絲素纖維/硫酸鈣抗感染骨材料的制備及性能

劉世超 連小潔＊,,2 徐 睿 史振東,3 杜苗苗 張斯若何志敏 魏 延,2 黃 棣,2 王秀梅 崔福齋

（1太原理工大學(xué)力學(xué)學(xué)院，生物醫(yī)學(xué)工程系，納米生物材料與再生醫(yī)學(xué)研究中心，太原 030024）

（2太原理工大學(xué)應(yīng)用力學(xué)與生物醫(yī)學(xué)工程研究所，材料強(qiáng)度與結(jié)構(gòu)沖擊山西省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，太原 030024）

（3太原理工大學(xué)力學(xué)國家級實(shí)驗(yàn)教學(xué)示范中心，太原 030024）

（4北京奧精醫(yī)藥科技有限公司，北京 100176）

（5清華大學(xué)材料系，北京 100084）

0 引 言

感染、骨髓炎、癌癥、創(chuàng)傷等均可能導(dǎo)致感染性骨缺損[1-2]，相對于全身用藥，局部治療因其在感染局部植入載藥骨材料支架使藥物在局部釋放而使毒副作用降低[3]。在過去幾十年中，研究人員已經(jīng)進(jìn)行了各種嘗試來制備具有與天然骨性能相似的骨修復(fù)材料[4]。其中α型半水硫酸鈣（α-calcium sulfate hemihydrate，α-CS）被視為一種優(yōu)良的骨移植替代材料。它可以原位固化、任意塑性、具有良好的骨傳導(dǎo)性、生物相容性、不易引起免疫排斥反應(yīng)，已被臨床上使用[5-7]。然而硫酸鈣脆性大、降解速度快，以及載藥后初期突釋等問題[8]限制了其在臨床上廣泛的應(yīng)用[9]。

絲素蛋白（Silk fibroin，SF）是從蠶絲中提取的結(jié)構(gòu)蛋白，具有優(yōu)良的生物相容性、可控的降解行為，可以制備成絲素纖維、絲素凝膠、絲素膜、絲素海綿等，并已應(yīng)用于手術(shù)縫合線、皮膚、韌帶及骨組織工程、細(xì)胞培養(yǎng)基質(zhì)、藥物釋放等方面[10-11]。絲素包含多種氨基酸，獨(dú)特的氨基酸側(cè)鏈及疏水性的有序排列使其能夠發(fā)生自組裝；同時(shí)，包括絲氨酸、谷氨酸、天冬氨酸、酪氨酸、蘇氨酸等氨基酸表面具有活性基團(tuán)可與別的離子或基團(tuán)結(jié)合，發(fā)生化學(xué)鍵合[12-13]。已有研究將絲素溶液作為固化液來改善硫酸鈣材料的力學(xué)性能[14]，但是本研究發(fā)現(xiàn)直接用溶解后的絲素溶液作為固化液使凝固時(shí)間延長明顯，雖然韌性得到提高但是抗壓強(qiáng)度降低。目前有較多使用纖維增強(qiáng)的方式來提高硫酸鈣的力學(xué)性能[15]，同時(shí)有研究發(fā)現(xiàn)，由絲素蛋白制備的絲素納米纖維（SFFs）可以同時(shí)抑制破骨細(xì)胞的生長和刺激成骨細(xì)胞分化，縮短骨折愈合時(shí)間，減少并發(fā)癥[16]。

本研究制備了絲素納米纖維溶液，并作為硫酸鈣的固化液，擬通過構(gòu)建一種萬古霉素（VCM）/硫酸鈣/絲素納米纖維 （VCM/CS/SFFs）的復(fù)合骨修復(fù)材料，具體考察復(fù)合骨修復(fù)材料的力學(xué)、降解、藥物釋放速率及抑菌、細(xì)胞相容性等性能隨絲素納米纖維濃度的變化，為該復(fù)合材料今后在感染性骨缺損臨床應(yīng)用中奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 SFFs的制備

