山杏體細(xì)胞胚胎發(fā)生及其組織學(xué)觀察

何炎紅，吳高殷，白玉娥，田 春

（1.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué) 林學(xué)院，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010020；2.內(nèi)蒙古自治區(qū)中醫(yī)醫(yī)院，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010010）

山杏Armeniaca sibirica是內(nèi)蒙古干旱、半干旱地區(qū)沙地及山地主要的鄉(xiāng)土樹種，具有較大的實(shí)用價值，包括食用價值、園林綠化和醫(yī)藥價值等[1]，其產(chǎn)業(yè)發(fā)展在本地區(qū)生態(tài)建設(shè)和經(jīng)濟(jì)建設(shè)中具有重要意義。而山杏的常規(guī)繁殖為播種和嫁接[2]，繁殖速率慢、周期長。近些年，隨著生物技術(shù)的發(fā)展及其在林業(yè)上的應(yīng)用，一些針葉闊葉樹種通過非常規(guī)繁育方法獲得了完整的再生植株，例如植物組織培養(yǎng)、體細(xì)胞胚胎發(fā)生和人工種子等。體細(xì)胞胚胎發(fā)生通過胚性愈傷組織的誘導(dǎo)、增殖和分化成熟后可得到數(shù)量多、大小一致的胚狀體。關(guān)于林木的體細(xì)胞胚胎發(fā)生研究也取得了一些成果，例如馬尾松、云杉和文冠果[3-6]。本文中研究了山杏莖尖體細(xì)胞胚胎發(fā)生發(fā)育的過程，并對影響山杏胚性愈傷組織誘導(dǎo)的因素進(jìn)行探討，旨在建立山杏體細(xì)胞胚胎發(fā)生體系，為后期的人工種子的制作、新品種遺傳改良、種資創(chuàng)新和縮短育苗周期提供技術(shù)和理論材料。

1 材料與方法

1.1 莖尖愈傷組織的誘導(dǎo)

以內(nèi)蒙古呼和浩特市內(nèi)蒙古良木繁育基地山杏種植區(qū)的山杏莖尖作為外植體。莖尖清洗消毒后，剝?nèi)〖s2 mm莖尖，并轉(zhuǎn)移到培養(yǎng)基。以MS為基本培養(yǎng)基，附加6-BA（0.5、1.0 mg/L），NAA（0.1、0.2、0.5 mg/L） 和 2,4-D（0.1、0.2、0.5 mg/L）。在(25±2) ℃、暗光下進(jìn)行培養(yǎng)。每隔7 d觀察愈傷組織的誘導(dǎo)及生長情況。

1.2 莖尖胚性愈傷的繼代與增殖

篩選出胚性愈傷組織進(jìn)行增殖培養(yǎng)，每組培養(yǎng)基中添加6-BA（0.5 mg/L）和2,4-D（0.2 mg/L），然后分別添加0.5 g/L水解乳蛋白，0.5 g/L水解酪蛋白和0.5 g/L肌醇3種附加物。在(25±2)℃、暗光下進(jìn)行培養(yǎng)。每隔7 d觀察愈傷組織的增殖率及生長情況。

1.3 莖尖胚性愈傷組織的細(xì)胞結(jié)構(gòu)觀察

材料取自莖尖誘導(dǎo)出的愈傷組織，從誘導(dǎo)期直至胚性愈傷分化，每隔7 d定期取樣。將愈傷組織樣品放入FAA固定液中固定24 h以上，采用石蠟法制作切片，用Leica光學(xué)顯微鏡觀察切片。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同激素配比對山杏莖尖愈傷組織誘導(dǎo)的影響

