荊 嬌, 馬海玲, 閆文升, 張永忠, 張玉清, 焦宗偉
(石家莊醫(yī)學高等專科學校, 河北 石家莊 050000)
辛伐他汀對大鼠腎缺血再灌注損傷后心肌Bcl-2和Bax蛋白表達的影響*
荊 嬌△, 馬海玲, 閆文升, 張永忠, 張玉清, 焦宗偉
(石家莊醫(yī)學高等專科學校, 河北 石家莊 050000)
目的觀察辛伐他汀對腎缺血再灌注損傷后心肌組織的影響及其機制。方法隨機將36只大鼠分為假手術(shù)組、腎缺血再灌注組和辛伐他汀組,每組12只。后2組用夾閉雙側(cè)腎動脈的方法復(fù)制腎缺血再灌注損傷模型;辛伐他汀組在造模前給予辛伐他汀(20 mg·kg-1·d-1)灌胃,持續(xù)2周。用生化檢查檢測血清肌酐(SCr)、血尿素氮(BUN)、心肌組織丙二醛(MDA)含量及乳酸脫氫酶(LDH)、肌酸激酶(CK)和超氧化物歧化酶(SOD)的活性,并用Western blot 法檢測Bcl-2和Bax的表達水平。結(jié)果與假手術(shù)組比,缺血再灌注組SCr、BUN和心肌MDA含量均升高(P<0.05),心肌LDH和CK活性增強(P<0.05),心肌SOD活性明顯下降(P<0.05);與缺血再灌注組比較, 辛伐他汀組SCr、BUN和心肌MDA的含量降低(P<0.05),心肌LDH和CK活性明顯減弱(P<0.05),而心肌SOD活性增強(P<0.05)。與假手術(shù)組比較,心肌Bcl-2與Bax的蛋白表達水平在腎缺血再灌注組增多(P<0.05); 與缺血組相比, Bax表達在辛伐他汀組明顯降低,而Bcl-2表達增加(P<0.05)。結(jié)論辛伐他汀對腎缺血再灌注后的心肌有保護作用,保護機制可能與辛伐他汀可以消除自由基、升高Bcl-2蛋白表達和降低Bax 蛋白表達有一定關(guān)系。
辛伐他汀; 腎缺血再灌注損傷; 心??; 丙二醛; 超氧化物歧化酶; 乳酸脫氫酶
他汀類藥物是3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A(3-hydroxy-3-methyl glutaryl coenzyme A,HMG-CoA)還原酶抑制劑。自1976年Endo等[1]于桔霉素提取液中發(fā)現(xiàn)了美伐他汀, 隨后洛伐他汀等他汀類藥物相繼問世。他汀類藥物通過對HMG-CoA還原酶的特異性抑制作用, 使 HMG-CoA 不能轉(zhuǎn)變?yōu)榧琢u戊酸, 從而阻斷膽固醇的合成,這一作用目前在臨床上廣泛用于高血脂的治療。有研究發(fā)現(xiàn),普伐他汀預(yù)處理可以通過抑制細胞凋亡減輕腎缺血再灌注損傷(renal ischemia-reperfusion injury,RIRI)[2]。他汀類藥物在防治心臟疾病方面也日益受到重視,也有研究指出辛伐他汀(simvastatin,Sim)可劑量依賴性地延遲因缺氧誘導(dǎo)的新生心肌細胞的壞死,減輕心肌初始缺血損傷和再灌注損傷,改善心功能[3]。但他汀類藥物對腎缺血再灌注(ischemia-reperfusion,I/R)后心肌組織的影響卻少有報道。我們就此進行了初步研究,通過建立RIRI模型,并用辛伐他汀干預(yù),檢測血清肌酐(serum creatinine,SCr)、血尿素氮(blood urea nitrogen,BUN)和心肌組織丙二醛(malondialdehyde,MDA)含量,乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase,LDH)、肌酸激酶(creatine kinase,CK)和超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)活性以及Bcl-2和Bax蛋白表達,以探討辛伐他汀對腎缺血再灌注后心肌的作用。
健康雄性Sprague-Dawley大鼠36只,體重160~230 g,購自河北省實驗動物中心。
辛伐他汀購自杭州上虞京新藥業(yè)有限公司;SCr和BUN測定試劑盒購自北化康泰臨床試劑有限公司;MDA和SOD試劑盒購自南京建成生物制品公司;抗β-actin、Bcl-2和Bax抗體購自Santa Cruz。
