剪切修復基因XPD抑制Ox-LDL誘導人臍動脈平滑肌細胞的增殖*

夏子榮， 李 青， 夏 珍， 李菊香， 洪 葵， 吳延慶， 吳清華， 程曉曙

(南昌大學第二附屬醫(yī)院心內(nèi)科， 江西 南昌 330006)

剪切修復基因XPD抑制Ox-LDL誘導人臍動脈平滑肌細胞的增殖*

夏子榮， 李 青， 夏 珍， 李菊香△， 洪 葵， 吳延慶， 吳清華， 程曉曙

(南昌大學第二附屬醫(yī)院心內(nèi)科， 江西 南昌 330006)

目的探討剪切修復基因——著色性干皮病D組基因(XPD)在氧化低密度脂蛋白(Ox-LDL)促血管平滑肌細胞增殖中的作用及機制。方法將重組質(zhì)粒pEGFP-N2/XPD利用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染人臍動脈平滑肌細胞(HUASMCs)，實驗分為空白對照組、空載質(zhì)粒pEGFP-N2組、重組質(zhì)粒pEGFP-N2/XPD組、Ox-LDL組、Ox-LDL+pEGFP-N2組和Ox-LDL+pEGFP-N2/XPD組。用MTT法和EdU法測定各組細胞的增殖率；流式細胞術檢測各組細胞周期分布；利用Western blot法檢測XPD、caspase-3、Bcl-2 和Bax 的蛋白水平。結果Western blot實驗結果發(fā)現(xiàn)，與空白對照組相比，pEGFP-N2/XPD組的XPD表達增加(P<0.05)，表明轉(zhuǎn)染成功；MTT和EdU檢測結果顯示，pEGFP-N2/XPD組的細胞增殖率較空白對照組降低(P<0.05)；與Ox-LDL組比較，Ox-LDL+pEGFP-N2/XPD組細胞增殖明顯被抑制(P<0.05)。流式細胞術的檢測結果顯示，與空白對照組比較，pEGFP-N2/XPD 組的S期細胞比例明顯減少(P<0.05)，G0/G1期細胞比例明顯增多(P<0.05)；與Ox-LDL組比較，Ox-LDL+pEGFP-N2/XPD組的S期細胞比例減少(P<0.05)，G0/G1期細胞比例明顯增多(P<0.05)。Western blot結果顯示，與對照組比較，pEGFP-N2/XPD組的cleaved caspase-3和Bax 蛋白水平增加(P<0.05)，Bcl-2蛋白表達降低(P<0.05)；與Ox-LDL組比較，Ox-LDL+pEGFP-N2/XPD組的cleaved caspase-3和Bax蛋白水平增加(P<0.01)，Bcl-2 蛋白表達降低(P<0.05)。結論XPD能抑制HUASMCs的增殖并促其凋亡，還能抑制Ox-LDL的促HUASMCs增殖作用，有可能成為抗動脈粥樣硬化治療的靶點。

著色性干皮病D組基因； 氧化低密度脂蛋白； 人臍動脈平滑肌細胞； 動脈粥樣硬化

動脈粥樣硬化(atherosclerosis，AS)是心血管疾病發(fā)生發(fā)展的重要病理基礎，血管平滑肌細胞(vascular smooth muscle cells，VSMCs)過度增殖是促進AS發(fā)生發(fā)展的一個關鍵因素。研究表明，小劑量的氧化低密度脂蛋白(oxidized low-density lipoprotein， Ox-LDL)即可直接或間接誘惑血管平滑肌細胞增殖，Ox-LDL在動脈粥樣硬化的形成過程中起著重要的作用[1]。因此，抑制血管平滑肌細胞增殖可能阻止AS的進程。著色性干皮病D組蛋白(xeroderma pigmentosum D, XPD)是轉(zhuǎn)錄因子(transcription factor，TF)ⅡH 9個亞基中的一個[2-3]。XPD可以激活DNA損傷檢控點，在核酸剪切修復中起重要作用，從而增加基因的穩(wěn)定性，進而防止基因突變和疾病的產(chǎn)生[4-5]。目前對剪切修復基因XPD的研究，主要與腫瘤的發(fā)生及核酸剪切修復途徑中基因功能的缺失密切相關[6]。XPD除了在核苷酸切除修復和轉(zhuǎn)錄過程中發(fā)揮主要作用外，還參與抑制細胞增殖與促進凋亡。因此，我們設想剪切修復基因XPD參與了抑制Ox-LDL誘導的血管平滑肌細胞增殖，促進細胞凋亡，在抑制AS的形成過程中起作用，可從中尋找抗AS的新途徑。本研究將重組表達質(zhì)粒pEGFP-N2/XPD轉(zhuǎn)染人臍動脈平滑肌細胞(human umbilical arterial smooth muscle cells，HUASMCs)，并給予Ox-LDL處理XPD高表達HUASMCs，觀察細胞增殖和凋亡的變化，探討XPD對Ox-LDL誘導的臍動脈血管平滑肌細胞增殖作用的影響。

