Erk1/2失活對(duì)FGF21調(diào)節(jié)糖脂代謝調(diào)控的影響*

吳朝明， 鄭巨佳， 潘瑩瑩， 葉艷娜， 潘薛波， 林灼鋒, 3△

(溫州醫(yī)科大學(xué) 1附屬第二醫(yī)院， 2藥學(xué)院， 浙江 溫州 325035； 3暨南大學(xué)附屬第一醫(yī)院， 廣東 廣州 510630)

Erk1/2失活對(duì)FGF21調(diào)節(jié)糖脂代謝調(diào)控的影響*

吳朝明1， 鄭巨佳2， 潘瑩瑩2， 葉艷娜2， 潘薛波2， 林灼鋒2, 3△

(溫州醫(yī)科大學(xué)1附屬第二醫(yī)院，2藥學(xué)院， 浙江 溫州 325035；3暨南大學(xué)附屬第一醫(yī)院， 廣東 廣州 510630)

目的探索細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶1/2(Erk1/2)失活對(duì)成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子21(FGF21)調(diào)節(jié)機(jī)體血糖平穩(wěn)及改善異常血脂的影響。方法選取8～10周齡雄性db/db小鼠，給予Erk1/2激酶抑制劑U0126(抑制Erk1/2磷酸化，使之失活)處理1周后，再分別給予重組人FGF21蛋白和腺病毒攜帶的FGF21(Ad-FGF21)處理，觀察120 min內(nèi)及4周后小鼠血糖、血脂及其相關(guān)調(diào)控基因的變化；同時(shí)，從體外細(xì)胞培養(yǎng)方面探索其分子機(jī)制。結(jié)果給予db/db小鼠重組人FGF21蛋白處理120 min能顯著下調(diào)血糖和甘油三酯水平，但這與U0126處理與否無(wú)關(guān)。給予Ad-FGF21處理4周能顯著改善db/db小鼠異常血糖水平及葡萄糖和胰島素耐受能力，降低機(jī)體脂肪含量，并改善異常血清甘油三酯水平，然而，這些變化仍與U0126處理與否無(wú)關(guān)。此外，在細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的分子機(jī)制方面，Ad-FGF21處理能顯著上調(diào)皮下脂肪組織Erk1/2磷酸化活性及過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體γ(PPARγ)的表達(dá)水平，同時(shí)上調(diào)機(jī)體脂聯(lián)素(adiponectin)mRNA及蛋白的表達(dá)水平(P<0.05)，但與U0126處理與否無(wú)關(guān)。在體外實(shí)驗(yàn)方面，F(xiàn)GF21處理能顯著激活Erk1/2磷酸化，并上調(diào)PPARγ和adiponectin的表達(dá)水平；然而，給予U0126處理并不能抑制PPARγ和adiponectin的表達(dá)。結(jié)論FGF21具有調(diào)節(jié)機(jī)體血糖平穩(wěn)及改善異常血脂的生物學(xué)功能，但Erk1/2失活可能不影響FGF21調(diào)節(jié)血糖血脂的功能。

成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子21； 細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶1/2； 胰島素增敏效應(yīng)； 糖脂代謝紊亂

糖尿病是常見(jiàn)的代謝性疾病，其發(fā)病機(jī)制與機(jī)體糖脂代謝紊亂和對(duì)胰島素的敏感性下降有關(guān)。成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子21(fibroblast growth factor 21，F(xiàn)GF21)是一種新型的糖脂代謝調(diào)控內(nèi)分泌因子。我們前期的研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)GF21能夠由脂聯(lián)素(adiponectin)介導(dǎo)對(duì)胰島素起到增敏的作用，從而調(diào)節(jié)小鼠血糖水平[1]。然而，F(xiàn)GF21通過(guò)何種信號(hào)途徑發(fā)揮其降糖降脂作用仍不清楚。細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶 1/2(extracellular signal-regulated kinase 1/2，Erk1/2)和絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)通路參與廣泛的生理過(guò)程。相關(guān)研究證明，F(xiàn)GF21能夠通過(guò)增加Erk1/2磷酸化，降低肝臟HepG2細(xì)胞載脂蛋白的表達(dá)[2]，增加巨噬細(xì)胞源性泡沫細(xì)胞THP-1膽固醇外流[3]，刺激下丘腦神經(jīng)元表達(dá)促腎上腺皮質(zhì)激素釋放素，從而維持血糖穩(wěn)態(tài)[4]，預(yù)防由高血脂或糖尿病引起的心肌細(xì)胞凋亡[5]。由此可知，Erk1/2 MAPK信號(hào)通路對(duì)FGF21生理作用的發(fā)揮起著重要的作用。我們的前期研究表明，F(xiàn)GF21通過(guò)過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體γ(peroxisome proliferator-activated receptor γ，PPARγ)信號(hào)通路，上調(diào)脂聯(lián)素的表達(dá)和分泌。然而在這條通路里面，F(xiàn)GF21通過(guò)何種途徑刺激PPARγ并進(jìn)一步傳遞信號(hào)的過(guò)程仍不清楚。本研究通過(guò)急性實(shí)驗(yàn)和慢性實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，在血脂代謝紊亂的db/db肥胖小鼠中，F(xiàn)GF21的降糖和降脂作用是否與Erk1/2 MAPK信號(hào)通路有關(guān)。

