòu)域的氨基酸取代突變可誘導(dǎo)HeLa細(xì)胞凋亡，并且可以被Bcl-2阻斷。缺失C端的KH結(jié)構(gòu)域，可以減輕Era突變體的凋亡，提示該結(jié)構(gòu)域?qū)ra功能的重要性［21］。

5 RimJ的結(jié)構(gòu)與功能

核糖體成熟因子J（RimJ）基因是在1979年發(fā)現(xiàn)的位于大腸桿菌基因圖譜的23.7分鐘位置，長(zhǎng)度為582 bp，編碼一種由194個(gè)氨基酸殘基組成的乙?；?，該酶特異地負(fù)責(zé)核糖體蛋白S5的Nα-乙?；龠M(jìn)核糖體30S小亞基的組裝和成熟。蛋白質(zhì)的Nα-乙?；怯蒒α-乙酰化酶（NATs）催化的，它將乙?；鶑囊阴］o酶A轉(zhuǎn)移到蛋白質(zhì)N末端氨基酸殘基的α氨基上［22］。這種乙?；梢灾泻蚇端的正電荷，該效應(yīng)也可能促進(jìn)合成過(guò)程中多肽的正確折疊，還可能促進(jìn)蛋白質(zhì)與其他蛋白質(zhì)或核酸的特異性結(jié)合和相互作用。Nα-乙酰化是真核生物中最常見(jiàn)的蛋白質(zhì)修飾之一，發(fā)生在大約80%～90%的不同種類的蛋白上，大約50%發(fā)生在酵母中，但很少發(fā)生在原核生物或古生菌的蛋白上。細(xì)菌內(nèi)蛋白的Nα-乙?；欠浅：币?jiàn)的，目前發(fā)現(xiàn)在大腸桿菌中只有4種蛋白質(zhì)：核糖體蛋白L7、S5、S18和延伸因子EF-Tu發(fā)生Nα-乙?；?，它們分別被大腸桿菌的3種Nα-乙?；?，即RimL、RimJ和RimI乙?；?3］。研究發(fā)現(xiàn)在RimJ基因缺失的大腸桿菌中，核糖體蛋白S5未發(fā)生乙?；?4］。

RimJ既是核糖體蛋白的修飾酶，又是核糖體組裝因子［25］。研究發(fā)現(xiàn)在核糖體蛋白S5突變（G28D）的大腸桿菌中過(guò)表達(dá)rimJ時(shí)，會(huì)抑制與S5（G28D）相關(guān)的冷敏感，翻譯保真度下降和核糖體生成缺陷。如果將S5（G28D）突變與rimJ缺失結(jié)合，會(huì)增強(qiáng)S5（G28D）菌株的生長(zhǎng)缺陷表型，而且rimJ抑制基因的功能是獨(dú)立于其乙酰轉(zhuǎn)移酶活性的［24］。還發(fā)現(xiàn)乙酰化的S5與核糖體蛋白的結(jié)合速度比未乙?；腟5快，表明當(dāng)S5與含16S rRNA的pre-30S亞基結(jié)合時(shí)，S5已經(jīng)發(fā)生乙?；?6］。這種結(jié)合可以提高30S小亞基隨后的重塑或避免一些無(wú)效的置換，從而促進(jìn)組裝過(guò)程。而且RimJ是在30S亞基成熟的中間階段與S5發(fā)生結(jié)合，表明S5的乙?；cRimJ的核糖體組裝功能可能發(fā)生在核糖體組裝的同一階段。

