肝細胞生長因子對人Tenon’s囊成纖維細胞低密度脂蛋白受體表達的影響*

冷云霞， 黃文志， 張 柳， 黃雄飛， 高宗銀

(廣州市第一人民醫(yī)院，華南理工大學附屬第二醫(yī)院， 廣東 廣州 510180)

肝細胞生長因子對人Tenon’s囊成纖維細胞低密度脂蛋白受體表達的影響*

冷云霞， 黃文志， 張 柳， 黃雄飛， 高宗銀△

(廣州市第一人民醫(yī)院，華南理工大學附屬第二醫(yī)院， 廣東 廣州 510180)

目的探討人Tenon’s囊成纖維細胞(HTFs)在肝細胞生長因子(HGF)刺激下，其低密度脂蛋白受體(LDLr)表達的動態(tài)變化。方法分別以0、10、20、40、80和160 μg/L的HGF刺激人Tenon’s囊成纖維細胞12、24和48 h；應用MTT法檢測HTFs的增殖率；real-time PCR定量分析不同增殖狀態(tài)的HTFs上LDLr mRNA的表達水平;Western blot 法檢測不同增殖狀態(tài)HTFs上LDLr蛋白表達水平的變化。結果HTFs上LDLr mRNA及蛋白的表達水平均與HTFs的增殖率呈正相關，HGF以時間和濃度依賴的方式促進HTFs的增殖，同時以時間和濃度依賴的方式促進LDLr的表達(P<0.05)。結論在HGF刺激下，增殖活躍的HTFs上LDLr呈高表達狀態(tài)，提示增殖異常活躍的HTFs上高表達的LDLr，可能成為一種新型的抗代謝藥物作用靶點,尤其是在抗青光眼術后濾過泡瘢痕化的研究中可能得到廣泛應用。

低密度脂蛋白受體； 肝細胞生長因子； 人Tenon’s囊成纖維細胞

青光眼是位列全球第二的不可逆性致盲眼病[1]，目前，濾過性手術仍是青光眼治療的主要手段之一。隨著現(xiàn)代眼科顯微手術的發(fā)展和抗代謝藥物的應用，青光眼濾過性手術的成功率已大大提高，一般情況下可達70%～90%。但是,在難治性青光眼濾過性手術中，由于手術后結膜成纖維細胞過度增殖導致的手術失敗率仍然高達49%～89%[2]。目前臨床上為提高青光眼手術成功率，術中多使用抗代謝藥物，但所有的抗代謝藥物由于其作用對象的非選擇性和給藥方式的不精確性，對異常增殖細胞和正常細胞具有同樣的抑制和殺傷作用，容易造成多種嚴重的并發(fā)癥。因此如何合理使用抗代謝藥物實現(xiàn)對結膜囊成纖維細胞的異常增殖過程進行調控，是青光眼手術成功的關鍵。近年來，有研究指出低密度脂蛋白受體(low-density lipoprotein receptor，LDLr)水平在異常增殖狀態(tài)的細胞中會出現(xiàn)高表達[3]，同時此類細胞低密度脂蛋白(low-density lipoprotein,LDL)代謝明顯增加。且有相關研究證實將含有抗癌藥物并保留LDL活性的LDL-藥物復合物用于腫瘤的治療，能更好地靶向性殺滅腫瘤細胞。因此，可推測LDLr是一種潛在的靶向性分子靶點，可結合抗代謝藥物應用于高表達LDLr的異常增生組織細胞的生長調控。本研究旨在探討肝細胞生長因子(hepatocyte growth factor,HGF)刺激下人Tenon’s囊成纖維細胞(human Tenon’s capsule fibroblasts,HTFs)LDLr表達的動態(tài)變化,以期下一步利用LDL的生物靶向功能結合抗代謝藥物應用于青光眼濾過性手術后濾過區(qū)，使抗代謝性藥物與增殖活躍的細胞靶向性高度結合，從而達到提高抗代謝藥物的生物利用度、降低其對正常細胞組織毒副作用的目的。