HW1電熱恒溫水溫箱(北京醫(yī)療設(shè)備廠);LXJ-Ⅱ離心機(上海醫(yī)用儀器分析廠);GPR低溫低速離心機(Beckman);EW-3000A電子天平(沈陽天平儀器廠);分析天平(上海精密科學儀器公司);721分光光度計(北京第三分析儀器廠);SN-682B全自動γ記數(shù)儀(上海日環(huán)儀器廠); DYY-Ⅲ型電泳儀(北京六一儀器廠);酶標分析儀(Thermo);超低溫冰箱(SANYO);凝膠分析系統(tǒng)(美國UVF公司);X線攝影暗匣(上海躍進醫(yī)用光學器械廠);塑料薄膜封口機(溫州市鼎力包裝機械制造有限公司);電熱保溫干燥箱(重慶實驗設(shè)備廠);隔水式電熱恒溫培養(yǎng)箱(上海躍進醫(yī)用光學器械廠)。
3.1實驗分組與模型建立 將大鼠在20~26 ℃實驗室喂養(yǎng)2 d,然后用隨機數(shù)字表按完全隨機分組方法將動物分成假手術(shù)(sham)組、I/R組和Sim組。每組12只。分組后,Sim組給予20 mg·kg-1·d-1Sim灌胃,持續(xù)2周;sham和I/R組每天給同量的自來水灌胃。2周之后復(fù)制RIRI模型。
復(fù)制RIRI模型的動物用10%水合氯醛腹腔麻醉,行剖腹手術(shù), 暴露雙側(cè)腎動靜脈。I/R組和Sim組夾閉雙側(cè)腎動脈,45 min后去除動脈夾再恢復(fù)血流灌注,然后逐層縫合關(guān)腹;sham組開腹但不夾閉血管,其余操作相同。再灌注后24 h各組分別從腹主動脈取血4~5 mL,分離留取血清于冰箱中低溫保存,留待測定SCr和BUN含量。然后摘取心臟,冰生理鹽水沖凈血液,取左心室前壁部分組織,制備勻漿待檢測MDA含量以及LDH、CK和SOD活性,并用Western blot 法檢測Bcl-2和Bax的蛋白表達水平。
3.2生化檢測方法 用苦味酸不除蛋白法完成血清SCr測定,BUN含量測定采用OPA法,采用硝酸還原酶法測定NO含量,硫代巴比妥酸法測定MDA含量,黃嘌呤氧化酶法測定SOD活性。 用L-P法檢測LDH活性,用N-乙酰半胱氨酸法檢測CK活性。各項指標檢測方法嚴格按說明書操作。
3.3Western blot 法檢測Bcl-2和Bax 的蛋白表達 制備心肌組織前除去組織血液,用濾紙吸干,準確稱重。將干凈、干燥的勻漿管置于冰水混合物中,將組織塊放于勻漿管中,盡快剪碎組織,然后按1∶9(W/V)加入冰生理鹽水,將組織勻漿。而后將勻漿移入干燥的試管中,置于4 ℃離心機中,以3 000 r/min離心10 min。取上清液儲存待測。提取蛋白后灌膠上樣,加樣后先用恒流10 mA,再用恒壓100 V電泳至溴酚藍到凝膠底部。待電泳停止后,將凝膠轉(zhuǎn)移到PVDF 膜上,轉(zhuǎn)移電壓為 100 V,時間120 min。然后將 PVDF 膜移至含有封閉液的平皿中,室溫下?lián)u床上搖動封閉2 h。取出 PVDF 膜,加入稀釋后的 I 抗冰箱里4 ℃過夜。再用 TBST 室溫下脫色搖床上洗10 min×3次,然后加入1∶1 000 稀釋的辣根酶標記羊抗兔 IgG 抗體室溫孵育1 h,用 TBST 室溫下脫色搖床上洗 10 min×5次。將顯色劑滴加于晾干的 PVDF 膜上,顯色照相。最后用Quantity One軟件對條帶進行分析。
采用SPSS 23.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計分析。定量數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差(mean±SD)表示,多組數(shù)據(jù)間比較采用單因素方差分析,兩組數(shù)據(jù)之間比較用t檢驗。以P<0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。
與sham組比較,I/R組腎功能受損,肌酐和尿素氮含量均增高,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。與I/R組比較,Sim組肌酐和尿素氮含量均降低,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01),見表1。
表1辛伐他汀對血清肌酐和血尿素氮含量的影響
Table 1. The changes of SCr and BUN in the I/R rats with or without Sim treatment (Mean±SD.n=12)
GroupSCr(μmol/L)BUN(mmol/L)Sham56.96±2.016.84±0.51I/R141.51±3.80△△17.58±1.12△△Sim119.76±1.12**14.86±1.54**
△△P<0.01vssham group;**P<0.01vsI/R group.
