EphA2調(diào)控結(jié)直腸癌細(xì)胞耐藥的初步研究

李 霞， 馬 超， 孔令偉， 李 慧， 許聰聰， 李軍峰

(1山東省棗莊礦業(yè)集團(tuán)棗莊醫(yī)院內(nèi)六科， 山東 棗莊 277100； 2山東大學(xué)齊魯醫(yī)院病理科， 山東 濟(jì)南 250012)

EphA2調(diào)控結(jié)直腸癌細(xì)胞耐藥的初步研究

李 霞1， 馬 超2△， 孔令偉1， 李 慧1， 許聰聰1， 李軍峰1

(1山東省棗莊礦業(yè)集團(tuán)棗莊醫(yī)院內(nèi)六科， 山東 棗莊 277100；2山東大學(xué)齊魯醫(yī)院病理科， 山東 濟(jì)南 250012)

目的探究Eph受體A2(EphA2)在結(jié)直腸癌細(xì)胞化療耐藥中的作用及相關(guān)機(jī)制。方法Western blot及real-time PCR檢測(cè)人結(jié)腸癌細(xì)胞株LoVo及結(jié)腸癌耐藥細(xì)胞株LoVo/5-FU中EphA2的表達(dá)情況。轉(zhuǎn)染EphA2 siRNA干擾結(jié)腸癌耐藥細(xì)胞株LoVo/5-FU中EphA2的表達(dá)，CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞對(duì)化療藥物的敏感性，劃痕實(shí)驗(yàn)及Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞遷移及侵襲能力的變化，Western blot檢測(cè)上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)及相關(guān)信號(hào)通路分子的蛋白水平。結(jié)果耐藥細(xì)胞株LoVo/5-FU中EphA2的mRNA及蛋白表達(dá)水平均明顯高于親本細(xì)胞株(P<0.05)；并且在親本細(xì)胞株LoVo中，EphA2的蛋白表達(dá)水平隨著5-FU濃度的增加有升高趨勢(shì)。沉默EphA2可降低結(jié)腸癌耐藥細(xì)胞株LoVo/5-FU的細(xì)胞活力，增加其對(duì)化療藥物的敏感性，并抑制細(xì)胞的侵襲遷移；同時(shí)上調(diào)細(xì)胞中上皮細(xì)胞標(biāo)志物E-cadherin和β-catenin的表達(dá)并下調(diào)間充質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物N-cadherin和vimentin的表達(dá)，可抑制結(jié)腸癌耐藥細(xì)胞株LoVo/5-FU的EMT進(jìn)程。此外，干擾EphA2的表達(dá)之后，Notch和Snail的表達(dá)也明顯降低。結(jié)論沉默EphA2可部分恢復(fù)結(jié)腸癌耐藥細(xì)胞株LoVo/5-FU對(duì)化療藥物的敏感性，其機(jī)制可能與抑制細(xì)胞侵襲和遷移、同時(shí)通過(guò)Notch/Snail信號(hào)通路影響細(xì)胞的EMT進(jìn)程有關(guān)。

Eph受體A2； 耐藥性； 上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化； 結(jié)直腸癌； Notch/Snail信號(hào)通路

結(jié)直腸癌是消化系統(tǒng)常見(jiàn)腫瘤之一，目前主要的治療手段依然是放療、化療及手術(shù)治療。以FOLFIRI和FOLFOX為標(biāo)準(zhǔn)的一線化療方案依然是進(jìn)展期結(jié)直腸癌的主要治療手段，但是化療藥物的長(zhǎng)期應(yīng)用會(huì)引起腫瘤細(xì)胞對(duì)其產(chǎn)生耐受性，進(jìn)而影響治療效果及患者生存率[1-2]。研究表明，腫瘤細(xì)胞的耐藥性包括原發(fā)性和獲得性2種，但更為常見(jiàn)的是獲得性化療耐藥產(chǎn)生，通常是由于化療藥物的長(zhǎng)期應(yīng)用而誘導(dǎo)產(chǎn)生，且尤為棘手的是在這種情況下，腫瘤細(xì)胞會(huì)對(duì)其它抗腫瘤藥物產(chǎn)生交叉耐藥。因此，有關(guān)結(jié)直腸癌化療耐藥的研究具有重要的臨床意義。