材 料 和 方 法

1 主要試劑

人Tenon’s囊成纖維細胞系(受贈于中山大學中山眼科中心國家重點實驗室)；DMEM 培養(yǎng)液(Gibco)；HGF (R&D)；低密度脂蛋白(Sigma)；山羊抗大鼠LDLr多克隆抗體和HRP標記抗山羊IgG(Santa Cruz)； cDNA合成試劑盒(Promega)；LDLr引物和SYBR PrimeScriptTMPCR 試劑盒(TaKaRa)。

2 細胞培養(yǎng)

以含10% 小牛血清的DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)HTFs，待細胞生長至融合狀態(tài)時消化細胞，以每孔200 μL (6×106/L)植入96孔板,培養(yǎng)24 h后細胞生長良好,更換含低濃度小牛血清的DMEM培養(yǎng)液再培養(yǎng)48 h,隨機分為5個實驗組和1個陰性對照(negative control)組，每組均為6個樣本。實驗組96孔板中分別加入含200 mg/L LDL及10、20、40、80和160 μg/L HGF的DMEM 培養(yǎng)液200 μL；陰性對照組加入僅含200 mg/L LDL 的DMEM 培養(yǎng)液200 μL。分別繼續(xù)培養(yǎng)12、24和48 h后，行MTT實驗檢測HTFs的增殖活躍性。以1×107/L的細胞密度將3 mL細胞培養(yǎng)液加入100 mL細胞培養(yǎng)瓶,按以上分組及培養(yǎng)條件分別培養(yǎng)12、24和48 h后，提取細胞總RNA，行real-time PCR檢測LDLr的mRNA 表達情況。

3 MTT法分析人Tenon’s囊成纖維細胞增殖率

分別將96孔板細胞培養(yǎng)24、48和72 h，于作用結束前4 h加入MTT，每孔20 μL，置37 ℃、5% CO2細胞培養(yǎng)箱中孵育4 h；棄上清，每孔加入DMSO 150 μL，置于微型混合器上振蕩20 min，倒置顯微鏡下觀察到顆粒染料結晶溶解。使用酶標儀在波長490 nm處讀取吸光度(A)，重復3次取均值。

4 Real-time PCR 檢測

經(jīng)常規(guī)TRIzol法抽提待測細胞內(nèi)總RNA,并逆轉錄為cDNA,以GAPDH為內(nèi)參照,同時進行PCR 擴增。LDLr的上游引物為5’-GCAACAGATGAAGACCCTAT-3’，下游引物為5’-AACAGTAACACGGCGATT-3’； GAPDH的上游引物為5’-AACTCTGGTAAAGTGGATATTG-3’，下游引物為5’-GGTGGAATCATATTGGAACA-3’。PCR 反應條件： 95 ℃ 3 min; 95 ℃ 5 s， 55 ℃ 15 s， 72 ℃ 30 s，共30個循環(huán)。采用2-ΔΔCt分析法計算并分析mRNA的相對表達量。

5 Western blot 檢測

采用Western blot 法測定HTFs上LDLr的蛋白表達情況。分別于細胞培養(yǎng)12、24和48 h后收集細胞并轉移到EP管中，加入裂解液200 μL，冰上裂解30 min；以BCA法根據(jù)試劑盒說明書進行蛋白濃度測量。按照常規(guī)方法進行Westem blot實驗。以β-actin為內(nèi)參照，用凝膠成像分析系統(tǒng)軟件掃描并分析結果。

6 統(tǒng)計學處理

應用SPSS 15.0軟件分析。所有數(shù)據(jù)均采用均數(shù)±標準差(mean±SD)表示，多組間比較采用單因素方差檢驗，組間差異采用配對t檢驗分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結 果