I/R組的LDH和CK活性高于sham組,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01);與I/R組比較,Sim組的LDH和CK活性降低,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。I/R組心肌組織的SOD活性低于sham組(P<0.01),MDA含量則高于sham組(P<0.01);與I/R組相比,Sim組的SOD活性升高(P<0.01),MDA含量則減少(P<0.01),見表2。
表2 辛伐他汀對心肌CK、LDH和SOD活性及MDA含量的影響
△△P<0.01vssham group;**P<0.01vsI/R group.
Western blot法蛋白含量檢測顯示,與sham組比較,I/R組Bcl-2和Bax表達均顯著增高(P<0.05),而Sim組Bax蛋白表達減少,Bcl-2表達增加(P<0.05)。
RIRI涉及多種因素,如自由基損傷、白細胞和內(nèi)皮細胞之間的作用、胞內(nèi)鈣的超載和NO等[4]。以往的研究指出[5],缺血缺氧可以引起血管內(nèi)皮細胞的損傷和脂質(zhì)過氧化物增多,這是引起RIRI的關(guān)鍵因素之一。氧化應(yīng)激是機體內(nèi)氧自由基生成和去除失衡,或者由于外源性氧化劑超量攝入,導(dǎo)致活性氧簇(reactive oxygen species,ROS)的積累而引起的毒性過程。在生理狀態(tài)下,機體產(chǎn)生SOD能快速清除氧自由基等,防止氧自由基的過量積累。Laude等[6]研究報道缺血再灌注期間可以產(chǎn)生的大量ROS,經(jīng)過血液循環(huán)到達相應(yīng)的靶器官造成器官的損傷。目前, I/R損傷的研究已不僅限于發(fā)生缺血的局部組織,遠端器官如肺、腎、腦和心等也常常是受累靶器官[7]。河北省醫(yī)學科學院以往也采用夾閉大鼠雙側(cè)腎動、靜脈45 min后恢復(fù)血流的方法,復(fù)制腎I/R損傷模型,同時觀察發(fā)現(xiàn)腦組織MDA含量增多,SOD的活性下降,說明腦組織在此過程中也受到了影響[8]。這也說明腎缺血后對遠端器官是有影響的。雖然經(jīng)過循環(huán)后的ROS水平有所降低,但產(chǎn)生的各種損傷因子也可引起相關(guān)器官的損傷。
在調(diào)控細胞凋亡的過程中,Bcl-2蛋白起重要作用,是線粒體凋亡通路中的一種抑制凋亡的蛋白。而Bax是Bcl-2家族成員之一,是一種促凋亡蛋白。 屈朝法等[9]研究發(fā)現(xiàn),急性心肌梗死后晚期再灌注可以減少梗死周邊缺血區(qū)心肌細胞凋亡,其機制可能與心肌細胞表達Bax蛋白減少有關(guān)。也有報道雌激素能夠保護心肌,機制可能通過降低NF-κB的表達進而上調(diào)Bcl-2 mRNA的表達、下調(diào)Bax mRNA的表達來實現(xiàn)逆轉(zhuǎn)缺氧對心肌細胞的抑制作用[10]。孫曉靖等[11]對異丙腎上腺素損傷大鼠采用阿托伐他汀預(yù)先干預(yù),發(fā)現(xiàn)對心肌在左室重塑指標方面有顯著改善,其可能通過促進Bax/Bcl-2趨于平衡而對心肌細胞凋亡產(chǎn)生影響,早期應(yīng)用阿托伐他汀可能有益于損傷心肌。這些都表明Bcl-2能抑制心肌細胞凋亡,而Bax則可促進其凋亡。
Figure 1. The protein expression of Bax (A) and Bcl-2 (B) in the rat myocardium detected by Western blot. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsSham group;#P<0.05vsI/R group.