稱取一定量的蠶絲，在0.02 mol·L-1的碳酸鈉溶液中脫膠30 min，烘干。進(jìn)一步溶于9.3 mol·L-1的LiBr中，冷卻，溶液在去離子水中透析72 h，經(jīng)9 000 r·min-1離心 （H1850湘儀離心機(jī)儀器有限公司）后獲得絲素蛋白溶液。

將絲素蛋白溶液放入60℃烘干箱（BPG-9106A，上海一恒科學(xué)儀器有限公司），經(jīng)緩慢濃縮至 20%（w/w），再稀釋至 5 mg·mL-1，放入 60 ℃的烘干箱中培養(yǎng) 24～48 h，得到絲素納米纖維（SFFs）[17]。在掃描電鏡（Jeol JSM-7100F，日本電子）上進(jìn)行形貌觀察，工作電壓3 kV。

1.2 α-CS的制備

醫(yī)用硫酸鈣為α型半水硫酸鈣，分子式為α-CaSO4·1/2H2O，本研究通過水熱法制備α-CS。將二水 硫 酸 鈣 （calcium sulphate dehydrate，CSD）（德 國Merk公司）在溫度127℃，飽和蒸汽壓0.1～0.2 MPa下反應(yīng)8～10 h，放入烘箱中烘干，即制得白色粉末α-CS[18]。

1.3VCM/CS/SFFs的制備

選用α-CS、VCM為固相，CSD為促凝劑，不同濃度的SFFs溶液為固化液，液固比（L/S）為0.7 mL·g-1的條件下，按表1中固相比例和不同絲素纖維濃度攪拌均勻制成2種規(guī)格的試樣。大試樣規(guī)格為Ф 10×15 mm，用于進(jìn)行力學(xué)實(shí)驗(yàn)與凝固時(shí)間的測定；小試樣規(guī)格為Ф 4×3 mm，用于進(jìn)行抑菌、藥物釋放、降解、生物相容性MTT等實(shí)驗(yàn)。

表1 復(fù)合材料中各組分的比例Table 1 Proportion of components in composite materials

圖1 樣品尺寸Fig.1 Size of samples

1.4VCM/CS/SFFs的性能

凝固時(shí)間測定：采用維卡儀（上海金虞檢測儀器有限公司）測定試樣的凝固時(shí)間。維卡儀重針（350 g）自由并垂直下降，若試樣表面沒有明顯可見的印記，定義為終凝。

抑菌實(shí)驗(yàn)：制備VCM/CS/H2O、VCM/CS/2.1SFFs復(fù)合材料，每組4個(gè)重復(fù)樣。分別將2組樣品放入含有金黃色葡萄球菌的培養(yǎng)皿中，培養(yǎng)16 h后，測量其抑菌環(huán)的寬度。

藥物釋放實(shí)驗(yàn)：將復(fù)合材料制備成尺寸為Ф 4×3 mm的樣品，每組5個(gè)重復(fù)樣品。放入加有PBS緩沖液的離心管，將各離心管放置在37℃的恒溫振蕩箱（SHA-C，上海比朗儀器有限公司），100 r·min-1振蕩。 分別于 1 h，3 h，6 h，18 h，1 d，2 d，4 d和7 d將上層清液取出、抽濾、冷凍保存?zhèn)溆?，同時(shí)向離心管補(bǔ)充新鮮溶液，繼續(xù)振蕩。用紫外分光光度計(jì)測樣品在280 nm的吸光度。藥物釋放標(biāo)準(zhǔn)曲線方程A=0.004 34C+0.004 36，線性相關(guān)系數(shù)R2=0.998 9。式中，A為吸光度；C為溶液中萬古霉素的濃度 （μg·mL-1），公式表現(xiàn)出藥物的濃度與280 nm處的吸光度之間良好的線性關(guān)系。