材 料 和 方 法

1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

8～10周齡SPF 級(jí)db/db小鼠購(gòu)自南方模式動(dòng)物中心，體重(30.0±2.3) g，許可證號(hào)： SCXK(滬)2012-0002。飼養(yǎng)環(huán)境為室溫20～24 ℃, 相對(duì)濕度40%～60%，基礎(chǔ)飼料由溫州醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，自由攝食飲水，12 h/12 h交替照明。

2 主要試劑

人重組FGF21蛋白、U0126(Erk1/2激酶抑制劑，抑制Erk1/2磷酸化，使之失活)和HE染色相關(guān)試劑購(gòu)自Sigma-Aldrich；限制性?xún)?nèi)切酶XbaI和BglII及T4 DNA連接酶購(gòu)自NEB；pAd-Track-CMV-GFP、Lipofectamine 2000、Trizol、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和OneStep RT-PCR試劑盒購(gòu)自Thermo Fisher Scienti-fic；DMEM液體培養(yǎng)基和胎牛血清購(gòu)自Gibco；抗鼠Erk1/2、p-Erk1/2、PPARγ、脂聯(lián)素和F4/80多克隆抗體購(gòu)自Cell Signaling Technology；FGF21、脂聯(lián)素和胰島素試劑盒購(gòu)自AIS；甘油三酯(triglyceride，TG)檢測(cè)試劑盒購(gòu)自北京百奧萊博科技有限公司；血糖儀及血樣試紙采用羅氏公司產(chǎn)品；其它生化試劑均為進(jìn)口分裝或國(guó)產(chǎn)分析純。所用引物由Thermo Fisher Scientific根據(jù)設(shè)計(jì)合成，見(jiàn)表1。

表1 引物序列

F: forward; R: reverse.

3 主要方法

3.1小鼠分組及處理 急性實(shí)驗(yàn)：取12只10周齡的雄性db/db小鼠，隨機(jī)分成實(shí)驗(yàn)組(FGF2組)和對(duì)照組(control組)，每組6只，分別經(jīng)尾靜脈注射0.5 mg/kg的FGF21和等量的PBS，檢測(cè)0、60和120 min時(shí)小鼠血糖、TG和胰島素水平。另取12只10周齡雄性db/db小鼠，以10 mg·kg-1·d-1劑量的 U0126處理1周以后，分為U0126+FGF21和U0126兩組，每組6只，經(jīng)尾靜脈注射FGF21(0.5 mg/kg)和等量的PBS，檢測(cè)0、60和120 min時(shí)小鼠血糖、TG和胰島素水平。

慢性實(shí)驗(yàn)：取8周齡的db/db雄性小鼠24只，隨機(jī)分成control組、Ad-FGF21組、U0126組和U0126+Ad-FGF21組4組， 給予正常飲食喂養(yǎng)。其中U0126和U0126+Ad-FGF21組給予腹腔注射U0126(10 mg·kg-1·d-1)；與此同時(shí)，U0126+Ad-FGF21組小鼠通過(guò)皮下腹腔注射FGF21重組表達(dá)腺病毒(1×108pfu/kg)處理，每2周1次；U0126組注射同等劑量的對(duì)照病毒并給予DMSO；Ad-FGF21組小鼠通過(guò)皮下腹腔注射FGF21重組表達(dá)腺病毒(1×108pfu/kg，每2周1次)并給予DMSO；control組注射同等劑量的對(duì)照病毒并給予DMSO(正常對(duì)照組)。處理4周以后，處死小鼠，收集器官組織，稱(chēng)重，一部分固定于OCT組織包埋液中，制作冰凍切片，一部分置于-80 ℃冰箱中保存。

3.2葡萄糖耐受試驗(yàn) 實(shí)驗(yàn)前一晚用滅菌PBS配制250 g/L的葡萄糖溶液，各組小鼠禁食過(guò)夜16 h，第2天稱(chēng)量小鼠體重，用尾部取血的方法測(cè)空腹血糖值；按2 g/kg 的劑量腹腔注射葡萄糖，分別檢測(cè) 0、15、30、60和90 min時(shí)的血糖值。

3.3胰島素耐受試驗(yàn) 實(shí)驗(yàn)前稱(chēng)量小鼠體重并置于新籠，新鮮配制胰島素溶液，按1 mU/kg的劑量腹腔注射胰島素，測(cè)定0、20、40、60和80 min的血糖值。