剝?nèi)〉那o尖在6-BA與NAA和6-BA與2,4-D的處理組合下誘導(dǎo)愈傷組織，其愈傷組織誘導(dǎo)率及生長情況見表1。6-BA與2,4-D的組合中，隨著分裂素增加，愈傷組織分裂速率加快，且愈傷組織的數(shù)量較多，6-BA 0.5 mg/L+2,4-D 0.2 mg/L組合時，誘導(dǎo)率高達(dá)88.0%，四周愈傷呈白色顆粒狀，但生長后期褐化嚴(yán)重，需要及時更換培養(yǎng)基進(jìn)行繼代增殖培養(yǎng)；當(dāng)6-BA質(zhì)量濃度為1.0 mg/L時，增加NAA質(zhì)量濃度，愈傷組織誘導(dǎo)率呈下降趨勢；當(dāng)6-BA質(zhì)量濃度為0.5 mg/L、NAA質(zhì)量濃度為0.2 mg/L時，莖尖愈傷組織誘導(dǎo)率高達(dá)100%，愈傷組織的數(shù)量較多呈白色透明小顆粒（見圖1）。所以選取MS+6-BA（0.5 mg/L）+NAA（0.2 mg/L）為最佳莖尖愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基。

表1 不同激素配比對莖尖愈傷組織誘導(dǎo)的影響Table1 Effects of different hormone combinations on callus induction from stem tips

圖1 莖尖愈傷組織的誘導(dǎo)Fig.1 Callus induction from stem tips

2.2 不同附加物對山杏胚性愈傷組織增殖的影響

不同附加物對山杏胚性愈傷組織增殖的影響見表2。由表2可知，附加物水解乳蛋白、水解酪蛋白和肌醇處理的愈傷增殖率均超過80%，在添加水解酪蛋白的培養(yǎng)基中增殖率最高，達(dá)92.2%，且愈傷增殖量也較多，隨著培養(yǎng)時間增加，在外植體自身代謝產(chǎn)物和培養(yǎng)基不斷減少的因素制約下，部分愈傷組織不增殖或者褐化死亡（見圖2）。對增殖率進(jìn)行方差分析，結(jié)果見表3。由表3可看出，不同附加物對愈傷組織增殖的影響間差異不顯著。

2.3 山杏體細(xì)胞胚胎發(fā)生形態(tài)學(xué)觀察

在對山杏莖尖胚性愈傷組織進(jìn)行增殖和分化誘導(dǎo)期間，定期取樣，放進(jìn)FAA固定液中固定24 h，進(jìn)行石蠟切片觀察（見圖3）。由圖3可以看出，在山杏體細(xì)胞胚胎發(fā)生過程中能明顯看出球形胚、心形胚、魚雷胚、子葉胚等階段。

表2 不同附加物對胚性愈傷組織增殖的影響Table2 Effects of different additives on embryonic callus proliferation

圖2 胚性愈傷組織的增殖Fig.2 Embryonic callus proliferation

表3 不同附加物對胚性愈傷組織增殖影響的方差分析?Table3 Variance analysis of effects of different additives on embryonic callus proliferation

圖3 山杏體細(xì)胞胚胎發(fā)生組織學(xué)觀察Fig.3 Histological observation of somatic embryogenesis processes in A. sibirica

3 結(jié)論與討論

在激素6-BA質(zhì)量濃度為0.5 mg/L、NAA質(zhì)量濃度為0.2 mg/L時，山杏莖尖愈傷組織誘導(dǎo)率高達(dá)100%，從中篩選胚性愈傷組織進(jìn)行增殖培養(yǎng)。在胚性愈傷組織增殖培養(yǎng)基中添加附加物水解乳蛋白、水解酪蛋白和肌醇，添加水解酪蛋白處理的愈傷增殖率最高，為92.2%。在山杏體細(xì)胞胚胎發(fā)生過程中能明顯看出球形胚、心形胚、魚雷胚、子葉胚等階段。其體細(xì)胞胚胎發(fā)生機(jī)理還需在分子水平深入探討。