抗水、降解實(shí)驗(yàn)：將復(fù)合材料制成Ф 4×3 mm的樣品，脫模后，立刻放入裝有定量PBS緩沖液的燒杯，置于 37 ℃的恒溫振蕩箱中（60 r·min-1），6 h 后取出，以復(fù)合材料的質(zhì)量損失率來定量考察復(fù)合材料的潰散性能[19]。降解實(shí)驗(yàn)：將制備的樣品干燥后放入37℃的PBS緩沖液中恒溫振蕩，4周后測量其質(zhì)量損失率。

復(fù)合材料力學(xué)性能測定：分別制備6組尺寸為Ф 10×15 mm的復(fù)合材料，每組5個(gè)平行樣品。常溫下干燥21 d，用砂紙將試件兩端打磨平整。置于萬能力學(xué)試驗(yàn)機(jī)（三思微機(jī)控制電子萬能試驗(yàn)機(jī)）進(jìn)行抗壓強(qiáng)度的測定，施加載荷速度為1 mm·min-1，記錄各樣品的抗壓強(qiáng)度。并計(jì)算每組試件的壓縮斷裂功。

復(fù)合材料生物相容性的測定：MTT比色法測定MC-3T3細(xì)胞在VCM/CS/H2O與VCM/CS/2.1SFFs復(fù)合材料上的增殖情況。

MC-3T3 用含有新生牛血清（15%，V/V）、100 IU·mL-1青霉素、100 IU·mL-1鏈霉素、DMEM 培養(yǎng)基的完全培養(yǎng)基，置于 37 ℃，CO2（5%，V/V）孵化箱進(jìn)行培養(yǎng)。用輻照劑量15 kGy滅菌Ф 4×3 mm的樣品片，置于96孔培養(yǎng)板，將細(xì)胞密度為2.5×105mL-1每孔200 μL細(xì)胞懸浮液種到96孔培養(yǎng)板材料上進(jìn)行培養(yǎng)，每2 d換一次培養(yǎng)液。培養(yǎng)2、4 d時(shí)，加入 MTT 20 μL，繼續(xù)培養(yǎng) 4 h，吸出，加入二甲基亞砜（DMSO），形成紫色溶液，每個(gè)樣品孔的 100 μL 溶液移入新的96孔板中，在450 nm測定其吸光度。每組樣品每個(gè)時(shí)間點(diǎn)檢測4個(gè)樣品。

第4 d用PBS漂洗2次，除去樣品表面未貼壁細(xì)胞，將樣品放入24孔板中，加4℃預(yù)冷的戊二醛（2.5%，V/V），4℃固定 2 h后吸出，用 PBS漂洗 2次，每次10 min，依次乙醇系列梯度 （30%、50%、70%、80%、90%、95%、100%，V/V）脫水， 每次 10 min，干燥、噴金后，在掃描電鏡下進(jìn)行觀察。

1.5 統(tǒng)計(jì)方法

數(shù)據(jù)經(jīng)過OriginPro8軟件處理，采用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示。 應(yīng)用 SPSS 19.0 進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，根據(jù)顯著性檢驗(yàn)方法得到的P值是統(tǒng)計(jì)學(xué)對數(shù)據(jù)差異性的評價(jià)，P值越小認(rèn)為數(shù)據(jù)間存在差異的可能性越大，一般以*表示P＜0.05，代表有顯著性差異。

2 結(jié)果與討論

2.1 SFFs形貌觀察

如圖2，絲素納米纖維的直徑約為15 nm，長度可達(dá)1.5 μm。當(dāng)絲素納米纖維溶液的濃度為2.1和0.21 mg·mL-1時(shí)，由于絲素納米纖維的濃度大，絲素纖維發(fā)生了團(tuán)聚現(xiàn)象（圖2（a，b）。當(dāng)絲素納米纖維溶液的濃度為0.07 mg·mL-1時(shí)，絲素納米纖維雖然也有團(tuán)聚現(xiàn)象，但是在邊緣可以觀察到不同長度絲素納米纖維的存在（圖2（c））。隨著絲素納米纖維濃度的降低，纖維具有更好的分散性，納米纖維的形貌逐漸變的清晰（圖 2（d，e））。