人Eph受體A2(Eph receptor A2，EphA2)基因定位于1p36.1，編碼一個(gè)含有976個(gè)氨基酸殘基的多肽，隸屬于Eph受體家族，而該家族又是受體酪氨酸激酶(receptor tyrosine kinases，RTKs)中最大的一個(gè)亞族，廣泛參與胚胎發(fā)育、炎癥反應(yīng)和血管形成等病理生理過(guò)程[3-4]。近來(lái)，EphA2在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的作用備受研究者關(guān)注，大量研究發(fā)現(xiàn)，在包括胃癌[5]、直腸癌[6]、乳腺癌[7]和惡性膠質(zhì)瘤[8]等多種實(shí)體腫瘤中都出現(xiàn)Eph受體家族的異常表達(dá)；同時(shí)有研究表明，EphA2可促進(jìn)結(jié)直腸癌的侵襲和遷移，進(jìn)而影響患者預(yù)后[9-10]，但是EphA2在結(jié)直腸癌化療耐藥中的作用并沒(méi)有明確的闡釋。本文通過(guò)EphA2 siRNA干擾技術(shù)，系統(tǒng)研究了EphA2在結(jié)直腸癌化療耐藥中的作用及其相關(guān)機(jī)制。

材 料 和 方 法

1 實(shí)驗(yàn)材料

胎牛血清、RPMI-1640培養(yǎng)基及Opti-MEM培養(yǎng)基均購(gòu)自HyClone；抗EphA2、上皮鈣黏素(E-cadhe-rin)、 β-聯(lián)蛋白(β-catenin)、神經(jīng)鈣黏素(N-cadherin)、波形蛋白(vimentin)、 Notch、Snail及β-actin抗體購(gòu)自Abcam；CCK-8細(xì)胞活力及增殖檢測(cè)試劑盒購(gòu)自廣州奕源生物技術(shù)有限公司； EphA2 siRNA及其陰性對(duì)照siRNA購(gòu)自Santa Cruz；干擾試劑和SYBR Green I Real-Time PCR Kit購(gòu)自上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司。倒置相差顯微鏡購(gòu)自O(shè)lympus；7500型實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀購(gòu)自ABI；Transwell小室購(gòu)自Corning；Matrigel購(gòu)自BD。

2 方法

2.1細(xì)胞培養(yǎng) 結(jié)腸癌細(xì)胞株LoVo和結(jié)腸癌耐藥細(xì)胞株LoVo/5-FU購(gòu)自中科院上海細(xì)胞庫(kù)，為本實(shí)驗(yàn)室自行傳代凍存。培養(yǎng)基選用含10%胎牛血清的RPMI-1640完全培養(yǎng)基，將細(xì)胞置于37 ℃、飽和濕度、5% CO2的培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。每2 d換液1次，細(xì)胞生長(zhǎng)至90%融合時(shí)可用0.25%胰酶消化后按1∶3的比例傳代。

2.2Real-time PCR檢測(cè)mRNA的表達(dá) 細(xì)胞總RNA的抽提參考Trizol一步法。用紫外吸收法測(cè)定mRNA的純度和濃度后，取2 μg總RNA在逆轉(zhuǎn)錄酶的作用下逆轉(zhuǎn)錄至終體積為20 μL，而后采用SYBR Green實(shí)時(shí)熒光PCR的方法檢測(cè)mRNA的表達(dá)。EphA2的正向引物為5’-GAGAAGGATGGCGAGTTCAG-3’，反向引物為5’-TCAGACACCTTGCAGACCAG-3’；β-actin作為內(nèi)參照，正向引物為5’-ACAGAGCCTCGCCTTTGCCGATC-3’，反向引物為5’-ATCCTTCTGACCCATGCCCACCA-3’。 PCR反應(yīng)體系包括1 μL逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物、10 μL SYBR Green PCR Master Mix和100 nmol/L正反向引物，總體積為25 μL。循環(huán)條件為：95 ℃孵育5 min； 95 ℃ 10 s， 60 ℃ 30 s，40個(gè)循環(huán)。采用2-ΔΔCt法分析mRNA相對(duì)表達(dá)量。