3.4FGF21重組表達(dá)腺病毒的構(gòu)建包裝 由于重組人FGF21蛋白在體外的半衰期非常短，因此，我們采用體外重組腺病毒表達(dá)的模式，進(jìn)行動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究。即克隆人源的FGF21基因至質(zhì)粒pUC-19上，將經(jīng)雙酶切(XbaI和BglII)的FGF21基因序列插入到穿梭質(zhì)粒pAd-Track-CMV-GFP中，構(gòu)建成pAd-Track-FGF21質(zhì)粒，并送公司測(cè)序鑒定有無(wú)基因突變。經(jīng)過(guò)測(cè)序檢測(cè)無(wú)突變的pAd-Track-FGF21質(zhì)粒線性化后，轉(zhuǎn)入含腺病毒骨架質(zhì)粒pAdEasy-1的感受態(tài)大腸桿菌BJ5183中，構(gòu)建腺病毒重組質(zhì)粒pAdEasy-1-CMV-GFP-FGF21，將該質(zhì)粒線性化以后轉(zhuǎn)染HEK-293A細(xì)胞，獲得FGF21重組表達(dá)腺病毒，再經(jīng)過(guò)擴(kuò)增培養(yǎng)后進(jìn)行純化，獲得高純度的FGF21重組表達(dá)腺病毒。

將包裝好的重組腺病毒pAdEasy-1-FGF21和空載重組腺病毒pAdEasy-1(陰性對(duì)照)感染HEK-293A細(xì)胞，48 h后收集細(xì)胞，提取總蛋白，經(jīng)SDS-PAGE后，轉(zhuǎn)膜，封閉。Western blot結(jié)果顯示，空載重組腺病毒pAdEasy-1沒(méi)有條帶，而重組腺病毒pAdEasy-1-FGF21可見(jiàn)到與FGF21蛋白標(biāo)準(zhǔn)品一致的位置有條帶，說(shuō)明表達(dá)的蛋白正確。

3.5油紅O染色 切片干燥后入50%乙醇稍洗，用油紅O乙醇染液作用8 min，再用50%乙醇分化，自來(lái)水終止分化后蘇木素復(fù)染核，自來(lái)水返藍(lán)，甘油明膠封片。

3.6ELISA檢測(cè) 按照廠家提供的說(shuō)明書(shū)操作。

3.7Real-time PCR 采用Trizol試劑提取組織總RNA，NanoDrop超微量分光光度計(jì)測(cè)定總RNA含量。取1.0 μg RNA進(jìn)行一步法行逆轉(zhuǎn)錄，總反應(yīng)體積20.0 μL。逆轉(zhuǎn)錄完成后取1 μL cDNA進(jìn)行real-time PCR。擴(kuò)增條件為： 95 ℃初始化15 min； 94 ℃變性1 min， 55 ℃ 1 min， 72 ℃ 1 min， 40個(gè)循環(huán)； 72 ℃ 10 min。

3.8Western blot 提取小鼠皮下脂肪組織和附睪脂肪組織總蛋白，BCA 法測(cè)定總蛋白濃度。10% SDS-PAGE分離，PVDF 膜印跡，10%脫脂奶粉室溫下封閉1 h，分別加入抗GAPDH(1∶1 000)、Erk1/2(1∶1 000)、p-Erk1/2(1∶1 000)和抗PPARγ(1∶1 000)抗體，4 ℃孵育過(guò)夜。用封閉液稀釋相應(yīng)的經(jīng)辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的II 抗(1∶5 000)，37 ℃搖床孵育1 h。洗去多余 II 抗，經(jīng)ECL 發(fā)光液發(fā)光、X 光膠片壓片后顯影、定影。分析膠片灰度值，確定樣品中目的蛋白相對(duì)含量。

3.9小鼠皮下脂肪細(xì)胞原代培養(yǎng) 小心剝離小鼠皮下脂肪組織，用滅菌的手術(shù)剪剪碎，將組織塊放入瓶?jī)?nèi)，然后加入 1 mL膠原蛋白酶液。37 ℃水浴振蕩器孵育約 1 h，直至細(xì)胞混合物形成乳脂樣濃稠液體；加入 4 mL KRBH 緩沖液(37 ℃)，250 μm孔徑的濾網(wǎng)過(guò)濾， KRBH 緩沖液(37 ℃)洗細(xì)胞3次。用DMEM-A 培養(yǎng)液[DMEM，pH 7.4，添加 25 mmol/L 葡萄糖、2 mmol/L 谷氨酰胺、200 nmol/L (R)-N6-(1-甲基-2-苯乙基)腺苷、100 mg/L 慶大霉素和 25 mmol/L HEPES]于37 ℃、5 % CO2條件下培養(yǎng)。

4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。數(shù)據(jù)均采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，多組間數(shù)據(jù)比較采用Bonferroni校正t檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 尾靜脈注射FGF21的急性實(shí)驗(yàn)及抑制Erk1/2信號(hào)通路的影響

與對(duì)照組小鼠相比，db/db小鼠給予尾靜脈注射FGF21 (0.5 mg/kg)后，在60 min內(nèi)具有降低小鼠的血糖、TG和胰島素含量的趨勢(shì)，在120 min時(shí)，db/db小鼠的血糖、TG和胰島素下調(diào)水平進(jìn)一步增加(P<0.05)，見(jiàn)圖1。

為了探索Erk1/2信號(hào)通路對(duì)FGF21調(diào)節(jié)血糖、TG和胰島素水平的影響，db/db小鼠給予U0126(10 mg·kg-1·d-1)處理1周以后，尾靜脈注射FGF21(0.5 mg/kg)。與正常對(duì)照組相比較，單純U0126處理并不影響db/db小鼠的血糖、血脂和胰島素水平；與單純FGF21處理組結(jié)果相似，U0126預(yù)處理1周，并不影響FGF21下調(diào)db/db小鼠的血糖、血脂和胰島素水平，兩者之間的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性，見(jiàn)圖1。

