蒙古黃芪多糖含量測(cè)定的方法學(xué)研究

陳虎虎

（隴東學(xué)院岐伯醫(yī)學(xué)院，甘肅 慶陽(yáng) 745000）

1 儀器及試藥

UV1601分光光度計(jì)（日本島津）、AB204-N電子分析天平（METTLER TOLEDO）、電熱恒溫水浴鍋（奧特寶恩斯儀器有限公司）、旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（無(wú)錫市星海王生化設(shè)備有限公司；D-無(wú)水葡萄糖對(duì)照品（批號(hào)：0833-9501中國(guó)藥品生物制品檢定所）、甲醇、乙腈為色譜純，其他試劑均為分析純。

2 多糖含量測(cè)定方法建立

照紫外-可見(jiàn)分光光度法《中國(guó)藥典》（2010版一部附錄VA）測(cè)定[1]。

2.1 對(duì)照品溶液的制備：精密稱(chēng)取無(wú)水葡萄糖對(duì)照品適量，加水制成每1 mL含0.5 mg的溶液，搖勻，即得。

2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備：分別精密量取對(duì)照品溶液1.0 mL、2.0 mL、2.5 mL、3.0 mL、4.0 mL、4.5 mL、5.0 mL，置5 mL量瓶中，加水稀釋至刻度，搖勻。精密量取上述各溶液1 mL，置10 mL具塞試管中，精密加入5%苯酚溶液0.6 mL，混勻，迅速加入80%硫酸3.0 mL，搖勻，于90 ℃水浴中加熱15 min，取出，放入冰浴中冷卻15 min，以相應(yīng)的試劑為空白，照紫外-可見(jiàn)分光光度法，在490 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，以吸光度為縱坐標(biāo)，濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

2.3 供試品溶液的制備[2-3]：取60 ℃干燥至恒重的蒙古黃芪藥材粉末（過(guò)60目篩）2.5 g，精密稱(chēng)定，置索氏提取器中，用80%乙醇索氏回流提取2 h，殘?jiān)鼡]干溶劑后，加水80 mL回流提取2次，每次1.5 h，濾過(guò)，取濾液，用適量水洗滌藥渣，合并至200 mL量瓶中，加水至刻度，搖勻，精密量取1 mL，置10 mL具塞干燥試管中，備用。

2.4 測(cè)定法：精密量取供試品溶液1 mL，置10 mL具塞試管中，照標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備項(xiàng)下的方法，自“精密加入5%苯酚溶液0.6 mL”起，依法測(cè)定吸光度，從標(biāo)準(zhǔn)曲線上讀出供試品溶液中含葡萄糖的重量（mg），計(jì)算，即得。

結(jié)果表明，該色譜條件下對(duì)照品和供試品吸光度值穩(wěn)定，陰性對(duì)照品在相應(yīng)吸收波長(zhǎng)下無(wú)干擾，該色譜條件專(zhuān)屬性良好。

2.5 供試品的制備方法考察：在供試品溶液制備過(guò)程中對(duì)不同提取方法進(jìn)行比較：

2.5.1 醇除雜：取60 ℃干燥至恒重的蒙古黃芪藥材粉末（過(guò)60目篩）2.5 g，精密稱(chēng)定，置索氏提取器中，用80%乙醇索氏回流提取2 h，取80%乙醇索氏提取液，蒸干，殘?jiān)眠m量水溶解，濾過(guò)至10 mL量瓶中，并稀釋至刻度，精密量取濾過(guò)液1 mL，置10 mL具塞干燥試管中，備用。按上述“2.4”中測(cè)定法測(cè)定，吸光度值為0，表明該除雜方法可行。

2.5.2 提取

2.5.2.1 提取次數(shù)考察：取60 ℃干燥至恒重的蒙古黃芪藥材粉末2.5 g，精密稱(chēng)定，置索氏提取器中，用80%乙醇索氏回流提取2 h，殘?jiān)鼡]干溶劑后，加水100 mL回流提取，每次1.5 h，濾過(guò)，取濾液，用適量水洗滌藥渣，合并至200 mL量瓶中，加水至刻度，搖勻，精密量取濾過(guò)液1 mL，置10 mL具塞干燥試管中，備用，結(jié)果提取2次后可將蒙古黃芪中多糖提取完全。

2.5.2.2 提取時(shí)間考察：取60 ℃干燥至恒重的蒙古黃芪藥材粉末3份，每份2.5 g，精密稱(chēng)定，置索氏提取器中，用80%乙醇索氏回流提取2 h，殘?jiān)鼡]干溶劑后，分別加水100 mL回流提取1.0 h、1.5 h、2.0 h各2次，濾過(guò)，取濾液，用適量水洗滌藥渣，合并至200 mL量瓶中，加水至刻度，搖勻，精密量取濾過(guò)液1 mL，置10 mL具塞干燥試管中，備用。按上述“2.4”中測(cè)定法測(cè)定，結(jié)果表明每次提取1.5h與2.0h相比較，多糖含量增加并不明顯，從節(jié)約成本及時(shí)間角度考慮，每次提取1.5 h即可滿(mǎn)足實(shí)驗(yàn)要求。