絲蛋白分子由疏水段和親水段組成，具有類似于嵌段共聚物的性質(zhì)，在水環(huán)境中難以長時(shí)間保持舒展?fàn)顟B(tài)，容易形成膠束，分子鏈末端大的親水區(qū)主要存在于膠束的外部，疏水區(qū)和部分小的親水區(qū)在膠束內(nèi)部。由于絲蛋白的等電點(diǎn)是4.2，中性條件下帶有負(fù)電荷，且?guī)ж?fù)電荷基團(tuán)主要分布在親水區(qū)。因此，形成的膠束表面帶有負(fù)電荷，負(fù)電荷的斥力使其能夠在溶液中保持相對穩(wěn)定[20]。在絲素緩慢濃縮過程中，絲蛋白聚集成為直徑0.1～2 μm的膠束，隨著濃縮時(shí)間延長，絲蛋白仍然維持膠束狀態(tài)，但膠束內(nèi)的絲蛋白已經(jīng)轉(zhuǎn)變成直徑在15～20 nm的納米纖維[21]。與此同時(shí)，由于膠束內(nèi)外均有負(fù)電荷存在，內(nèi)部負(fù)電荷斥力使得膠束處于亞穩(wěn)態(tài)，而外部電荷作用則起到穩(wěn)定作用，從而使得膠束受力平衡，在溶液中保持穩(wěn)定。溶液稀釋后，膠束外部電荷作用降低，而內(nèi)部電荷作用不變，力平衡打破，膠束不穩(wěn)定性提高，破裂，最終使得內(nèi)部的納米纖維釋放出來。同時(shí)形成的絲素納米纖維具有不溶于水，力學(xué)強(qiáng)度高等優(yōu)點(diǎn)[22]。

圖2 不同濃度絲素納米纖維的SEM照片,（a～e）的濃度分別為2.1,0.21,0.07,0.035,0.017 5 mg·mL-1Fig.2 SEM photographs of different concentrations of nanofibers （a～e）（2.1,0.21,0.07,0.035,0.017 5 mg·mL-1,respectively）

2.2 VCM/CS/SFFs形貌及微觀結(jié)構(gòu)觀察

CSD在127℃飽和蒸氣壓條件下脫水，形成晶體均一的 α-CS。 圖 3（a）為 CSD，可以看出，CSD 為片狀或板狀晶體。圖3（b）為制備得到的α-CS，其晶形為棒狀，這表明CSD已轉(zhuǎn)化為α-CS，晶體形貌發(fā)生了變化，從片狀或板狀晶體變成了棒狀晶體。

圖 3 （c）、3 （d）為 VCM/CS/H2O、VCM/CS/2.1SFFs復(fù)合材料的SEM照片。圖中可以看出，經(jīng)過水化、結(jié)晶、硬固3個(gè)階段后棒狀的α-CS又轉(zhuǎn)變成了片狀或板狀結(jié)構(gòu)，表明α-CS與水?dāng)嚢韫袒笠呀?jīng)轉(zhuǎn)變成 CSD。另外與 VCM/CS/H2O相比，VCM/CS/2.1SFFs固化材料晶體交聯(lián)在一起，可能和絲素上的羧基、氨基等基團(tuán)與硫酸鈣中的Ca2+的配位作用有關(guān)[23-24]。

圖 3（e，f）分別為 VCM/CS/H2O、VCM/CS/2.1SFFs復(fù)合材料的EDS電子能譜。從能譜和元素分析可以看出，絲素納米纖維SFFs的加入，使復(fù)合物中引入了氮元素，這表明硫酸鈣中混合有絲素納米纖維。

圖 3 SEM 形貌：（a）CSD,（b）α-CS,（c）VCM/CS/H2O,（d）VCM/CS/2.1SFFs,（e）VCM/CS/H2O EDS 和（f）VCM/CS/2.1SFFs EDSFig.3 SEM photographs of（a）CSD,（b）α-CS,（c）VCM/CS/H2O,（d）VCM/CS/2.1SFFs,（e）EDS of VCM/CS/H2O and（f）EDS of VCM/CS/2.1SFFs