上述結(jié)果表明，在尾靜脈注射FGF21的急性實(shí)驗(yàn)中， 采用U0126抑制Erk1/2信號(hào)通路不影響FGF21下調(diào)db/db小鼠血糖、甘油三酯和胰島素的生物學(xué)功能。

Figure 1. Inhibition of Erk1/2 signaling pathway (A) did not affect the acute effect of FGF21 on blood glucose (B), triglyceride (TG； C) and insulin (D) indb/dbmice. Mean±SD.n=6.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsFGF21 group;△P<0.05vsU0216 group.

圖1抑制Erk1/2信號(hào)通路對(duì)注射FGF21急性實(shí)驗(yàn)后小鼠血糖、甘油三酯和胰島素的影響

2 腺病毒介導(dǎo)轉(zhuǎn)染FGF21的慢性實(shí)驗(yàn)

2.1腺病毒介導(dǎo)轉(zhuǎn)染FGF21改善db/db小鼠異常的血糖水平，改善葡萄糖和胰島素耐受能力 ELISA檢測(cè)結(jié)果顯示，分別與control和U0126組相比，Ad-FGF21和U0126+Ad-FGF21組小鼠的FGF21血清循環(huán)水平在注射FGF21重組表達(dá)腺病毒第3天后就顯著上升，1周后上調(diào)約2.5倍，見(jiàn)圖2A。此外，F(xiàn)GF21重組表達(dá)腺病毒處理后第4周的糖耐受和胰島素耐受能力得到明顯改善，但與U0126處理與否差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性，見(jiàn)圖2B、C。與control和U0126組小鼠相比，Ad-FGF21和U0126+Ad-FGF21組注射Ad-FGF21 4周后，小鼠血糖水平隨著體內(nèi)的FGF21和胰島素循環(huán)水平上調(diào)而顯著下調(diào)，但這2組之間血糖和胰島素下調(diào)幅度的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性，見(jiàn)圖3A～C。上述結(jié)果說(shuō)明，轉(zhuǎn)染重組腺病毒表達(dá)FGF21能下調(diào)db/db小鼠血糖水平，改善db/db小鼠的糖耐受及胰島素耐受能力，但這些功能與Erk1/2信號(hào)通路失活并無(wú)關(guān)系。

Figure 2. Inhibition of Erk1/2 signaling pathway did not affect the effect of FGF21 on the glucose tolerance and insulin resistance in mice. A: circulating FGF21 levels during 4 weeks of Ad-FGF21 administration; B and C: glucose tolerance and insulin tolerance tests at the 4th week of Ad-FGF21 treatment. Mean±SD.n=6.*P<0.05vscontrol group；#P<0.05vsU0216 group.

圖2Ad-FGF21處理4周血清FGF21循環(huán)水平的變化及第4周葡萄糖耐受和胰島素耐受狀況

2.2腺病毒介導(dǎo)轉(zhuǎn)染FGF21降低db/db小鼠的異常甘油三酯水平 分別與control和U0126組小鼠相比，Ad-FGF21和U0126+Ad-FGF21組注射Ad-FGF21 4周后，小鼠的甘油三酯水平隨著體內(nèi)的FGF21循環(huán)水平上調(diào)而顯著下調(diào)(P<0.05)，但這2組間甘油三酯水平下調(diào)幅度的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性，見(jiàn)圖3D。上述結(jié)果表明，腺病毒介導(dǎo)表達(dá)的FGF21具有降低甘油三酯的功能，但與Erk1/2失活無(wú)關(guān)。

Figure 3. Inhibition of Erk1/2 signaling pathway did not affect the effect of FGF21 on glucose, insulin and triglyceride (TG) indb/dbmice. A: cirulating level of FGF21 at the 4th week； B: blood glucose level； C: serum insulin level； D: serum TG level. Mean±SD.n=6.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsAd-FGF21 group;△P<0.05vsU0126 group.

圖3Ad-FGF21處理4周后小鼠血清FGF21、葡萄糖、胰島素及甘油三酯的變化

2.3腺病毒介導(dǎo)轉(zhuǎn)染FGF21對(duì)db/db小鼠各主要器官重量和組織形態(tài)學(xué)的影響 與正常對(duì)照組相比較，db/db小鼠單獨(dú)注射U0126后，小鼠各主要臟器占體重的比值沒(méi)有顯著變化；而單獨(dú)注射FGF21則顯著下調(diào)褐色及白色脂肪組織與小鼠體重的比值(P<0.05)，但U0126處理對(duì)FGF21降低脂肪/體重的比值并無(wú)顯著的影響，見(jiàn)圖4。此外，組織形態(tài)學(xué)分析結(jié)果也表明，F(xiàn)GF21處理后，脂肪細(xì)胞的面積顯著增加，巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)明顯減少，脂聯(lián)素表達(dá)明顯增加(P<0.05)，而U0126處理對(duì)FGF21引發(fā)的這些生物學(xué)效應(yīng)并無(wú)明顯的影響，見(jiàn)圖5。上述結(jié)果表明，F(xiàn)GF21具有降低機(jī)體脂肪含量的生物學(xué)功能，但該效應(yīng)與Erk1/2信號(hào)通路失活無(wú)關(guān)。