2.3CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞對(duì)化療藥物的敏感性 采用CCK-8法檢測(cè)化療藥物對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞的半數(shù)抑制濃度(IC50)。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞以每孔1×104的密度接種于96孔板中，待細(xì)胞長(zhǎng)至90%融合進(jìn)行同步化處理，并加入不同濃度的5-氟尿嘧啶(5-fluorouracil，5-FU；終濃度分別為6.25、12.5、25、50、100、200和400 mg/L)、奧沙利鉑(oxaliplatin；終濃度分別為1、2、4、8、16、32和64 mg/L)或伊立替康(irinotecan；終濃度分別為1、2、4、8、16、32和64 mg/L)，繼續(xù)培養(yǎng)46 h，每孔加入100 μL CCK-8試劑并置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育2 h，測(cè)定450 nm波長(zhǎng)處的吸光度(A)值，據(jù)此計(jì)算細(xì)胞的生存率及各種藥物的IC50。

2.4siRNA轉(zhuǎn)染 取對(duì)數(shù)期細(xì)胞，常規(guī)消化后接種于6孔板中，待細(xì)胞生長(zhǎng)至60%～80%融合后同步化處理12 h，然后進(jìn)行siRNA轉(zhuǎn)染。實(shí)驗(yàn)分為空白對(duì)照(control)組、陰性對(duì)照(negative control siRNA，Neg)組和siRNA轉(zhuǎn)染(EphA2 siRNA，siRNA)組。將陰性對(duì)照siRNA和EphA2 siRNA溶解于Opti-MEM培養(yǎng)基中，室溫孵育5 min，同時(shí)另取Lipofectamine 2000加入Opti-MEM培養(yǎng)基中室溫孵育5 min，然后將兩者輕柔混合，室溫靜置20 min。并將上述轉(zhuǎn)染混合物加入各組細(xì)胞，置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6 h，將培養(yǎng)基更換為正常細(xì)胞培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)48 h。提取細(xì)胞蛋白測(cè)定轉(zhuǎn)染效率并進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)分析。

2.5劃痕實(shí)驗(yàn) 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞接種于6孔板中，待細(xì)胞生長(zhǎng)至90%融合時(shí)，用10 μL的槍頭(預(yù)先消毒)按垂直方向劃痕，而后用PBS輕輕沖洗2遍后，加入新的完全培養(yǎng)基，置于倒置相差顯微鏡下觀察細(xì)胞的劃痕修復(fù)過(guò)程。觀察時(shí)長(zhǎng)24 h，其中每隔10 min進(jìn)行拍照記錄。

2.6Transwell實(shí)驗(yàn) 處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞經(jīng)胰酶消化后，500×g離心收集細(xì)胞，而后加入新鮮的培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度為2×108/L，將細(xì)胞接種至Transwell小室的上室中，Transwell小室的下室內(nèi)則加入完全培養(yǎng)基。處理完成后將培養(yǎng)板置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)6 h。取出培養(yǎng)板并用PBS沖洗3次，每次5 min，然后用棉簽擦除上室表面的細(xì)胞。經(jīng)體積分?jǐn)?shù)為90%的乙醇固定后加0.1%的結(jié)晶紫染色，PBS再次漂洗細(xì)胞，最后置于倒置相差顯微鏡下觀察并計(jì)數(shù)染色細(xì)胞的數(shù)目(每組細(xì)胞計(jì)3個(gè)視野并取其均值)。

2.7Western blot分析 冰上裂解并離心收集各組細(xì)胞蛋白樣品，采用BCA蛋白定量試劑盒進(jìn)行蛋白定量后，調(diào)整各組上樣量為60 μg并加入4倍體積的上樣緩沖液，98 ℃水浴變性5 min。8% SDS-PAGE至溴酚藍(lán)跑出凝膠，將凝膠中的蛋白電轉(zhuǎn)至PVDF膜(約90 min)。依照試劑盒說(shuō)明加5%脫脂牛奶室溫封閉1 h，加入抗EphA2、E-cadherin、β-catenin、 N-cadherin、 vimentin、 Notch、Snail及β-actin單克隆抗體，4 ℃孵育過(guò)夜；復(fù)溫后，TBST洗滌3次，每次5 min。分別加入抗HRP標(biāo)記的 II 抗，室溫孵育1.5 h，TBST洗滌3次，每次10 min。于暗室中將PVDF膜的蛋白面浸入HRP-ECL發(fā)光液中激發(fā)熒光，壓X膠片并沖洗膠片。使用ImageJ進(jìn)行灰度分析以示蛋白表達(dá)情況。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 13.0標(biāo)準(zhǔn)版統(tǒng)計(jì)軟件包行數(shù)據(jù)分析，所有數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示。兩組計(jì)量資料的組間差異采用t檢驗(yàn)，多組計(jì)量資料行單因素方差分析，兩兩比較采用Bonferroni校正的t檢驗(yàn)。 計(jì)數(shù)資料的比較采用χ2檢驗(yàn)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 EphA2的表達(dá)與結(jié)腸癌細(xì)胞化療耐藥之間的關(guān)系