1 HGF刺激HTFs增殖

HGF刺激下的HTFs增殖效應顯示,分別在12、24和48 h時，相對于空白對照組，80和160 μg/L HGF均可顯著刺激結膜囊成纖維細胞的增殖(P<0.01),且其最高增殖率峰值約為197%，出現(xiàn)在HGF刺激濃度為80 μg/L、刺激時間為48 h時。不同濃度HGF刺激下，24 h的增殖率明顯高于12 h的增殖率(P<0.05),此外，只有刺激濃度為40、80和 160 μg/L時,48 h的增殖率與24 h的有顯著差異(P<0.01)。因此，HGF刺激濃度為20～80 μg/L時，HTFs的增殖呈現(xiàn)濃度依賴性和時間依賴性，見圖1。

Figure 1. HGF promoted proliferation of HTFs in a time- and concentration-dependent manner. Mean±SD．n=6．**P<0.01vs12 h;##P<0.01vs24 h;△△P<0.01vs0 μg/L.

圖1HGF以時間和濃度依賴的方式促進HTFs的增殖

2 HGF刺激后HTFs上LDLr mRNA表達的變化

Real-time PCR結果表明，HTFs上LDLr mRNA的表達呈HGF濃度和時間依賴性，其中對照組僅表達少量LDLr mRNA；隨著HGF濃度升高，HTFs上LDLr mRNA 的表達水平顯著提高(P<0.01)，且其LDLr mRNA最高表達量為0.481±0.019，出現(xiàn)在HGF刺激濃度為80 μg/L、刺激時間為48 h時，見圖2。

Figure 2. HGF promoted the expression of LDLr mRNA on HTFs in a time- and concentration-dependent manner． Mean±SD．n=6．**P<0.01vs12 h;##P<0.01vs24 h;△△P<0.01vs0 μg/L.

圖2HGF以時間和濃度依賴的方式促進HTFs上LDLrmRNA的表達

3 HGF對HTFs上LDLr蛋白表達的影響

Western blot結果發(fā)現(xiàn)HGF處理HTFs后,LDLr蛋白水平的上調呈濃度和時間依賴性。與細胞增殖率及mRNA表達水平非常相似，三者峰值都出現(xiàn)在HGF刺激濃度為80 μg/L、刺激時間為48 h時，隨后出現(xiàn)下降趨勢。在其峰值處，蛋白水平相對于對照組上調了8倍左右，比相應的24 h有顯著差異 (P<0.01)，見圖3。

討 論

青光眼濾過性手術后濾過區(qū)創(chuàng)傷修復過程包括了：成纖維細胞的增殖移行、新生血管的形成及膠原的合成等關鍵環(huán)節(jié)。而增殖最為活躍的就是HTFs和血管內(nèi)皮細胞，這2種細胞在濾過區(qū)的過度增生則會導致濾過泡的疤痕化，最終導致濾過手術的失敗[4-7]。近年來相關文獻報道提示，增殖活躍的成纖維細胞和血管內(nèi)皮細胞中LDLr呈高表達，且在細胞增殖活躍期LDL攝取量增加。

Figure 3. HGF up-regulated the LDLr protein expression on HTFs. Western blot showed that HGF promoted the expression of LDLr protein on HTFs in a time- and concentration-dependent manner． Mean±SD．n=3.**P<0.01vs12 h;##P<0.01vs24 h;△△P<0.01vs0 μg/L.