材 料 和 方 法

1 材料

HUASMCs購自上海中喬新舟生物科技有限公司；本實驗用到的空載質(zhì)粒pEGFP-N2及重組質(zhì)粒pEGFP-N2/XPD由南昌大學第二附屬醫(yī)院消化內(nèi)科張吉翔教授贈予，pEGFP-N2/XPD通過PCR反應、酶切及基因測序鑒定；DMEM 高糖培養(yǎng)基及胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS)購自HyClone；Ox-LDL購自廣州奕源生物科技公司；DMSO購自Ameresco；細胞周期檢測試劑盒購自杭州聯(lián)科生物技術股份有限公司；脂質(zhì)體LipofectamineTM2000購自 Invitrogen；抗XPD、cleave caspase-3、Bcl-2 和Bax抗體購自Cell Signaling Technology；抗β-actin 抗體購自Santa Cruz；辣根過氧化物酶標記的羊抗兔IgG抗體購自北京中杉；EdU(C10310-1)購自廣州市銳博生物科技有限公司；MTT購自北京索萊寶科技有限公司。

2 方法

2.1HUASMCs的培養(yǎng) HUASMCs用含12% FBS和雙抗(1×105U/L的青霉素和100 mg/L的鏈霉素)的RPMI-1640培養(yǎng)基培養(yǎng)，置于細胞玻璃培養(yǎng)瓶中，于37 ℃、95%空氣濕度、5% CO2孵箱內(nèi)培養(yǎng)。

2.2質(zhì)粒轉(zhuǎn)染和Ox-LDL誘導HUASMCs增殖模型的建立 將上述培養(yǎng)的HUASMCs于轉(zhuǎn)染前1 d，用不含抗生素的培養(yǎng)基按每孔1.5×105的密度種于6孔板中。24 h后，待細胞融合度達約50%時可進行轉(zhuǎn)染。分別將每孔8 μg的空載質(zhì)粒pEGFP-N2及重組質(zhì)粒pEGFP-N2/XPD稀釋于250 μL不含血清的培養(yǎng)基中，輕輕混勻。每孔加入10 μL的LipofectamineTM2000，用不含血清培養(yǎng)基稀釋(每孔250 μL)，輕輕混勻后在室溫下孵育5 min。將混合稀釋好的質(zhì)粒分別與稀釋好的LipofectamineTM2000輕輕混勻，室溫下孵育20 min形成復合物。用PBS清洗細胞，每孔加入2 mL不含抗生素的培養(yǎng)基。在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6 h后換有血清的培養(yǎng)基常規(guī)條件下繼續(xù)培養(yǎng)。培養(yǎng)48 h后提取各孔細胞的蛋白，通過Wes-tern blot實驗檢驗重組質(zhì)粒pEGFP-N2/XPD的轉(zhuǎn)染效果。

將HUASMCs 以5×107/L 接種在96孔板，每孔均為100 μL，并設置調(diào)零孔(只加培養(yǎng)液)。加入不同濃度(0、6.25、12.5、25、50和100 mg/L)的Ox-LDL ，得出最佳濃度后給予不同作用時間(0、6、12、24和36 h)得出最佳作用時間，并設正常對照組，每組6個平行孔。實驗分為空白對照組、空載質(zhì)粒pEGFP-N2組、重組質(zhì)粒pEGFP-N2/XPD組、Ox-LDL組、Ox-LDL+pEGFP-N2組和Ox-LDL+pEGFP-N2/XPD組。質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組細胞均取用轉(zhuǎn)染后48 h的細胞。

