小檗堿減輕幽門螺桿菌誘導(dǎo)的人胃黏膜上皮細(xì)胞損傷*

陳寧南， 萬 強(qiáng)

(1江西省人民醫(yī)院急診科， 2江西中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院心血管病科， 江西 南昌 330006)

小檗堿減輕幽門螺桿菌誘導(dǎo)的人胃黏膜上皮細(xì)胞損傷*

陳寧南1， 萬 強(qiáng)2△

(1江西省人民醫(yī)院急診科，2江西中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院心血管病科， 江西 南昌 330006)

目的探討小檗堿(Ber)對幽門螺桿菌(Hp)誘導(dǎo)的人胃黏膜上皮細(xì)胞GES-1損傷的保護(hù)作用及機(jī)制。方法采用Hp感染GES-1細(xì)胞，加入小檗堿(5，10和20 μmol/L)和細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶(ERK1/2)抑制劑PD98059(20 μmol/L)共培養(yǎng)。MTT法檢測細(xì)胞活力，流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡,ELISA法檢測細(xì)胞白細(xì)胞介素(IL)-1β及IL-8的水平，比色法檢測細(xì)胞乳酸脫氫酶(LDH)活性并以Western blot法檢測細(xì)胞Bax、Bcl-2、p-ERK1/2的蛋白水平。結(jié)果與對照組比較，Hp可抑制GES-1細(xì)胞活力、促進(jìn)GES-1細(xì)胞凋亡、誘導(dǎo)GES-1細(xì)胞分泌IL-1β和IL-8、增加LDH活性、增加GES-1細(xì)胞內(nèi)p-ERK1/2及Bax蛋白水平并降低Bcl-2蛋白水平，差異均有統(tǒng)計學(xué)顯著性(P<0.05)；與Hp感染組比較，中、高劑量小檗堿均可逆轉(zhuǎn)Hp對GES-1細(xì)胞活力、細(xì)胞凋亡、細(xì)胞IL-1β及IL-8分泌、LDH活性和GES-1細(xì)胞內(nèi)p-ERK1/2、Bax及Bcl-2蛋白水平的影響，差異均有統(tǒng)計學(xué)顯著性(P<0.05)；與高劑量小檗堿組比較，PD98059聯(lián)合小檗堿可進(jìn)一步逆轉(zhuǎn)Hp對GES-1細(xì)胞上述指標(biāo)的影響，差異均有統(tǒng)計學(xué)顯著性(P<0.05)。結(jié)論小檗堿可通過抗炎、增加細(xì)胞活力和抗凋亡來減輕Hp誘導(dǎo)的GES-1細(xì)胞損傷，其機(jī)制可能與抑制ERK1/2通路有關(guān)。

小檗堿； 幽門螺桿菌； 細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶1/2； 人胃黏膜上皮細(xì)胞

幽門螺桿菌(Helicobacterpylori，Hp)是革蘭陰性微需氧菌，生存于胃和十二指腸內(nèi)，感染后誘發(fā)的胃黏膜慢性炎癥可損傷胃黏膜上皮細(xì)胞，發(fā)展為慢性活動性胃炎、胃和十二指腸潰瘍，甚至參與胃淋巴瘤與胃癌的形成[1]。臨床上多使用2種抗生素加質(zhì)子泵抑制劑的三聯(lián)療法治療Hp感染，但長期使用可顯著增加Hp耐藥，導(dǎo)致Hp根除率下降[2]。中醫(yī)藥對于慢性胃炎的療效確切且副作用低，因此，積極研究并開發(fā)抑制Hp的中藥或單體具有重要的醫(yī)學(xué)價值。小檗堿(berberine，Ber)又名黃連素，是從黃連、黃柏和伏牛花等中藥植物中提取的異喹啉生物堿，體外對多種革蘭陽性及陰性菌均具顯著的抑菌作用，臨床廣泛用于治療胃腸感染和細(xì)菌性痢疾等消化性疾病[3]。研究表明，小檗堿可顯著抑制由Hp感染導(dǎo)致的慢性胃炎的形成[4]，但具體分子機(jī)制有待進(jìn)一步研究。細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶1/2(extracellular signal-regulated kinase 1/2，ERK1/2)信號通路參與了調(diào)控炎癥反應(yīng)、細(xì)胞增殖及細(xì)胞凋亡等多種生理及病理進(jìn)程[5]。為進(jìn)一步探討小檗堿在慢性胃炎中的可能作用靶點，本研究采用Hp感染人胃黏膜上皮GES-1細(xì)胞，加入小檗堿及ERK1/2選擇性阻滯劑PD98059干預(yù)，探討小檗堿對Hp誘導(dǎo)GES-1細(xì)胞損傷的影響及可能機(jī)制，為小檗堿的臨床應(yīng)用提供實驗依據(jù)。