圖1辛伐他汀對腎缺血再灌注后心肌Bcl-2與Bax蛋白表達的影響
本次實驗采用河北省醫(yī)學科學院的以往方法復(fù)制腎I/R損傷模型[12],觀察再灌后24 h各項指標變化。結(jié)果表明I/R組腎功能明顯受損,肌酐和尿素氮高于假手術(shù)組,而辛伐他汀組肌酐和尿素氮含量低于I/R組。I/R后組織中MDA含量、LDH和CK活性增加,同時SOD活性顯著降低,而給予辛伐他汀干預(yù)后,MDA含量降低,SOD活性提高,LDH和CK活性減弱。這說明辛伐他汀對I/R條件下遠程器官心肌組織有保護作用。Bcl-2與Bax表達在假手術(shù)組的水平低,在腎I/R組增多,與I/R組相比,Bax的表達在辛伐他汀組明顯降低,而Bcl-2的表達增加。這表明在腎的I/R過程中,心肌組織MDA含量和SOD活性發(fā)生變化,同時伴有過量細胞凋亡的發(fā)生,這與I/R時產(chǎn)生的大量自由基可能有一定關(guān)系。辛伐他汀可以清除多余的氧自由基,減少心肌細胞的氧化損傷,并可升高Bcl-2,降低Bax蛋白的表達,從而抑制細胞凋亡。
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Effects of simvastatin on expression of Bcl-2 and Bax in myocardium of rats with renal ischemia-reperfusion injury
JING Jiao, MA Hai-ling, YAN Wen-sheng, ZHANG Yong-zhong, ZHANG Yu-qing, JIAO Zong-wei
(ShijiazhuangMedicalCollege,Shijiazhuang050000,China.E-mail: 35982225@qq.com)
AIM: To observe the effect of simvastatin on myocardial tissue after renal ischemia-reperfusion injury and its mechanism.METHODSA rat model of renal ischemia-reperfusion injury was prepared by clamping the bilateral renal arteries for 45 min. The rats (n=36) were randomly divided into sham operation group, renal ischemia-reperfusion (I/R) group and simvastatin group with 12 rats in each group. The content of serum creatinine (SCr), blood urea nitrogen (BUN) and myocardial tissue malondialdehyde (MDA), the myocardial activity of lactate dehydrogenase (LDH), creatine kinase (CK) and superoxide dismutase (SOD), and the myocardial protein expression of Bcl-2 and Bax were detected.RESULTSCompared with sham operation group, the content of SCr, BUN and myocardial MDA, and the myocardial activity of LDH and CK in I/R group were significantly increased (P<0.05), and the activity of SOD was significantly decreased (P<0.05). Compared with I/R group, the content of SCr, BUN and myocardial MDA, and the myocardial activity of LDH and CK in simvastatin group were significantly decreased (P<0.05), while SOD activity was enhanced (P<0.05). The protein expression of Bcl-2 and Bax in sham operation group was less than that in I/R group (P<0.05), and the protein level of Bax in simvastatin group was significantly lower than that in I/R group (P<0.05), while the protein level of Bcl-2 was increased (P<0.05).CONCLUSIONSimvastatin has a protective effect on the myocardium of the rats with renal ischemia-reperfusion injury, and the protective mechanism may be related to the elimination of free radicals by simvastatin, increase in the protein expression of Bcl-2 and decrease in the protein expression of Bax.
Simvastatin; Renal ischemia-reperfusion injury; Myocardium; Malondialdehyde; Superoxide dismutase; Lactate dehydrogenase
1000- 4718(2017)12- 2274- 04
2017- 05- 10
2017- 07- 24
河北省教育廳高等學??茖W技術(shù)指導(dǎo)性研究項目(No. Z2014020)
△通訊作者 Tel: 13473755521; E-mail: 35982225@qq.com
R363; R965
A
10.3969/j.issn.1000- 4718.2017.12.026
(責任編輯: 陳妙玲, 羅 森)