2.3MTT法和EdU法檢測細胞增殖率 將對數(shù)生長期的 HUVSMCs以適量(因培養(yǎng)時間不同，確保行MTT檢測時細胞鋪至80%左右)接種于5塊 96孔板，每孔均為100 μL，并設置一調(diào)零孔(加等量培養(yǎng)液)，加入MTT約4 h后，棄上清液，每孔再加入 150 μL的 DMSO，用錫箔紙遮蓋避光，在搖床上振蕩10 min，使紫藍色結晶充分溶解。酶標儀在492 nm 處測定各孔吸光度(A)值，計算細胞存活率，細胞存活率(%)=A實驗組/A對照組×100%。

同時采用EdU法檢測Ox-LDL對HUASMCs增殖的影響。以每孔4×103個細胞的密度種于96孔板，細胞貼壁后根據(jù)不同分組，給予重組質(zhì)粒pEGFP-N2/XPD及空載體轉(zhuǎn)染，根據(jù)試劑盒進行EdU標記、細胞固定化及DNA染色，在熒光顯微鏡下計算染色細胞核占相應總細胞的百分比，每組6個復孔。

2.4流式細胞術檢測細胞周期 用PBS液洗滌細胞2次，吸去殘余液體。用不含EDTA的胰酶消化(注意胰酶不可過度消化細胞)，加培養(yǎng)基終止消化，獲得約2×105～1×106的細胞數(shù)量，用500 μL孵育緩沖液懸浮細胞，至暗室中，加1 mL試劑A及10 μL試劑B，振蕩5～10 s，室溫下避光反應30 min后，使用流式細胞術進行細胞周期檢測。

2.5Western blot法檢測蛋白水平 在各組試劑作用24 h后吸凈6孔板內(nèi)培養(yǎng)基，預冷PBS沖洗3次，加入細胞裂解200 μL，提取總蛋白，BCA法測定蛋白質(zhì)濃度后，以每孔100 μg上樣，經(jīng)12% SDS-PAGE分離蛋白，蛋白轉(zhuǎn)膜，5%脫脂奶粉-TBST封閉 2h，分別用抗XPD、caspase-3、Bcl-2、Bax和β-actin的 I 抗(1∶1 000)孵育，4 ℃過夜，再加 II 抗孵育2 h，0.1% Tween-TBS洗3次，每次10 min顯色后置入Bio-Rad Image Lab成像系統(tǒng)中曝光成像。將圖片導出用凝膠圖像處理系統(tǒng)分析每組條帶，結果表示為：(目的條帶灰度值-背景灰度值)/β-actin的灰度值。

3 統(tǒng)計學處理

以上實驗均重復6次。采用SPSS13.0 統(tǒng)計學軟件進行數(shù)據(jù)分析。數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差(mean±SD)表示，各組數(shù)據(jù)總體差異的比較采用單因素方差分析(one-way ANOVA)，兩兩比較采用SNK-q檢驗。以P<0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

結 果

1 重組質(zhì)粒pEGFP-N2/XPD的轉(zhuǎn)染效果

HUASMCs轉(zhuǎn)染質(zhì)粒48 h后收集細胞，提取細胞蛋白，進行Western blot 檢測，結果顯示，與空白對照組相比，重組質(zhì)粒pEGFP-N2/XPD組中XPD表達明顯增高(P<0.01)，說明重組質(zhì)粒 pEGFP-N2/XPD轉(zhuǎn)染成功，見圖1。

Figure 1. The protein expression of XPD in HUASMCs after plasmid transfection determined by Western blot. Mean±SD.n=6.*P<0.05vscontrol group.