材 料 和 方 法

1 主要試劑與儀器

GES-1細(xì)胞株購于上海生博生物醫(yī)藥科技有限公司；鹽酸小檗堿(HPLC≥98%)和MTT干粉均購自Sigma；Hp菌株購自ATCC細(xì)胞庫；RPMI-1640培養(yǎng)基購自Invitrogen；PD98059購自Tocris Bioscience；胎牛血清購自Gibco；抗Bax、Bcl-2、t-ERK1/2、p-ERK1/2及β-actin抗體均購自Abcam；白細(xì)胞介素(interleukin，IL)-1β和IL-8 ELISA試劑盒均購自eBioscience；乳酸脫氫酶(lactic dehydrogenase，LDH)試劑盒購自南京建成生物工程研究所；Annexin V-FITC細(xì)胞凋亡試劑盒購自Beyotime。ST16型冷凍高速離心機(jī)購自Thermo；MK3型酶標(biāo)儀、164-5050型電泳儀和2401型CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱均購自Bio-Rad；FACSCalibur型流式細(xì)胞儀購自BD；DMI3000B型熒光倒置顯微鏡購自Leica。

2 方法

2.1Hp與GES-1細(xì)胞共培養(yǎng)及實驗分組 將GES-1細(xì)胞接種至培養(yǎng)皿，置于含10% 胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基，于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，細(xì)胞融合80%時傳代。以無菌PBS液重懸Hp，2 000 r/min離心5 min，棄上清液后加含2% 胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基,調(diào)整Hp菌液濃度為1×1012CFU/L。GES-1細(xì)胞分為6組：(1)對照(control)組：只加RPMI-1640培養(yǎng)基；(2)Hp感染(Hp)組：加Hp菌液，以細(xì)菌∶細(xì)胞為200∶1的比例共培養(yǎng)24 h；(3)～(5)分別為小檗堿低劑量(Hp+Ber 5 μmol/L)、小檗堿中劑量(Hp+Ber 10 μmol/L)和小檗堿高劑量(Hp+Ber 20 μmol/L)組：分別以小檗堿(5、10和20 μmol/L)[6]預(yù)處理GES-1細(xì)胞30 min后,再加Hp菌液，以細(xì)菌∶細(xì)胞為200∶1的比例(預(yù)實驗結(jié)果)共培養(yǎng)24 h；(6)PD98059組：以小檗堿20 μmol/L預(yù)處理GES-1細(xì)胞30 min后，加20 μmol/L PD98059[7]處理細(xì)胞30 min,再加Hp菌液以細(xì)菌∶細(xì)胞為200∶1的比例共培養(yǎng)24 h。

2.2MTT法檢測細(xì)胞活力 將GES-1細(xì)胞按每孔1×104個接種至96孔板，每組設(shè)6個復(fù)孔，24 h后撤去血清，加入5 g/L的MTT液20 μL，培養(yǎng)4 h，棄上清液后，每孔加DMSO 150 μL,振蕩溶解10 min，以570 nm為測定波長檢測吸光度(A)值。細(xì)胞活力抑制率(%)=[1-(實驗組A值/對照組A值)]×100%。

2.3流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡 將GES-1細(xì)胞按每孔2×105個接種至12孔板，24 h后換無血清的RPMI-1640培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h，1 000 r/min離心5 min，加Annexin V-FITC及PI按說明書方法孵育，1 h內(nèi)用流式細(xì)胞儀檢測GES-1細(xì)胞的凋亡率。

2.4LDH活性及IL-1β和IL-8水平的測定 將GES-1細(xì)胞以1×104個接種至培養(yǎng)皿，收集上清液，用比色法測LDH活性，ELISA檢測IL-1β及IL-8水平，檢測按照試劑盒說明書操作。

2.5Western blot檢測Bax、Bcl-2和p-ERK1/2蛋白的表達(dá) 提取GES-1細(xì)胞總蛋白，BCA法測蛋白濃度，100 ℃變性蛋白5 min，凝膠電泳，蛋白半干轉(zhuǎn)印至PVDF膜，5%脫脂牛奶封閉2 h，加相應(yīng) I 抗(1∶1 000)于4 ℃孵育后，再加 II 抗(1∶2 000)于室溫下孵育，ECL顯影并拍照。Quantity One軟件條帶分析灰度，以β-actin作內(nèi)參照。