2.3 VCM/CS/SFFs X射線衍射分析

從α-CS的標(biāo)準(zhǔn)X射線衍射圖得知（PDF No.41-0224），其主要特征峰位置為 14.72°、25.67°、29.69°、31.90°、49.36°。從圖 4（a）可以看出，制備的 α-CS 衍射峰圖符合標(biāo)準(zhǔn)圖，說明制備的產(chǎn)物為α-CS，這與SEM觀察結(jié)果一致。

圖 4（b，c）顯示了 VCM/CS/H2O、VCM/CS/2.1SFFs復(fù)合材料的X射線衍射圖。曲線都在2θ=11.6°，20.7°，23.4°，29.1°，31.1°，33.4°等處出現(xiàn)了 CaSO4·2H2O 的特征衍射峰（PDF No.74-1433），在 2θ=25.7°，31.2°處出現(xiàn)了CaSO4·1/2H2O的特征峰，這表明復(fù)合材料固化后CaSO4·1/2H2O大部分轉(zhuǎn)變?yōu)镃aSO4·2H2O，同時(shí)仍然殘留有少量的CaSO4·1/2H2O。曲線（b）出現(xiàn)衍射峰的位置與曲線（c）相同，這說明硫酸鈣中加入絲素納米纖維后，未影響硫酸鈣結(jié)晶的形成。

圖 4 （a）α-CS,（b）VCM/CS/H2O 和（c）VCM/CS/2.1SFFs的XRD圖Fig.4 XRD patterns of（a）α-hemihydrate calcium sulfate（b）VCM/CS/H2O and （c）VCM/CS/2.1SFFs

2.4 VCM/CS/SFFs凝固時(shí)間的測定

骨水泥的凝固時(shí)間與手術(shù)的操作有很大的關(guān)系，凝固時(shí)間太短使醫(yī)生來不及調(diào)和即凝固，時(shí)間太長使創(chuàng)口暴露時(shí)間過長而易引起再感染。實(shí)驗(yàn)測得的樣品凝固時(shí)間如圖5所示。在相同L/S的條件下隨著絲素納米纖維濃度的增加，復(fù)合材料的凝固時(shí)間逐漸縮短，說明絲素納米纖維的加入可以在一定程度上縮短材料的凝固時(shí)間，使凝固時(shí)間可調(diào)節(jié)。

圖5 復(fù)合材料的凝固時(shí)間Fig.5 Solidification time of the composite

2.5 VCM/CS/SFFs抑菌實(shí)驗(yàn)結(jié)果

檢測依據(jù)衛(wèi)生部《消毒技術(shù)規(guī)范》2002版，抑菌環(huán)寬度大于7 mm時(shí)，判為有抑菌作用。如圖6所示，VCM/CS/2.1SFFs 抑菌環(huán)寬度為（7.7±0.1）mm，VCM/CS/H2O 抑菌環(huán)寬度為（9.5±0.2）mm，均有抑菌效果。另外，絲素納米纖維的加入使得復(fù)合材料的抑菌環(huán)寬度變小，這可能是由于絲素納米纖維的加入使得復(fù)合材料潰散和降解降低，從而使得復(fù)合在復(fù)合材料中的藥物釋放緩慢[25]。這與材料的藥物釋放、抗水和降解結(jié)果一致。

圖 6 （a）VCM/CS/2.1SFFs抑菌環(huán);（b）VCM/CS/H2O 抑菌環(huán)Fig.6 Antibacterial test of（a）VCM/CS/2.1SFFs and （b）VCM/CS/H2O