圖1質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后XPD在HUASMCs中的表達

2 Ox-LDL和XPD對HUASMCs增殖的影響

不同濃度的Ox-LDL孵育HUASMCs，使用MTT和EdU法檢測細胞增殖率，各組比較50 mg/L效果最佳，50 mg/L與100 mg/L比較差異無統(tǒng)計學顯著性。采用50 mg/L Ox-LDL孵育HUASMCs 6、12、24和36 h，24 h組效果最佳，24 h與36 h比較差異無統(tǒng)計學顯著性，因此后續(xù)實驗我們選擇50 mg/L Ox-LDL孵化HUASMCs 24 h構建模型，見圖2。

EdU實驗結果可見，Ox-LDL處理組的細胞增殖率明顯高于空白對照組(P<0.05)，而pEGFP-N2/XPD組的細胞增殖率明顯低于空白對照組(P<0.05)；Ox-LDL+pEGFP-N2/XPD組細胞增殖明顯低于Ox-LDL組(P<0.05)；空白對照組與空載質(zhì)粒pEGFP-N2組細胞增殖的差異無統(tǒng)計學差異；Ox-LDL處理組與Ox-LDL+pEGFP-N2組細胞增殖差異無統(tǒng)計學意義，見圖3。

3 流式細胞術檢測Ox-LDL和XPD對細胞周期分布的影響

與對照組比較，pEGFP-N2/XPD組的S期細胞比例減少(P<0.05)，G0/G1期細胞比例明顯增多(P<0.05)；與對照組比較，Ox-LDL組的S期細胞比例增多(P<0.05)，G0/G1期細胞比例明顯減少(P<0.05)；與Ox-LDL組比較，Ox-LDL+pEGFP-N2/XPD組S期細胞比例減少(P<0.05)，G0/G1期細胞比例明顯增多(P<0.05)；對照組與空載質(zhì)粒pEGFP-N2組之間相比差異無統(tǒng)計學顯著性；Ox-LDL組與Ox-LDL+pEGFP-N2組及之間相比差異沒有統(tǒng)計學顯著性，見圖4及表1。

Figure 2. Dose-dependent and time-dependent effects of Ox-LDL on the proliferation of HUASMCs. A: MTT assay was used to detect the viability of the cells exposed to various concentrations of Ox-LDL; B: MTT assay was used to detect the viability of the cells incubated with Ox-LDL (50 mg/L) for various periods; C and D: EdU assay was used to detect the cell proliferation (×100). Mean±SD.n=6.*P<0.05vscontrol (0 mg/L or 0 h) group；#P<0.05vs25 mg/L Ox-LDL group；△P<0.05vs12 h group.

圖2Ox-LDL促HUASMCs增殖作用的時間和劑量相關性

Figure 3. The proliferation ability of the HUASMCs transfected with pEGFP-N2/XPD and treated with Ox-LDL was detected by EdU assay (×100). Mean±SD.n=6.*P<0.05vscontrol group；#P<0.05vsOx-LDL group.

圖3EdU檢測pEGFP-N2/XPD轉(zhuǎn)染和Ox-LDL處理后HUASMCs增殖能力的變化

Figure 4. The cell cycle distribution of the HUASMCs analyzed by flow cytometry.

圖4流式細胞術檢測各組細胞周期的分布

表1Ox-LDL與XPD過表達對HUASMCs細胞周期的影響

Table 1. The changes of cell cycle distribution of HUASMCs transfected with pEGFP-N2/XPD and treated with Ox-LDL (%. Mean±SD.n=6)

GroupG0/G1phaseSphaseControl62.31±3.6123.12±2.47pEGFP-N261.57±3.2322.75±2.53pEGFP-N2/XPD76.82±4.83*15.68±3.46*Ox-LDL51.19±3.95*38.42±3.63*Ox-LDL+pEGFP-N250.76±3.6737.91±3.97Ox-LDL+pEGFP-N2/XPD70.96±4.73#21.09±4.02#

*P<0.05vscontrol group；#P<0.05vsOx-LDL group.