3 統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，實驗數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，多組間比較采用單因素方差分析(one-way ANOVA)，兩組間比較用Bonferroni法，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1 小檗堿及PD98059對GES-1細(xì)胞活力的影響

與對照組比較，Hp可顯著抑制GES-1細(xì)胞活力，差異有統(tǒng)計學(xué)顯著性(P<0.05)；與Hp感染組比較，小檗堿中、高劑量干預(yù)均可逆轉(zhuǎn)Hp抑制GES-1細(xì)胞活力的作用，差異均有統(tǒng)計學(xué)顯著性(P<0.05)；與小檗堿高劑量組比較，加入PD98059干預(yù)可進(jìn)一步逆轉(zhuǎn)Hp抑制GES-1細(xì)胞活力的作用，差異有統(tǒng)計學(xué)顯著性(P<0.05)，見表 1。

2 小檗堿及PD98059對GES-1細(xì)胞凋亡的影響

與對照組比較，Hp可顯著誘導(dǎo)GES-1細(xì)胞凋亡，差異有統(tǒng)計學(xué)顯著性(P<0.01)；與Hp感染組比較，小檗堿中、高劑量干預(yù)均可逆轉(zhuǎn)Hp誘導(dǎo)的GES-1細(xì)胞凋亡，差異均有統(tǒng)計學(xué)顯著性(P<0.05)；與小檗堿高劑量組比較，加入PD98059干預(yù)可進(jìn)一步逆轉(zhuǎn)Hp對GES-1細(xì)胞凋亡的影響，差異有統(tǒng)計學(xué)顯著性(P<0.05)，見表1。

表1小檗堿及PD98059對GES-1細(xì)胞活力及凋亡的影響

Table 1. The effects of berberine and PD98059 on the viability and apoptotic rate of GES-1 cells (Mean±SD.n=3)

GroupInhibitoryrateofcellactivity(%)Apoptoticrate(%)Control-10.53±2.18Hp41.63±6.14*36.47±5.52**Hp+Ber5μmol/L40.55±6.0235.91±5.97Hp+Ber10μmol/L28.13±5.19#28.13±4.48#Hp+Ber20μmol/L21.69±4.52#22.63±4.71#PD9805915.34±4.27#▲14.12±3.29#▲

*P<0.05,**P<0.01vscontrol group;#P<0.05vsHp group;▲P<0.05vsHp+Ber 20 μmol/L group.

3 小檗堿及PD98059對GES-1細(xì)胞LDH活性及IL-1β和IL-8水平的影響

與對照組比較，Hp可增加GES-1細(xì)胞上清中IL-1β和IL-8水平并增加LDH活性，差異均有統(tǒng)計學(xué)顯著性(P<0.05)；與Hp感染組比較，小檗堿中、高劑量干預(yù)均可逆轉(zhuǎn)Hp對GES-1細(xì)胞上清中IL-1β及IL-8水平及LDH活性的影響，差異均有統(tǒng)計學(xué)顯著性(P<0.05)；與小檗堿高劑量組比較，加入PD98059干預(yù)可進(jìn)一步增強(qiáng)小檗堿的作用，IL-1β、IL-8水平及LDH活性進(jìn)一步降低，差異均有統(tǒng)計學(xué)顯著性(P<0.05)，見表2。

表2小檗堿及PD98059對GES-1細(xì)胞LDH活性及IL-1β、IL-8水平的影響

Table 2. The effects of berberine and PD98059 on LDH activity, IL-1β and IL-8 levels of GES-1 cells (Mean±SD.n=3)

GroupLDH(U/L)IL-1β(ng/L)IL-8(ng/L)Control462.73±51.534.47±1.3620.76±6.61 Hp1481.27±130.62*90.13±9.04*215.88±23.73*Hp+Ber5μmol/L1476.52±137.8388.78±9.32212.50±21.85Hp+Ber10μmol/L1206.18±125.23#61.27±8.52#168.03±17.63#Hp+Ber20μmol/L871.86±103.24#37.38±7.98#104.74±12.47#PD98059609.54±82.13#▲20.42±5.59#▲59.36±10.71#▲

*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsHp group;▲P<0.05vsHp+Ber 20 μmol/L group.