2.6 VCM/CS/SFFs藥物釋放結(jié)果

半水硫酸鈣具有凝固過程發(fā)熱不明顯的優(yōu)點(diǎn)，因此在使用過程中比較容易和藥物及生長因子復(fù)合，方便臨床使用，但是突釋明顯是存在的一個(gè)弊端。因硫酸鈣具有孔隙結(jié)構(gòu)，藥物在硫酸鈣里的釋放一般通過2種方式，一種是藥物的溶解和擴(kuò)散，另一種方式是材料降解后藥物的釋放[26]。如圖7所示發(fā)現(xiàn)，所有樣品的萬古霉素在初期釋放迅速，這主要是由于復(fù)合材料表層萬古霉素的釋放。但是，VCM/CS/H2O 復(fù)合材料 6 h的釋放率為（35.8±1.6）%，VCM/CS/2.1SFFs復(fù)合材料6 h的釋放率為 （19.6±1.3）%。因此絲素納米纖維的加入，降低了復(fù)合材料中藥物的初期釋放速率。且研究發(fā)現(xiàn)，在一周的釋放周期內(nèi)，加入絲素納米纖維的復(fù)合材料中萬古霉素的釋放速率均隨時(shí)間而減慢，可能是因?yàn)閂CM/CS/H2O更易降解，使得復(fù)合材料中復(fù)合的藥物更易釋放。

圖7 含不同濃度纖維的復(fù)合材料的藥物釋放曲線Fig.7 Drug release test with different concentrations of nanofibers

2.7VCM/CS/SFFs的抗水性

骨水泥類骨修復(fù)材料在固化過程中易受到體液的侵蝕而發(fā)生潰散，因此研究材料的抗水性很必要[19]。如圖 8（a）所示，當(dāng) SFFs 的濃度為 0.07、0.21、2.1 mg·mL-1時(shí)復(fù)合材料的失重率降低，抗?jié)⑸⒛芰︼@著提高。

材料的降解速率太快會導(dǎo)致不能匹配新骨的生長，使力學(xué)支撐不足，降解太慢會影響新生骨組織的長入[27]。本工作前期研究了1個(gè)月內(nèi)材料改性后的降解性變化，圖8（b）為復(fù)合材料28 d的降解率，可見絲素納米纖維可以在一定程度上降低硫酸鈣的降解率。原因可能是絲素納米纖維使材料之間的結(jié)合增強(qiáng)，材料降解變慢。

圖8 （a）SFFs對抗水性能的影響（b）SFFs對降解性能的影響Fig.8 Effect of SFFs （a）on water resistance and （b）on degradation

2.8 VCM/CS/SFFs的力學(xué)性能

人體松質(zhì)骨的壓縮強(qiáng)度為1～15 MPa[28]，如圖9（a）所示，VCM/CS/H2O 復(fù)合材料的抗壓強(qiáng)度為（7.90±1.05）MPa，其滿足人松質(zhì)骨最低限要求。VCM/CS/0.0175SFFs復(fù)合材料的抗壓強(qiáng)度達(dá)到 （10.45±0.68）MPa。表明復(fù)合材料中加入絲素納米纖維，提高了復(fù)合材料的抗壓強(qiáng)度，隨著絲素納米纖維含量的增加，復(fù)合材料的抗壓強(qiáng)度表現(xiàn)出先增加后減小的趨勢。原因可能是當(dāng)絲素纖維溶液濃度較高時(shí)，絲素納米纖維發(fā)生了團(tuán)聚，會不均勻的分散到復(fù)合材料中，影響材料的力學(xué)性能。

圖9 試樣 （a）壓縮強(qiáng)度與 （b）壓縮斷裂功Fig.9 Compressive strength （a）and shrinkage（b）of samples

另一方面SFFs的加入使得Ca2+與絲素蛋白側(cè)鏈上的羧基、羥基、氨基發(fā)生配位作用[29]。當(dāng)固液兩相混合后，縮短復(fù)合材料凝固時(shí)間的同時(shí)，增強(qiáng)了硫酸鈣顆粒間的結(jié)合強(qiáng)度，從而進(jìn)一步提高復(fù)合材料的抗壓強(qiáng)度。