我們首先檢測(cè)了結(jié)腸癌耐藥細(xì)胞株LoVo/5-FU及其親本細(xì)胞株LoVo對(duì)不同化療藥物的IC50，結(jié)果證明與親本株LoVo比較，LoVo/5-FU對(duì)5-FU的耐藥性明顯增強(qiáng)(P<0.05)，而且對(duì)奧沙利鉑和伊立替康出現(xiàn)了交叉耐藥，見(jiàn)表1。我們同時(shí)還檢測(cè)了這2株細(xì)胞中EphA2的mRNA及蛋白表達(dá)情況，結(jié)果顯示，耐藥細(xì)胞株LoVo/5-FU中EphA2的mRNA及蛋白表達(dá)水平均明顯高于親本細(xì)胞株；并且在親本細(xì)胞株LoVo中，EphA2的蛋白表達(dá)水平隨著5-FU濃度的增加呈增加趨勢(shì)(P<0.05)，見(jiàn)圖1。該結(jié)果提示EphA2的表達(dá)可能與結(jié)腸癌化療耐藥之間存在一定的正相關(guān)關(guān)系。

表1 化療藥物對(duì)LoVo和LoVo/5-FU細(xì)胞的IC50

*P<0.05vsLoVo.

2 干擾EphA2的表達(dá)對(duì)耐藥細(xì)胞株LoVo/5-FU化療敏感性的影響

為進(jìn)一步證明EphA2的表達(dá)與結(jié)腸癌化療耐藥之間的相互關(guān)系，我們?cè)谀退幖?xì)胞株LoVo/5-FU中轉(zhuǎn)染siRNA，干擾EphA2的表達(dá)，并檢測(cè)其化療敏感性的變化。在LoVo/5-FU中轉(zhuǎn)染EphA2 siRNA后，EphA2的表達(dá)明顯下調(diào)(P<0.05)，見(jiàn)圖2A；同時(shí)CCK-8的結(jié)果顯示，在LoVo/5-FU細(xì)胞中干擾EphA2的表達(dá)可顯著提高細(xì)胞對(duì)5-FU的敏感性，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)圖2B。

3 干擾EphA2的表達(dá)對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的影響

我們觀察了干擾EphA2對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)能力的影響，結(jié)果顯示，在LoVo/5-FU細(xì)胞中干擾EphA2的表達(dá)可顯著抑制細(xì)胞活力(P<0.05)，見(jiàn)圖3A。細(xì)胞生存狀況分析顯示，干擾EphA2后細(xì)胞數(shù)量無(wú)明顯變化，但在48 h及72 h時(shí)，低倍顯微鏡(×100)下可明顯看出部分細(xì)胞貼壁附著能力下降，高倍鏡(×400)下觀察可見(jiàn)72 h細(xì)胞形態(tài)由長(zhǎng)梭形轉(zhuǎn)變?yōu)椴灰?guī)則形態(tài)，并有偽足伸出，部分細(xì)胞胞漿中可見(jiàn)顆粒增多，見(jiàn)圖3B。以上結(jié)果提示干擾EphA2可抑制細(xì)胞生長(zhǎng)。

4 干擾EphA2的表達(dá)對(duì)細(xì)胞遷移的影響

本實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步檢測(cè)了干擾EphA2對(duì)細(xì)胞遷移能力的影響。劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在LoVo/5-FU細(xì)胞中干擾EphA2的表達(dá)可顯著抑制細(xì)胞損傷修復(fù)能力(P<0.05)，見(jiàn)圖4A。Transwell實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，干擾EphA2的表達(dá)后細(xì)胞的遷移能力明顯降低(P<0.05)，見(jiàn)圖4B。上述結(jié)果提示干擾EphA2可抑制細(xì)胞遷移。

Figure 1. The relationship between EphA2 expression and drug resistance of colorectal cancer cells. A: the mRNA expression level of EphA2 in LoVo and LoVo/5-FU cells; B: the protein expression level of EphA2 in LoVo and LoVo/5-FU cells; C: EphA2 expression increased in a dose-dependent manner in LoVo cells treated with 5-FU. Mean±SD.n=6.*P<0.05vsLoVo;#P<0.05vs0 mg/L；△P<0.05vs10 mg/L；▲P<0.05vs15 mg/L.