2.5.2.3 溶劑用量考察：取60 ℃干燥至恒重的蒙古黃芪藥材粉末3份，每份2.5 g，精密稱(chēng)定，置索氏提取器中，用80%乙醇索氏回流提取2 h，殘?jiān)鼡]干溶劑后，分別加水50 mL、80 mL、100 mL回流提取2次，每次1.5 h，濾過(guò)，每次濾液減壓濃縮（0.1 MPa，60 ℃），濃縮液轉(zhuǎn)移至200 mL量瓶中，加水至刻度，搖勻，精密量取濾過(guò)液1 mL，置10 mL具塞干燥試管中，備用。按上述“2.4”中測(cè)定法測(cè)定，結(jié)果表明：以80 mL溶劑提取與100 mL溶劑提取相比，增加溶劑量多糖含量并無(wú)明顯變化，所以用水80 mL提取即可。

2.6 供試品溶液的制備方法確定：取60 ℃干燥至恒重的蒙古黃芪藥材粉末（過(guò)60目篩）2.5 g，精密稱(chēng)定，置索氏提取器中，用80%乙醇索氏回流提取2 h，殘?jiān)鼡]干溶劑后，加水80 mL回流提取2次，每次1.5 h，濾過(guò)，取濾液，用適量水洗滌藥渣，合并至200 mL量瓶中，加水至刻度，搖勻，精密量取1 mL，置10 mL具塞干燥試管中，備用。

3 多糖含量測(cè)定方法學(xué)研究

3.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：精密量取葡萄糖對(duì)照品溶液（0.493 mg/mL）1.0 mL，2.0 mL，2.5 mL，3.0 mL，4.0 mL，5.0 mL分別置5 mL容量瓶中，加水至刻度，搖勻。精密量取上述各溶液1 mL，置10 mL具塞試管中，精密加入5%苯酚溶液0.6 mL，混勻，迅速加入80%硫酸3.0 mL，搖勻，于90 ℃水浴中加熱15 min，取出，放入冰浴中冷卻15 min，以相應(yīng)的試劑為空白，照紫外-可見(jiàn)分光光度法，在490 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，以吸光度為縱坐標(biāo)，濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 標(biāo)準(zhǔn)曲線測(cè)定結(jié)果

以對(duì)照品質(zhì)量為橫坐標(biāo)，UV數(shù)值為縱坐標(biāo)作圖，得標(biāo)準(zhǔn)曲線，見(jiàn)圖2。

圖2 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線

結(jié)果表明，在對(duì)照品質(zhì)量為98.52～494.60 μg，呈良好的線性關(guān)系?；貧w方程為：y=0.0011x+0.0276，相關(guān)系數(shù)：r=0.9991。

3.2 精密度試驗(yàn)：取供試品溶液，依法處理，連續(xù)測(cè)定6次，記錄多糖吸光度值，結(jié)果表明，本試驗(yàn)中供試品吸光度值RSD為0.46%，精密度良好。

4 討 論

蒙古黃芪多糖藥理作用明顯，在蒙古黃芪的質(zhì)量研究中有必要對(duì)其加以關(guān)注；本實(shí)驗(yàn)采用單因素試驗(yàn)比較了不同提取溶劑、提取方法和提取時(shí)間對(duì)多糖含量的影響，確定出最佳前處理方案并建立了紫外分光光度法測(cè)定蒙古黃芪多糖含量的方法；對(duì)其方法學(xué)進(jìn)行研究，結(jié)果表明該含量測(cè)定方法穩(wěn)定可行，受蛋白質(zhì)等物質(zhì)影響較小，能方便、快捷、準(zhǔn)確的檢測(cè)樣品中多糖的含量，能夠?qū)γ晒劈S芪中總多糖含量進(jìn)行控制。

[1] 董群,鄭麗伊,方積年.改良的苯酚-硫酸法測(cè)定多糖和寡糖含量的研究[J].中國(guó)藥學(xué)雜志,1996,31(9):550-553.

[2] 許會(huì)生,趙廣榮,張鐵軍等.當(dāng)歸多糖的提取分離研究進(jìn)展[J].江西科學(xué),2007,25(1):42-46.

[3] 肖培根,楊世林,趙永華,等.黃芪[M].北京:中國(guó)中醫(yī)藥出版社,2001:123-124.