4 小檗堿及PD98059對GES-1細(xì)胞中Bax、Bcl-2和p-ERK1/2蛋白水平的影響

與對照組比較，Hp可增加GES-1細(xì)胞中Bax及p-ERK1/2的蛋白水平，并降低Bcl-2的蛋白水平，差異均有統(tǒng)計學(xué)顯著性(P<0.05)；與Hp感染組比較，小檗堿中、高劑量干預(yù)均可逆轉(zhuǎn)Hp對GES-1細(xì)胞中Bax、p-ERK1/2和Bcl-2蛋白水平的影響，差異均有統(tǒng)計學(xué)顯著性(P<0.05)；與小檗堿高劑量組比較，加入PD98059干預(yù)可進(jìn)一步增強(qiáng)小檗堿的作用，差異均有統(tǒng)計學(xué)顯著性(P<0.05)，見圖1。

討 論

1983年,Marshall等[8]利用螺桿菌培養(yǎng)技術(shù)從慢性活動性胃炎患者的胃黏膜組織中首次成功分離Hp。Hp是目前所知唯一能在人胃中生存的微生物種類[9]。Hp感染后產(chǎn)生的尿素酶、黏液酶、脂多糖、磷脂酶、蛋白酶和過氧化物歧化酶等致病因子，可降低正常胃黏膜分泌的黏液中黏蛋白含量, 破壞黏液完整性，從而破壞胃黏膜屏障，導(dǎo)致慢性胃炎的發(fā)生[10]。

Hp還可破壞胃黏膜上皮的完整性。Hp感染后導(dǎo)致胃黏膜上皮細(xì)胞增殖與凋亡的平衡紊亂，可引起慢性胃炎和消化性潰瘍等相關(guān)疾病的發(fā)生。Bax和Bcl-2是bcl-2基因家族中對于細(xì)胞凋亡起了調(diào)控作用的重要成員。bax是促凋亡基因，位于細(xì)胞質(zhì)，可直接結(jié)合到線粒體膜上，改變細(xì)胞膜通透性，引起細(xì)胞色素C釋放并激活caspases家族,從而促進(jìn)細(xì)胞凋亡；bcl-2是抑凋亡基因，可通過抑制細(xì)胞線粒體膜電位的下降，減少細(xì)胞色素C釋放進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)，從而抑制細(xì)胞凋亡[11-13]。本研究中MTT檢測結(jié)果顯示，Hp可顯著抑制GES-1細(xì)胞活力；流式細(xì)胞術(shù)檢測結(jié)果顯示Hp可增加GES-1細(xì)胞凋亡；Western blot檢測結(jié)果顯示Hp可增加GES-1細(xì)胞內(nèi)Bax蛋白水平并減少Bcl-2蛋白水平，證實Hp可抑制GES-1細(xì)胞生長，并通過調(diào)控Bax及Bcl-2水平而促進(jìn)GES-1細(xì)胞凋亡。

Figure 1. The effects of berberine and PD98059 on the protein levels of Bax, Bcl-2 and p-ERK1/2 in the GES-1 cells. A: control group; B: Hp group; C: Hp+Ber 5 μmol/L group; D: Hp+Ber 10 μmol/L group; E: Hp+Ber 20 μmol/L group; F: PD98059 group. Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsHp group;▲P<0.05vsHp+Ber 20 μmol/L group.

圖1小檗堿及PD98059對GES-1細(xì)胞Bax、Bcl-2和p-ERK1/2蛋白水平的影響

Hp感染可誘導(dǎo)胃黏膜上皮炎癥細(xì)胞的浸潤，釋放IL-1β和IL-8等前炎癥介質(zhì)，IL-1β和IL-8觸發(fā)的級聯(lián)反應(yīng)可進(jìn)一步導(dǎo)致細(xì)胞間黏附分子1和上皮細(xì)胞黏附分子過度活化，引起胃黏膜固有層中性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞和單核細(xì)胞等聚集從而促進(jìn)慢性胃炎的發(fā)生[14]。LDH是一種存在于機(jī)體所有組織細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)內(nèi)的糖酵解酶，當(dāng)細(xì)胞受到損傷時細(xì)胞質(zhì)內(nèi)氧依賴性酶及細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)均發(fā)生改變，增加細(xì)胞膜通透性，使細(xì)胞外液LDH漏出量增加，因此LDH活性的高低可反映細(xì)胞損傷的程度[15]。本研究中ELISA法及比色法檢測結(jié)果顯示，Hp可增加GES-1細(xì)胞IL-1β及IL-8水平并增加LDH活性，證實Hp可誘導(dǎo)炎癥導(dǎo)致GES-1細(xì)胞損傷。