圖1EphA2的表達(dá)與結(jié)腸癌細(xì)胞化療耐藥之間的關(guān)系

Figure 2. Knockdown ofEphA2 increased the sensitivity of LoVo/5-FU cells to 5-FU. A: the efficiency ofEphA2 siRNA transfection; B: knockdown ofEphA2 on the viability of LoVo/5-FU cells treated with different concentrations of 5-FU. Mean±SD.n=6.*P<0.05vscontrol group.

圖2干擾EphA2的表達(dá)可提高耐藥細(xì)胞LoVo/5-FU對(duì)5-FU的敏感性

Figure 3. The effect ofEphA2 knockdown on the growth of LoVo/5-FU cells. A: the cell viability decreased; B: the morphological changes of LoVo/5-FU cells after transfected withEphA2 siRNA for 24, 48 and 72 h. Mean±SD.n=6.*P<0.05vscontrol group.

圖3干擾EphA2的表達(dá)對(duì)LoVo/5-FU細(xì)胞生長(zhǎng)的影響

Figure 4. The effect ofEphA2 knockdown on the migration of LoVo/5-FU cells. A: the wound-healing ability decreased (×200); B: relative cell migration rate decreased (×400). Mean±SD.n=6.*P<0.05vscontrol group.

圖4干擾EphA2對(duì)LoVo/5-FU細(xì)胞遷移的影響

5 干擾EphA2的表達(dá)對(duì)細(xì)胞上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)及Notch/Snail信號(hào)通路分子蛋白水平的影響

結(jié)果所示，干擾EphA2的表達(dá)后，上皮細(xì)胞標(biāo)志物E-cadherin和β-catenin表達(dá)升高，而間充質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物 N-cadherin和vimentin的表達(dá)則明顯下降(P<0.05)；同時(shí)，Notch和Snail的蛋白表達(dá)也減少(P<0.05)，見(jiàn)圖5。這說(shuō)明干擾EphA2可能通過(guò)Notch和Snail通路抑制LoVo/5-FU細(xì)胞的EMT過(guò)程。

Figure 5. Western blot images and statistic analysis of protein expression. Mean±SD.n=6.*P<0.05vscontrol group.

圖5干擾EphA2對(duì)細(xì)胞EMT及Notch/Snail通路蛋白表達(dá)的影響

討 論

對(duì)腫瘤化療耐藥的研究通常是通過(guò)構(gòu)建耐藥細(xì)胞株來(lái)實(shí)現(xiàn)，本實(shí)驗(yàn)通過(guò)分析結(jié)腸癌耐藥細(xì)胞株LoVo/5-FU及其對(duì)照親本細(xì)胞株LoVo中EphA2的表達(dá)情況并進(jìn)一步干擾EphA2的表達(dá)來(lái)綜合評(píng)價(jià)EphA2對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞LoVo/5-FU化療耐藥性的影響，結(jié)果顯示干擾EphA2可提高耐藥細(xì)胞LoVo/5-FU對(duì)5-FU的敏感性，部分逆轉(zhuǎn)其化療耐藥。該部分結(jié)果提示EphA2確實(shí)參與調(diào)控結(jié)直腸癌細(xì)胞獲得性耐藥的產(chǎn)生。