圖3HGF上調HTFs的LDLr蛋白的表達

HGF 是由間皮來源細胞產(chǎn)生的生長因子，可促進和刺激多種來源細胞的分化和增殖。有研究證實腎臟組織中的成纖維細胞、單核巨噬細胞及血管內(nèi)皮細胞均可表達HGF受體。上調HGF的濃度能有效促進以上多種細胞的增殖。另有研究表明HGF與脂質代謝也密切相關，文獻報道HGF 可上調肝細胞脂質的合成，增加血清LDL 及VLDL的水平；此外對內(nèi)皮細胞的研究中，也發(fā)現(xiàn)HGF的表達水平與血清LDL水平呈相關性[8-11]。因此我們嘗試將HGF用于刺激HTFs的增殖過程，并觀察檢測其在此過程中HTFs上LDLr的表達情況。

本研究結果提示LDLr的表達和HTFs的增殖率呈現(xiàn)正相關。以不同濃度的HGF刺激后，增殖活躍的HTFs上LDLr的表達顯著上調。在濃度為80 μg/L 的HGF刺激48 h后，LDLr mRNA轉錄水平達到峰值，上升了1.77倍，蛋白水平表達上升了1.52倍。由此，我們推測LDLr表達的增加為異常增殖的HTFs細胞膜的合成提供了充足的膽固醇，也提示我們異常增殖的HTFs上都有更多的LDLr表達。

濾過泡瘢痕化是青光眼濾過性手術失敗的關鍵因素，由于目前臨床青光眼術中使用的抗代謝藥物的無選擇性殺傷作用，使其在提高手術成功率的同時也大大增加了無血管薄壁濾過泡、濾過泡滲漏、低眼壓、白內(nèi)障、嚴重的視力損害、濾過泡感染和眼內(nèi)炎等嚴重并發(fā)癥的發(fā)生率[12-14]。因此提高抗代謝藥物對異常增殖細胞的準確殺傷性，降低其對周圍正常組織細胞的毒副作用顯得尤為重要。

本研究結果發(fā)現(xiàn)，LDLr高表達可促進術后HTFs的異常增殖，這提示LDLr可能為抗代謝藥物的給藥途徑提供新的作用靶點。我們可嘗試將LDL與抗代謝藥物相結合，通過LDL-LDLr途徑使抗代謝藥物靶向性作用于高表達LDLr的異常增殖HTFs細胞，從而保護低表達LDLr的正常組織及細胞。達到使抗代謝藥物既能有效防止濾過泡瘢痕化，又能減輕其毒副作用的目的。

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Expression of low-density lipoprotein receptor after exposure to hepatocyte growth factor in human Tenon’s capsule fibroblasts

LENG Yun-xia, HUANG Wen-zhi, ZHANG Liu, HUANG Xiong-fei, GAO Zong-yin

(GuangzhouFirstPeople’sHospital,TheSecondAffiliatedHospitalofSouthChinaUniversityofTechnology,Guangzhou510180,China.E-mail:leng0829@126.com)

AIM: To study the dynamic alteration of low-density lipoprotein receptor (LDLr) expression after exposure to hepatocyte growth factor (HGF) in human Tenon’s capsule fibroblasts (HTFs).METHODSHTFs were stimulated with HGF at different concentrations (0, 10, 20, 40, 80 and 160 μg/L) for 12, 24, and 48 h. The viability of HTFs was analyzed by MTT assay. The expression of LDLr at mRNA and protein levels were analyzed by real-time PCR and Western blot.RESULTSThe expression of LDLr at mRNA and protein levels was positively correlated with the viability of HTFs. HGF promoted the viability of HTFs in a time- and concentration-dependent manner. At the same time, HGF promoted the expression of LDLr in the same manner.CONCLUSIONExposure of HTFs to HGF induces LDLr expression at high level, suggesting that over-expression of LDLr on the HTFs may be a target receptor for controlled drug delivery, particularly in anti-scarring therapy after glaucoma filtration surgery.

Low-density lipoprotein receptor; Hepatocyte growth factor; Human Tenon’s capsule fibroblasts

1000- 4718(2017)12- 2264- 05

2017- 05- 12

2017- 08- 04

廣州市科技局基金資助項目(No．11C33150706)；廣東省自然科學基金博士啟動項目(No．S2013040012562)

△通訊作者 Tel: 020-81048225; E-mail: leng0829@126.com

R329.21; R775

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2017.12.024

(責任編輯： 盧 萍， 羅 森)