2.4腺病毒介導(dǎo)轉(zhuǎn)染FGF21顯著上調(diào)皮下脂肪組織Erk1/2的磷酸化及PPARγ的表達(dá)水平 與正常對(duì)照組相比，給予Ad-FGF21處理4周后，小鼠皮下脂肪中Erk1/2磷酸化活性和PPARγ表達(dá)均顯著上調(diào)(P<0.05)；然而，U0126處理后，小鼠皮下脂肪中Erk1/2磷酸化活性和PPARγ表達(dá)均顯著降低(P<0.05)，同時(shí)給予Ad-FGF21處理后，小鼠皮下脂肪中Erk1/2磷酸化活性并沒(méi)有增加，但是PPARγ表達(dá)水平顯著增加，見(jiàn)圖6。

此外，我們發(fā)現(xiàn)，給予Ad-FGF21及U0126處理后，小鼠附睪脂肪中Erk1/2磷酸化活性和PPARγ表達(dá)的變化與皮下脂肪組織相似，見(jiàn)圖7。這些結(jié)果表明，在db/db小鼠脂肪組織中，F(xiàn)GF21處理引發(fā)的PPARγ表達(dá)上調(diào)可能與Erk1/2信號(hào)失活無(wú)關(guān)。

2.5腺病毒介導(dǎo)轉(zhuǎn)染FGF21對(duì)db/db小鼠adiponectin表達(dá)的影響 與正常對(duì)照組相比，給予Ad-FGF21處理4周后，db/db小鼠脂肪組織中adiponectin的mRNA和血清循環(huán)水平均顯著上調(diào)(P<0.05)；而單獨(dú)給予U0126處理4周并不影響小鼠皮下脂肪組織中adiponectin的mRNA表達(dá)及血清循環(huán)水平；然而，同時(shí)給予U0126和FGF21重組腺病毒FGF21處理后，小鼠脂肪組織中adiponectin的mRNA表達(dá)及血清循環(huán)水平均顯著上調(diào)，見(jiàn)圖8。這些結(jié)果表明FGF21引發(fā)的脂聯(lián)素表達(dá)與不受Erk1/2信號(hào)調(diào)控。

Figure 4. Inactivation of Erk1/2 did affect the effect of FGF21 on body parameters indb/dbmice. BAT: brown adipose tissue； WAT: white adipose tissue. Mean±SD.n=6.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsAd-FGF21 group;△P<0.05vsU0126 group.

圖4Ad-FGF21處理后小鼠各主要器官重量的變化狀況

Figure 5. Representative images and quantitative analysis of the morphology of adipose tissues, macrophage accumulation and adiponectin expression indb/dbmice treated with Ad-FGF21, U0126 or Ad-FGF21+U0126. A: HE staining, scale bar=100 μm; B: F4/80 macrophage accumulation, scale bar=50 μm; C: adiponectin expression, scale bar=50 μm.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsAd-FGF21 group;△P<0.05vsU0126 group.

圖5Ad-FGF21及U0126處理后小鼠脂肪組織形態(tài)學(xué)、巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)及脂聯(lián)素表達(dá)狀況

3 Erk1/2 信號(hào)通路失活對(duì) FGF21 抗糖尿病病變的影響

3.1小鼠原代脂肪細(xì)胞分離培養(yǎng)及油紅O染色鑒定 結(jié)果顯示，原代分離培養(yǎng)的脂肪細(xì)胞中有80%～90%左右是脂肪細(xì)胞，見(jiàn)圖9。

Figure 6. Inhibition of Erk1/2 signaling pathway did not affect FGF21-induced subcutaneous adipose PPARγ expression indb/dbmice. Mean±SD.n=6.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsAd-FGF21 group；△P<0.05vsU0126 group.

圖6Erk1/2對(duì)FGF21調(diào)節(jié)小鼠皮下脂肪組織PPARγ表達(dá)的影響

Figure 7. Inactivation of Erk1/2 did not affect FGF21-induced epididymal adipose PPARγ expression indb/dbmice. Mean±SD.n=6.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsAd-FGF21 group；△P<0.05vsU0126 group.