RimJ還參與細(xì)胞對(duì)環(huán)境信號(hào)的反應(yīng)，環(huán)境信號(hào)在調(diào)節(jié)致病基因表達(dá)方面起著重要的作用，它可能影響病原體在宿主中的定植能力和在外部環(huán)境中的生存。研究發(fā)現(xiàn)rimJ的缺失緩解了尿路致病性大腸桿菌在低溫、營(yíng)養(yǎng)豐富和葡萄糖環(huán)境下對(duì)菌毛基因papBA轉(zhuǎn)錄的抑制作用，但對(duì)fan、daa和fim操縱子的轉(zhuǎn)錄影響不大，表明RimJ在多種環(huán)境刺激下調(diào)節(jié)papBA的轉(zhuǎn)錄，并且是papBA轉(zhuǎn)錄的唯一負(fù)調(diào)控因子，此外，papI的轉(zhuǎn)錄也受到RimJ的調(diào)控［27］。

然而像許多rRNA修飾基因一樣，rimJ不是大腸桿菌生存的必要條件，而且非乙?；腟5同樣可以完成核糖體的組裝和成熟，這也說(shuō)明核糖體蛋白的修飾可能有助于微調(diào)翻譯復(fù)合物的結(jié)構(gòu)和功能。此外，rimJ缺失株的生存能力表明rimJ的核糖體組裝因子功能也不是必需的。表明大腸桿菌核糖體的組裝和成熟可能有多條途徑，當(dāng)其中一條途徑受阻時(shí)，可以利用其他途徑完成核糖體的組裝和成熟，從而補(bǔ)償某些特定組裝因子的缺失，提高細(xì)胞生存的可能性［28］。

6 總結(jié)和展望

在大腸桿菌中，每個(gè)細(xì)菌中大約含有多達(dá)15 000多個(gè)核糖體，生長(zhǎng)快速的細(xì)菌每分鐘可合成數(shù)千個(gè)核糖體［3］。說(shuō)明細(xì)胞內(nèi)核糖體的組裝和成熟不僅是一個(gè)復(fù)雜和耗能的過(guò)程，還是一個(gè)非?？焖俚倪^(guò)程，導(dǎo)致使用分離純化的方法來(lái)研究核糖體組裝和成熟的過(guò)程中有哪些成熟因子參與以及作用機(jī)制的難度很大。此外，核糖體的體外組裝需要特殊的溫度和條件，如高濃度的鹽、高濃度的鎂離子等條件；而且，與細(xì)胞內(nèi)高效率的組裝相比，體外組裝效率卻很低，這也為通過(guò)體外組裝來(lái)研究核糖體組裝和成熟過(guò)程和機(jī)制帶來(lái)困難。不過(guò)，隨著研究方法和技術(shù)的發(fā)展，核糖體組裝和成熟的過(guò)程，以及在此過(guò)程中核糖體成熟因子的作用機(jī)制終將揭示出來(lái)。

研究核糖體成熟因子的另一個(gè)難題是它們的功能可能是冗余的，因?yàn)橐恍┖颂求w成熟因子基因的敲除只會(huì)導(dǎo)致細(xì)菌生長(zhǎng)速率減慢，但并不致死，表明這些核糖體成熟因子的基因?qū)?xì)菌來(lái)說(shuō)并不是必不可少的，雖然核糖體是細(xì)菌生長(zhǎng)和繁殖不可缺少的，而且核糖體組裝和成熟過(guò)程還需要核糖體成熟因子參與。核糖體功能冗余的第二個(gè)體現(xiàn)是在某個(gè)核糖體成熟因子刪除或突變的菌株中過(guò)表達(dá)其他核糖體成熟因子可呈現(xiàn)補(bǔ)償效應(yīng)，如Era突變的細(xì)菌中過(guò)表達(dá)KsgA可以恢復(fù)表型，RbfA的敲除菌株中過(guò)表達(dá)Era可以部分恢復(fù)其表型［18］。此外，除了與核糖體組裝和成熟過(guò)程相關(guān)外，核糖體成熟因子還有其他功能，所以并不能確定其必須性是否與其作為核糖體組裝因子的功能相關(guān)。不過(guò)，隨著研究的不斷深入，核糖體成熟因子的功能也終將揭示清楚。