材料的斷裂韌性，即材料的斷裂能（材料荷載位移曲線下的面積），指其抵抗裂紋擴(kuò)展的能力[30-31]。從圖9（b）可以看出，在硫酸鈣材料中添加SFFs，顯著提高了復(fù)合材料的壓縮斷裂功。原因可能是由于復(fù)合材料有良好的應(yīng)力分散特性，當(dāng)外力作用到材料上時(shí)，應(yīng)力通過基體傳到絲素大分子，絲素分子會產(chǎn)生變形、發(fā)生滑移，使復(fù)合材料的應(yīng)變增加，最終使壓縮斷裂功增加[32]，表現(xiàn)為材料的韌性提高。

2.9 VCM/CS/SFFs的生物相容性

本研究分別觀察了成骨細(xì)胞MC3T3在空白材料VCM/CS/H2O和含有絲素纖維濃度較高的VCM/CS/2.1SFFs上的黏附和增殖情況。圖10可以看出，細(xì)胞在VCM/CS/H2O和VCM/CS/2.1SFFs復(fù)合材料上均黏附、鋪展，并伸出偽足。2種材料對MC3T3細(xì)胞顯示出良好的細(xì)胞相容性。

圖10 （a,b）分別為MC3T3在VCM/CS/H2O、VCM/CS/2.1SFFs材料上培養(yǎng)4 d后的SEM圖Fig.10 SEM images of MC3T3 cultured on VCM/CS/H2O （a）,VCM/CS/2.1SFFs （b）for 4 d

圖11 MC3T3細(xì)胞在復(fù)合材料上的MTT實(shí)驗(yàn)Fig.11 MTT assay of MC3T3 cultured in VCM/CS/H2O and VCM/CS/2.1SFFs

MTT試驗(yàn)常用來評價(jià)材料的細(xì)胞相容性[33]，是一種檢測細(xì)胞存活和生長的簡便方法。MTT比色法的原理：活細(xì)胞中琥珀酸脫氫酶能將四唑鹽還原成不溶于水的藍(lán)紫色產(chǎn)物甲瓚（formazan），并沉淀在細(xì)胞中，而死細(xì)胞沒有這種功能。二甲亞砜（DMSO）能溶解沉積在細(xì)胞中藍(lán)紫色結(jié)晶物，溶液顏色深淺與所含的甲瓚量成正比。OD值代表所測物質(zhì)的吸光度值，本實(shí)驗(yàn)用酶標(biāo)儀在450 nm下測定吸光度值，OD值越高，說明活細(xì)胞在材料上黏附和增殖越多。通過MTT法檢測實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)（如圖11），培養(yǎng)2 d時(shí)，MTT法測定的OD值無明顯差異。但到第4 d時(shí)，VCM/CS/H2O與VCM/CS/2.1SFFs組OD值升高，同時(shí)VCM/CS/2.1SFFs組高于VCM/CS/H2O組，差別具有顯著性差異。說明VCM/CS/2.1SFFs復(fù)合材料中絲素纖維成分可以促進(jìn)MC3T3細(xì)胞的生長，這與文獻(xiàn)中研究結(jié)果一致[31]。

3 結(jié) 論

本研究用水熱法制備了α-半水硫酸鈣，應(yīng)用自組裝的原理制備了絲素納米纖維，并進(jìn)一步以絲素納米纖維溶液為固化液將α-半水硫酸鈣、萬古霉素復(fù)合制備了VCM/CS/SFFs抗感染骨修復(fù)材料。復(fù)合材料降低了材料體外降解率、抑制了藥物初期的突釋；提高了材料的抗壓強(qiáng)度、韌性和抗水性；材料具有抑菌性，并能促進(jìn)MC3T3細(xì)胞的增殖和黏附。綜上所述，VCM/CS/SFFs復(fù)合材料改善了單純硫酸鈣材料的力學(xué)、藥物釋放及細(xì)胞相容性等性能，可以為非承力部位感染性骨缺損修復(fù)的臨床研究提供理論依據(jù)。

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