圖7Erk1/2對(duì)FGF21調(diào)節(jié)小鼠附睪脂肪組織PPARγ表達(dá)的影響

3.2抑制Erk1/2信號(hào)通路對(duì)原代培養(yǎng)小鼠皮下脂肪細(xì)胞PPARγ表達(dá)的影響 前期研究發(fā)現(xiàn)，重組人FGF21蛋白處理后可上調(diào)Erk1/2活性和PPARγ的活性。我們的結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比較，給予U0126處理后，Erk1/2磷酸化活性被顯著抑制，而PPARγ的活性保持不變；同時(shí)給予U0126和重組人FGF21蛋白處理后，PPARγ的活性則明顯上調(diào)，見(jiàn)圖10。與此同時(shí)，給予U0126抑制Erk1/2活性時(shí)，原代培養(yǎng)小鼠脂肪細(xì)胞中脂聯(lián)素的表達(dá)并沒(méi)有顯著的變化，而給予U0126和重組人FGF21蛋白處理后，原代培養(yǎng)的小鼠脂肪細(xì)胞中PPARγ及adiponectin的mRNA水平均顯著上調(diào)，與此同時(shí)，培養(yǎng)基中的adiponectin蛋白水平也顯著上調(diào)，見(jiàn)圖11。這些結(jié)果提示，脂肪細(xì)胞中PPARγ及adiponectin的表達(dá)不受Erk1/2信號(hào)通路的調(diào)控。

Figure 8. Inhibition of Erk1/2 signaling pathway did not affect FGF21-induced adiponection expression indb/dbmice. A: the mRNA expression level of adiponectin in subcutaneous adipose tissue; B: circulating adiponectin level in the mice. Mean±SD.n=6.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsAd-FGF21 group;△P<0.05vsU0216 group.

圖8Ad-FGF21處理后小鼠皮下脂肪組織脂聯(lián)素mRNA及循環(huán)水平變化狀況

Figure 9. Oil red O staining of primary adipocytes before and after differentiation. Scale bar=100 μm.

圖9原代培養(yǎng)脂肪細(xì)胞分化前后油紅O染色結(jié)果

Figure 10. Inhibition of Erk1/2 signaling pathway did not affect FGF21-induced PPARγ expression in primary adipocytes of mice. Mean±SD.n=6.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsFGF21 group；△P<0.05vsU0216 group.

圖10Erk1/2對(duì)原代培養(yǎng)小鼠皮下脂肪細(xì)胞PPARγ表達(dá)的影響

Figure 11. Inhibition of Erk1/2 signaling pathway did not affect FGF21-induced expression of PPARγ and adiponectin in primary cultured subcutaneous adipocytes of mice. Mean±SD.n=6.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsFGF21 group;△P<0.05vsU0216 group.

圖11Erk1/2對(duì)原代培養(yǎng)小鼠皮下脂肪細(xì)胞PPARγ及adiponectin表達(dá)的影響

討 論

FGF21是一個(gè)約210個(gè)氨基酸序列組成的，主要由肝臟細(xì)胞表達(dá)的分泌蛋白[6-8]。不同于傳統(tǒng)的其它FGF家族成員，F(xiàn)GF21主要以?xún)?nèi)分泌因子的角色參與機(jī)體的物質(zhì)代謝調(diào)控作用[6, 9]。最近大量動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究表明，F(xiàn)GF21是一個(gè)重要的調(diào)節(jié)糖脂代謝的激素，并在治療肥胖及糖尿病相關(guān)疾病中有著廣泛的潛力[9-11]。我們的早期研究發(fā)現(xiàn)[1]，F(xiàn)GF21在調(diào)控機(jī)體血糖代謝平穩(wěn)、胰島素敏感性和脂質(zhì)代謝與脂聯(lián)素的表達(dá)分泌存在密切的關(guān)系。在體外培養(yǎng)的脂肪細(xì)胞中，F(xiàn)GF21通過(guò)PPARγ信號(hào)通路，上調(diào)脂聯(lián)素的表達(dá)和分泌；在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)方面，重組FGF21顯著提高小鼠的循環(huán)脂聯(lián)素水平；而在FGF21基因敲除小鼠中，血清脂聯(lián)素水平顯著降低。更重要的是，在脂聯(lián)素基因缺失的糖尿病小鼠中，重組FGF21的降血糖和降血脂效應(yīng)均顯著低于對(duì)照組。此外，重組FGF21對(duì)脂聯(lián)素缺失的糖尿病小鼠的調(diào)節(jié)能量代謝的效應(yīng)也顯著降低。這些結(jié)果表明，F(xiàn)GF21的抗糖尿病特性可能是通過(guò)某些信號(hào)分子調(diào)控PPARγ的活性，然后進(jìn)一步刺激脂聯(lián)素的表達(dá)與分泌，最終達(dá)到發(fā)揮其降血糖、提高胰島素敏感性的目標(biāo)。然而，F(xiàn)GF21是如何調(diào)控PPARγ，發(fā)揮其抗糖尿病的生物功能？這有待于深入探索。