多年來(lái)對(duì)腫瘤模型的相關(guān)研究提示，EphA2在調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)、遷移及血管形成中具有潛在的作用。在針對(duì)肝癌的研究中發(fā)現(xiàn)，過(guò)表達(dá)EphA2可逆轉(zhuǎn)miR-26b引起的增殖抑制效應(yīng)[11]。此外，EphA2還可促進(jìn)前列腺癌LNCaP細(xì)胞的增殖和遷移[12]。為進(jìn)一步了解EphA2調(diào)控結(jié)直腸癌化療耐藥的機(jī)制，我們通過(guò)siRNA干擾技術(shù)沉默耐藥細(xì)胞株LoVo/5-FU中的EphA2，并檢測(cè)細(xì)胞生長(zhǎng)狀況的變化。結(jié)果顯示，干擾EphA2的表達(dá)可顯著抑制細(xì)胞活力及細(xì)胞的遷移能力。EMT是指上皮來(lái)源的腫瘤細(xì)胞逐漸失去上皮樣特性而獲得間充質(zhì)樣特性的病理生理學(xué)過(guò)程，這一過(guò)程在腫瘤的侵襲、遷移及化療耐藥中發(fā)揮著重要的作用，并與抗腫瘤治療密切相關(guān)[13-15]。我們的研究發(fā)現(xiàn)，干擾EphA2的表達(dá)后上皮細(xì)胞標(biāo)志物E-cadherin和β-catenin表達(dá)升高，而間充質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物N-cadherin和vimentin的表達(dá)則明顯下降，說(shuō)明干擾EphA2可抑制LoVo/5-FU細(xì)胞的EMT進(jìn)程，這一作用可能是其調(diào)控細(xì)胞遷移的機(jī)制之一。而后我們進(jìn)一步探討了EphA2調(diào)控EMT可能涉及的信號(hào)通路及作用機(jī)制。Notch信號(hào)通路是一條多調(diào)控的復(fù)雜通路，在腫瘤相關(guān)的EMT過(guò)程中同樣發(fā)揮重要的作用[16-17]。本研究的檢測(cè)結(jié)果顯示，干擾EphA2可抑制Notch和Snail的表達(dá)。結(jié)果表明，EphA2對(duì)結(jié)直腸癌化療耐藥過(guò)程中EMT的影響可能與Notch/Snail信號(hào)通路有關(guān)，但是是否還有其它通路的參與及其具體的調(diào)控機(jī)制還有待進(jìn)一步的研究。

綜上所述，沉默EphA2可部分恢復(fù)結(jié)腸癌耐藥細(xì)胞株細(xì)胞LoVo/5-FU對(duì)化療藥物的敏感性，其機(jī)制可能與抑制細(xì)胞生長(zhǎng)、同時(shí)通過(guò)Notch/Snail通路影響細(xì)胞的EMT進(jìn)程及細(xì)胞遷移有關(guān)。

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Preliminary exploration for effect of EphA2 on drug resistance of colorectal carcinoma cells

LI Xia1, MA Chao2, KONG Ling-wei1, LI Hui1, XU Cong-cong1, LI Jun-feng1

(1TheSixthDepartmentofInternalMedicine,ZaozhuangHospital,ShandongZaozhuangMiningGroup,Zaozhuang277100,China;2DepartmentofPathology,QiluHospital,ShandongUniversity,Jinan250012,China.E-mail:muzi760408@sina.com)

AIM: To investigate the effect of Eph receptor A2 (EphA2) on drug resistance of colorectal carcinoma cells and its possible mechanisms.METHODSReal-time PCR and Western blot were used to detect the expression of EphA2 at mRNA and protein levels in LoVo and LoVo/5-FU cells.EphA2 siRNA was transfected to down-regulate theEphA2 expression in LoVo/5-FU cells, and the drug sensitivity was calculated by CCK-8 assay. Meanwhile, cell migration and invasion were measured by wound healing assay and Transwell assay, and the protein levels of E-cadherin, β-catenin, N-cadherin, vimentin, Notch and Snail were determined by Western blot.RESULTSThe expression of EphA2 at both mRNA and protein levels was significantly up-regulated in LoVo/5-FU cells (P<0.05). Knockdown ofEphA2 suppressed the cell viability, and migration and invasion abilities, but promoted drug sensitivity of LoVo/5-FU cells. Up-regulation of E-cadherin and β-catenin, and down-regulation of N-cadherin and vimentin were observed, indicating that the epithelial-mesenchymal transition (EMT) process was suppressed. Knockdown ofEphA2 decreased the expression levels of Notch and Snail.CONCLUSIONDown-regulation ofEphA2 partly reverses drug resistance of LoVo/5-FU cells. The mechanism may be related to suppressing cell growth, migration, invasion and EMT process via Notch/Snail signaling pathway.

Eph receptor A2; Drug resistance; Epithelial-mesenchymal transition; Colorectal carcinoma； Notch/Snail signaling pathway

1000- 4718(2017)12- 2188- 07

2017- 07- 06

2017- 10- 30

△通訊作者 Tel： 0531-82169220； E-mail： muzi760408@sina.com

R735.3； R363.2

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2017.12.012

(責(zé)任編輯： 陳妙玲， 羅 森)