4 Western blot法檢測cleaved caspase-3、Bcl-2和Bax的蛋白水平

與空白對照組相比，pEGFP-N2/XPD組HUVSMCs中 Bax及cleaved caspase-3蛋白表達上調(diào)(P<0.05)，Bcl-2蛋白表達顯著下調(diào)(P<0.05)；與對照組比較，Ox-LDL組中Bax及cleaved caspase-3蛋白表達下調(diào)(P<0.05)，Bcl-2蛋白表達上調(diào)(P<0.05)；與Ox-LDL組比較，Ox-LDL+pEGFP-N2/XPD組中Bax及cleaved caspase-3蛋白表達上調(diào)(P<0.05)，Bcl-2蛋白表達下調(diào)(P<0.05)；對照組與pEGFP-N2組之間相比無顯著差異；Ox-LDL組與Ox-LDL+pEGFP-N2組及之間相比無顯著差異，見圖5、6。

討 論

近年來研究發(fā)現(xiàn)，在高齡、高血脂、糖尿病及吸煙等AS的各種危險因素下，VSMCs過度增殖是導致AS發(fā)生發(fā)展的一個極其重要的環(huán)節(jié)[7]。研究表明，小劑量的Ox-LDL即可直接或間接導致血管平滑肌細胞增殖，因此Ox-LDL 在動脈粥樣硬化的形成過程中起著十分重要的作用[8-9]。本研究使用Ox-LDL刺激HUASMCs增殖，模擬AS的發(fā)生，通過MTT和EdU實驗檢測細胞增殖率比值，發(fā)現(xiàn)50 mg/L Ox-LDL孵化HUASMCs 24 h增殖效果最佳。

研究發(fā)現(xiàn)XPD在參與機體DNA損傷修復并維持基因組穩(wěn)定性中起十分重要作用，XPD是TFⅡH的組份之一，TFⅡH在哺乳動物的轉(zhuǎn)錄起始和核酸剪切修復中起重要作用，XPD作為一種ATP依賴的DNA解螺旋酶，是連接TFⅡH核心亞基與CDK-活化蛋白激酶的橋梁，參與單核苷酸剪切修復途徑。XPD的表達及功能缺陷可能導致機體不能有效修復突變基因，同時具有上調(diào)癌基因及下調(diào)抑癌基因的作用功能，促進腫瘤的發(fā)生發(fā)展[10]。XPD除了在核苷酸切除修復和轉(zhuǎn)錄過程中發(fā)揮主要作用外，還參與了抑制血管平滑肌細胞增殖與促進凋亡[11]。

本文假設XPD能抑制Ox-LDL介導的HUASMCs過度增殖，同時促進其凋亡。因此將重組質(zhì)粒pEGFP-N2/XPD轉(zhuǎn)染HUASMCs后，使XPD表達升高，給予Ox-LDL 刺激HUASMCs增殖，觀察HUASMCs的凋亡與增殖變化情況。結果顯示，Ox-LDL能抑制HUASMCs的凋亡并促進其增殖；但XPD高表達能抑制Ox-LDL的促增殖及抗凋亡作用。

Figure 5. The protein expression of Bcl-2， Bax and Bcl-2/Bax in HUASMCs transfected with pEGFP-N2/XPD and treated with Ox-LDL. Mean±SD.n=6.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsOx-LDL group.

圖5pEGFP-N2/XPD轉(zhuǎn)染和Ox-LDL處理后HUASMCs中Bcl-2和Bax蛋白表達水平及Bcl-2/Bax的變化

Figure 6. The protein level of cleaved caspase-3 in HUASMCs transfected with pEGFP-N2/XPD and treated with Ox-LDL. Mean±SD.n=6.*P<0.05vscontrol group；#P<0.05vsOx-LDL group.

圖6pEGFP-N2/XPD轉(zhuǎn)染和Ox-LDL處理后HUASMCscleavedcaspase-3蛋白水平的變化

本研究使用Ox-LDL刺激HUASMCs增殖，模擬AS的發(fā)生。上調(diào)XPD表達能抑制Ox-LDL的促進增殖及抑制凋亡作用，這種現(xiàn)象提示我們可能通過上調(diào)VSMCs中的XPD表達來控制及治療AS的發(fā)生及發(fā)展。抑凋亡蛋白Bcl-2和促凋亡蛋白Bax在凋亡的各個階段起調(diào)節(jié)作用，是參與細胞凋亡調(diào)控關鍵的基因，Bcl-2表達上調(diào)和Bax表達下調(diào)可以認為是凋亡被抑制[12]。本文發(fā)現(xiàn)在HUASMCs中，Ox-LDL可下凋Bax的表達并上調(diào)Bcl-2的表達；XPD高表達能上調(diào)Bax及下調(diào)Bcl-2 ，并且抑制Ox-LDL的上調(diào)Bcl-2及下調(diào)Bax的作用。