MAPK家族是細(xì)胞內(nèi)的一類(lèi)絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，主要包括生長(zhǎng)因子引發(fā)的Erk1/2以及壓力應(yīng)激引發(fā)的p38 MAPK和JNK等家族成員[12-13]。在肥胖引發(fā)的相關(guān)疾病中，MAPK直接參與了機(jī)體內(nèi)的肝脂代謝調(diào)控，并參與機(jī)體胰島素抵抗的調(diào)控。p38 MAPK 通過(guò)磷酸化核受體PPARα而促進(jìn)脂肪酸的β氧化[14-16]。在肥胖及其引發(fā)的糖尿病大鼠模型中，JNK1 MAPK的活性伴隨著胰島素抵抗的增加而顯著上升；相反，抑制JNK1 MAPK的活性能顯著緩解胰島素抵抗、增加胰島素敏感性[17]。此外，JNK1 MAPK與肝臟脂肪代謝密切相關(guān)[18]。有意思的是，JNK1 MAPK活性與PPARγ活性及其表達(dá)狀況也存在密切的關(guān)系, 抑制JNK活性顯著上調(diào)PPARγ的表達(dá)[19]。在palmitate引發(fā)的胰島素抵抗條件下，F(xiàn)GF21能顯著抑制JNK1 MAPK的活性[20]。由此可見(jiàn)，在肥胖及糖尿病發(fā)病過(guò)程中，F(xiàn)GF21、JNK1、Erk1/2 MAPK與PPARγ均參與了疾病的病變過(guò)程，并且在相互之間還存在著相互調(diào)控的密切關(guān)系。然而，在FGF21調(diào)節(jié)PPARγ過(guò)程中，是否也通過(guò)調(diào)控或影響JNK1和Erk1/2 MAPK通路，進(jìn)而激活下游相關(guān)靶基因的活性，最終發(fā)揮其抗糖尿病效應(yīng)，這有待于深入探索。

本研究發(fā)現(xiàn)，無(wú)論是急性實(shí)驗(yàn)還是慢性實(shí)驗(yàn)，F(xiàn)GF21的降糖降脂作用并不隨著Erk1/2 MAPK通路關(guān)閉而喪失。葡萄糖耐受試驗(yàn)和胰島素耐受試驗(yàn)的結(jié)果表明，Erk1/2 MAPK通路的關(guān)閉并不會(huì)影響FGF21對(duì)db/db小鼠葡萄糖和胰島素耐受能力的改善。此外，比較U0126抑制Erk1/2 MAPK通路與否，F(xiàn)GF21對(duì)db/db小鼠血糖、胰島素水平和血清TG水平的下調(diào)作用，發(fā)現(xiàn)二者并沒(méi)有顯著的差異。同時(shí)，我們觀察了Erk1/2 MAPK通路對(duì)FGF21-PPARγ-adiponectin通路的影響。發(fā)現(xiàn)無(wú)論是血清脂聯(lián)素水平還是脂肪組織中的脂聯(lián)素水平都不受Erk1/2 MAPK通路的影響。體外實(shí)驗(yàn)和體內(nèi)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果表明脂肪細(xì)胞/脂肪組織中PPARγ的mRNA表達(dá)水平和蛋白水平亦不受Erk1/2 MAPK通路的影響。

綜上所述，我們的研究表明，Erk1/2失活對(duì)FGF21降血糖及降甘油三酯的功能與Erk1/2活性并無(wú)直接的明顯的作用。這些結(jié)果提示，Erk1/2可能不參與FGF21調(diào)節(jié)脂肪細(xì)胞下游信號(hào)分子PPARγ/adiponectin，進(jìn)而發(fā)揮其降血糖及調(diào)節(jié)甘油三酯等脂質(zhì)代謝的生物功能。

[1] Lin Z, Tian H, Lam KS, et al. Adiponectin mediates the metabolic effects of FGF21 on glucose homeostasis and insulin sensitivity in mice[J]. Cell Metab, 2013, 17(5): 779-789.

[2] Lin X, Li G, He X, et al. FGF21 inhibits apolipoprotein(a) expression in HepG2 cells via the FGFR1-ERK1/2-Elk-1 pathway[J]. Mol Cell Biochem, 2014, 393(1-2):33-42.

[3] Lin XL, He XL, Zeng JF, et al. FGF21 increases cholesterol efflux by upregulating ABCA1 through the ERK1/2-PPARγ-LXRα pathway in THP1 macrophage-derived foam cells[J]. DNA Cell Biol, 2014, 33(8):514-521.

[4] Liang Q, Zhong L, Zhang J, et al. FGF21 maintains glucose homeostasis by mediating the cross talk between liver and brain during prolonged fasting[J]. Diabetes, 2014, 63(12):4064-4075.

[5] Zhang C, Huang Z, Gu J, et al. Fibroblast growth factor 21 protects the heart from apoptosis in a diabetic mouse model via extracellular signal-regulated kinase 1/2-dependent signalling pathway[J]. Diabetologia, 2015, 58(8):1937-1948.

[6] Nishimura T, Nakatake Y, Konishi M, et al. Identification of a novel FGF, FGF-21, preferentially expressed in the liver[J]. Biochim Biophys Acta, 2000, 1492(1): 203-206.

[7] Reitman ML. FGF21: A missing link in the biology of fasting[J]. Cell Metab, 2007, 5(6):405-407.

[8] Kharitonenkov A, Shiyanova TL, Koester A, et al. FGF-21 as a novel metabolic regulator[J]. J Clin Invest, 2005, 115(6):1627-1635.

[9] Kharitonenkov A, Wroblewski VJ, Koester A, et al. The metabolic state of diabetic monkeys is regulated by fibroblast growth factor-21[J]. Endocrinology, 2007, 148(2): 774-781.

[10] Kharitonenkov A, Shanafelt AB. Fibroblast growth factor-21 as a therapeutic agent for metabolic diseases[J]. BioDrugs, 2008, 22(1):37-44.