在山杏組織培養(yǎng)過程中，以6-BA和IBA為激素組合的研究報道較為常見，且在愈傷組織誘導(dǎo)初期6-BA的適宜濃度相對較高[7]，這一論點(diǎn)與本文的結(jié)果一致。本研究中，在山杏莖尖胚性愈傷誘導(dǎo)和增殖過程中均添加了激素2,4-D，在胚性愈傷組織分化的過程中，愈傷分化率極低且分化苗長勢較弱[8-10]，這與朱華國等[11]對棉花體細(xì)胞胚胎發(fā)生的研究結(jié)果基本一致，即2,4-D能夠使細(xì)胞快速完成脫分化過程，使得愈傷快速增殖并產(chǎn)生大量細(xì)胞質(zhì)豐富的細(xì)胞，但同時由于其效應(yīng)過強(qiáng)，僅有少量前胚性細(xì)胞團(tuán)能夠從大量的細(xì)胞質(zhì)豐富的細(xì)胞轉(zhuǎn)化過來，限制了前胚性細(xì)胞團(tuán)的產(chǎn)生，從而進(jìn)一步限制了胚性愈傷向體細(xì)胞胚的轉(zhuǎn)化，出現(xiàn)了細(xì)胞質(zhì)豐富的細(xì)胞多但分化率低的現(xiàn)象。Aung Htay Naing等[12]在對Chrysanthemum cv. Euro體細(xì)胞胚的研究中指出在同時使用細(xì)胞分裂素（BA、TDZ和KN）和2,4-D的情況下可以誘導(dǎo)體細(xì)胞胚發(fā)生，但僅使用2,4-D時體細(xì)胞胚不發(fā)生。研究認(rèn)為體細(xì)胞胚不發(fā)生與前期培養(yǎng)中長期使用2,4-D有關(guān)[8-9]，因此為了促進(jìn)胚性愈傷組織發(fā)生，在培養(yǎng)中應(yīng)降低2,4-D濃度或者不使用2,4-D。

[1] 周長東.山杏的利用價值及其豐產(chǎn)栽培技術(shù)[J].經(jīng)濟(jì)林研究,2004, 22(2):84-86.

[2] 董勝君,劉明國,戴 菲.山杏嫩枝扦插繁殖試驗[J].經(jīng)濟(jì)林研究,2013,31(1):176-180.

[3] 楊模華,張冬林,李志輝,等.馬尾松幼胚體細(xì)胞胚胎發(fā)生研究[J].植物生理學(xué)報,2011,47(9):904-912.

[4] 李青粉.川西云杉早期體細(xì)胞胚胎發(fā)生機(jī)理研究[D].北京:中國林業(yè)科學(xué)研究院,2014.

[5] 史 昆,楊模華,李志輝,等.馬尾松胚性細(xì)胞懸浮增殖培養(yǎng)體系的建立[J].中南林業(yè)科技大學(xué)學(xué)報,2014,34(1):64-68.

[6] 李 晶,王承義,舒 鈺,等.文冠果體細(xì)胞胚胎發(fā)生體系建立[J].北方園藝,2010(11):140-143.

[7] 劉小蕾,劉艷萌,張學(xué)英,等.西伯利亞杏的組織培養(yǎng)[J].植物生理學(xué)通訊,2008,44(3):524.

[8] 張建偉,王軍輝,馬建偉.粗枝云杉胚性愈傷組織增殖后期的體細(xì)胞胚發(fā)生方式轉(zhuǎn)變[J].植物生理學(xué)報,2014,50(2):197-202.

[9] 張建偉.粗枝云杉體胚發(fā)生和萌發(fā)前的干化調(diào)控機(jī)制[D].北京:中國林業(yè)科學(xué)研究院,2014.

[10] 張文泉,王定江.珍稀瀕危植物異形玉葉金花組織培養(yǎng)初步研究[J].中南林業(yè)科技大學(xué)學(xué)報,2016,36(10):12-15,47.

[11] 朱華國,張獻(xiàn)龍,金雙俠,等.兩種常用激素組合下棉花體細(xì)胞胚胎發(fā)生過程的組織學(xué)觀察[J].棉花學(xué)報,2012,24(2):159-166.

[12] Aung Htay Naing, Chang Kil Kim, Baek Ji Yun, et al. Primary and secondary somatic embryogenesis in Chrysanthemum cv Eruo [J]. Plant Cell TIss Organ, 2013, 112:361-368.