Caspase-3在細胞凋亡中發(fā)揮極其重要的作用。Caspase-3被激活是細胞凋亡發(fā)生的標志酶。而Bcl-2 蛋白可以通過抑制細胞色素C 與Apof-1結合從而抑制caspases 活化，通過抑制caspase-3過表達誘導的細胞凋亡[13-14]。同時caspase-3 具有裂解Bcl-2蛋白的作用，產(chǎn)生的裂解產(chǎn)物可激活下游caspase 而導致級聯(lián)反應。本實驗結果發(fā)現(xiàn)，高表達XPD能抑制Ox-LDL誘導的Bcl-2上調(diào)及caspase-3下調(diào)。XPD促進HUASMCs凋亡作用可能與上調(diào)caspase-3有關。

綜上所述，XPD能抑制HUASMCs的增殖并促進其凋亡，還能抑制Ox-LDL的促HUASMCs增殖和抗凋亡作用，可能成為治療AS新的靶點，為AS治療提供新的思路。

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Effect of xeroderma pigmentosum group D gene on proliferation of human umbilical arterial smooth muscle cells induced by Ox-LDL

XIA Zi-rong, LI Qing, XIA Zhen, LI Ju-xiang, HONG Kui, WU Yan-qing, WU Qin-hua, CHENG Xiao-shu

(DepartmentofCardiovascularMedicine,TheSecondAffiliatedHospitalofNanchangUniversity,Nanchang330006,China.E-mail:ljx912@126.com)

AIM: To investigate the effects of xeroderma pigmentosum group D (XPD) gene on the proliferation of human umbilical arterial smooth muscle cells (HUASMCs) induced by oxidized low-density lipoprotein (Ox-LDL).METHODSThe recombinant plasmid pEGFP-N2/XPD was transfected into HUASMCs by liposome. The cells were divided into blank control group, pEGFP-N2 group, pEGFP-N2/XPD group, Ox-LDL group, Ox-LDL+pEGFP-N2 group and Ox-LDL+pEGFP-N2/XPD group. The proliferation rate of the cells was detected by MTT and EdU assays. The apoptotic rate and cell cycle distribution were analyzed by flow cytometry. The protein levels of XPD, caspase-3, Bcl-2 and Bax were determined by Western blot.RESULTSCompared with blank control group, the expression of XPD was increased in pEGFP-N2/XPD group (P<0.05). According to the results of MTT and EdU assays, the cell proliferation in pEGFP-N2/XPD group was reduced compared with blank control group (P<0.05). Compared with Ox-LDL group, the cell proliferation in Ox-LDL+pEGFP-N2/XPD group was significantly inhibited (P<0.05). According to the results of flow cytometry, the cell proportion of S phase decreased and the G0/G1-phase cell proportion increased significantly in pEGFP-N2/XPD group and Ox-LDL+pEGFP-N2/XPD group compared with blank control group and Ox-LDL group, repectively (P<0.05). Compared with blank control group and Ox-LDL group, the protein level of Bcl-2 decreased and the protein levels of Bax and cleaved caspase-3 increased in pEGFP-N2/XPD group and Ox-LDL+pEGFP-N2/XPD group, respectively (P<0.05).CONCLUSIONXPD inhibits the proliferation of HUASMCs and promotes their apoptosis, and reduces the promoting effect of Ox-LDL on the proliferation of HUVSMCs. XPD may be the target for treatment of atherosclerosis.

Xeroderm pigmentosum group D gene; Oxidized low-density lipoprotein; Human umbilical arterial smooth muscle cells; Atherosclerosis

1000- 4718(2017)12- 2238- 07

2017- 01- 18

2017- 08- 08

江西省自然科學基金資助項目(No. 2010GZY0254)

△通訊作者Tel: 13657092311; E-mail: ljx912@126.com

R543.1； R363.2

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2017.12.020

(責任編輯： 陳妙玲， 羅 森)