既往研究表明，小檗堿在體內(nèi)及體外均具有較強(qiáng)的抗Hp感染作用[4]。隨著抗生素在Hp根除治療中廣泛應(yīng)用，Hp多重耐藥的發(fā)生率日益上升。主動外排系統(tǒng)hefA基因的高表達(dá)可導(dǎo)致體外人工誘導(dǎo)Hp多重耐藥的發(fā)生[16]，小檗堿可通過下調(diào)hefA mRNA的表達(dá)，顯著減輕四環(huán)素和阿莫西林等抗生素引起的Hp多重耐藥的發(fā)生[17]。ERK1/2信號通路是細(xì)胞絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)通路家族的重要成員，可以被生長因子、離子射線和過氧化氫等激活，參與了調(diào)控炎癥反應(yīng)、細(xì)胞增殖及凋亡等多種生理及病理進(jìn)程[5]。PD98059是常用的ERK1/2高效選擇性阻滯劑，能特異地抑制MAPK激酶介導(dǎo)的MAPK活化，不會直接抑制ERK1/2[18]。本研究結(jié)果表明，Hp可顯著增加GES-1細(xì)胞中p-ERK1/2的蛋白水平；小檗堿干預(yù)后可顯著逆轉(zhuǎn)Hp對GES-1細(xì)胞的影響；加入PD98059干預(yù)可進(jìn)一步增強(qiáng)小檗堿的藥理作用，提示小檗堿減輕Hp誘導(dǎo)的GES-1細(xì)胞損傷的機(jī)制可能與抑制ERK1/2通路有關(guān)。

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Effect of berberine on Helicobacter pylori-induced human gastric epithe-lial cells injury

CHEN Ning-nan1, WAN Qiang2

(1EmergencyDepartment,JiangxiProvincialPeople’sHospital,2DepartmentofMedicalCardiology,TheAffiliatedHospitalofJiangxiUniversityofTraditionalChineseMedicine,Nanchang330006,China.E-mail:wanqiang109559140@163.com)

AIM: To investigate the effect of berberine (Ber) onHelicobacterpylori(Hp)-induced human gastric epithelial cells (GES-1) injury and the underlying mechanism.METHODSBerberine (5, 10 and 20 μmol/L) and PD98059 (20 μmol/L), a selective inhibitor of extracellular regulated protein kinases (ERK)1/2 signaling pathway, were added to Hp-infected GES-1 cells. The cell activity and apoptosis, the levels of interleukin (IL)-1β and IL-8, lactic dehydrogenase (LDH) activity and the protein levels of Bax, Bcl-2 and p-ERK1/2 in the GES-1 cells were determined by MTT assay, flow cytometry, ELISA, colorimetry and Western blot, respectively.RESULTSCompared with control group, Hp significantly inhibited the cell activity, increased the apoptotic rate, LDH activity, IL-1β and IL-8 levels, the Bax and p-ERK1/2 protein levels but decreased the Bcl-2 protein level in GES-1 cells (P<0.05). However, these effects of Hp were reversed by berberine at medium-dose and high-dose, as compared with the Hp-infected GES-1 cells (P<0.05). Moreover, the protective effects of berberine were significantly enhanced by the co-incubation of berberine with PD98059, as compared with the berberine at higher dose (P<0.05).CONCLUSIONBerberine may attenuate Hp-induced human gastric epithelial GES-1 cells injury by anti-inflammation, promoting cell growth and anti-apoptosis via the inhibition of ERK1/2 signaling pathway.

Berberine;Helicobacterpylori; Extracellular regulated protein kinase 1/2; Human gastric epithelial cells

1000- 4718(2017)12- 2283- 04

2017- 06- 21

2017- 08- 02

國家自然科學(xué)基金資助項目(No. 81660770)；江西省自然科學(xué)基金資助項目(No. 20161BAB215256)；江西省衛(wèi)生計生委科技計劃(No. 20171105)；江西省衛(wèi)生計生委中醫(yī)藥科研課題(No. 2016A083)

△通訊作者 Tel: 0791-86360490; E-mail: wanqiang109559140@163.com

R285.5; R363

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2017.12.028

(責(zé)任編輯： 盧 萍， 余小慧)