[11] Inagaki T, Dutchak P, Zhao G, et al. Endocrine regulation of the fasting response by PPAR α-mediated induction of fibroblast growth factor 21[J]. Cell Metab, 2007, 5(6):415-425.

[12] Berglund ED, Li CY, Bina HA, et al. Fibroblast growth factor 21 controls glycemia via regulation of hepatic glucose flux and insulin sensitivity[J]. Endocrinology, 2009, 150(9):4084-4093.

[13] Dutchak PA, Katafuchi T, Bookout AL, et al. Fibroblast growth factor-21 regulates PPARγ activity and the antidiabetic actions of hiazolidinediones[J]. Cell, 2012, 148(3):556-567.

[14] Raman M, Chen W, Cobb MH. Differential regulation and properties of MAPKs[J]. Oncogene, 2007, 26(22):3100-3112.

[15] Weston CR, Davis RJ. The JNK signal transduction pathway[J]. Curr Opin Cell Biol, 2007,19(2):142-149.

[16] 李素娟， 金可可， 趙亞萍， 等. 氧化應(yīng)激激活JNK-MAPK參與波動(dòng)性高血糖誘導(dǎo)的大鼠肝細(xì)胞損傷[J]. 中國(guó)病理生理雜志， 2015， 31(7)：1259-1265.

[17] Barger PM, Browning AC, Garner AN, et al. p38 mitogen-activated protein kinase activates peroxisome proliferator-activated receptor α: a potential role in the cardiac metabolic stress response[J]. J Biol Chem, 2001, 276(48):44495-44501.

[18] Xiong Y, Collins QF, An J, et al. p38 mitogen-activated protein kinase plays an inhibitory role in hepatic lipogenesis[J]. J Biol Chem, 2007, 282(7):4975-4982.

[19] Hirosumi J, Tuncman G, Chang L, et al. A central role for JNK in obesity and insulin resistance[J]. Nature, 2002, 420(6913):333-336.

[20] Schattenberg JM, Singh R, Wang Y, et al. JNK1 but not JNK2 promotes the development of steatohepatitis in mice[J]. Hepatology, 2006, 43(1):163-172.

Pharmaceutical inactivation of Erk1/2 does not affect function of FGF21 to regulate glucose and lipid metabolic hemostasis

WU Chao-ming1, ZHENG Ju-jia2, PAN Ying-ying2, YE Yan-na2, PAN Xue-bo2, LIN Zhuo-feng2, 3

(1TheSecondAffiliatedHospital,2SchoolofPharmaceuticalScience,WenzhouMedicalUniversity,Wenzhou325035,China;3TheFirstAffiliatedHospitalofJinanUniversity,Guangzhou510630,China.E-mail:zflwf@126.com)

AIM: To investigate whether inactivation of extracellular signal-regulated kinase 1/2 (Erk1/2) will affect the function of fibroblast growth factor 21 (FGF21) to regulate glucose and lipid metabolism.METHODSMaledb/dbmice (8 weeks old) were treated with U0126 (an inhibitor of Erk1/2 kinase) for 1 week, and then treated with recombinant human FGF21 protein and adenovirus-mediated FGF21 (Ad-FGF21). The profile changes of blood glucose and blood lipid were evaluated at 120 min or 4 weeks after FGF21 administration. Meanwhile, the molecular mechanism was explored byinvitrostudy.RESULTSTreatment ofdb/dbmice with recombinant human FGF21 protein significantly reduced blood glucose and triglyceride levels at 120 min after FGF21 administration, but these changes were comparable in U0126-treated mice. Furthermore, abnormal glucose and triglyceride levels, and glucose and insulin tolerance were strongly improved indb/dbmice as accompanied with decreasing body fat content after 4 weeks of ad-FGF21 administration. Interestingly, treatment with or without U0126 did not influence these effects of FGF21. Mechanically, treatment with Ad-FGF21 significantly upregulated the protein levels of p-Erk1/2 and peroxisome proliferator-activated receptor γ (PPARγ) as well as the expression of adiponectin at mRNA and protein levels in adipose tissues. However, treatment with or without U0126 did not change the profiles. On the other hand, invitroexperiments also indicated that treatment of adipocytes with recombinant human FGF21 protein significantly activated Erk1/2 phosphorylation, and upregulated the expression levels of PPARγ and adiponectin (P<0.05). However, pre-administration of U0126 did not affect the profiles.CONCLUSIONPharmaceutical inactivation of Erk1/2 by U0216 does not affect the biological function of FGF21 to regulate blood glucose balance and improve abnormal blood lipidsinvivo.

Fibroblast growth factor 21; Extracellular signal-regulated kinase 1/2; Insulin-sensitizing effect; Glucose and lipid metabolism disorder

1000- 4718(2017)12- 2212- 10

2017- 06- 30

2017- 11- 16

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No. 81471075)；浙江省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No. LY15H070003)

△通訊作者 Tel: 0577-86699350； E-mail: zflwf@126.com

R329.21； R587.1

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2017.12.016

(責(zé)任編輯： 陳妙玲， 羅 森)