氣相色譜—質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)分析大氣細(xì)顆粒物對(duì)小鼠肺組織代謝輪廓的影響

史純珍+毛旭+韓茜+樊沖+金萌

摘 要 建立了基于氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)（GCMS）分析大氣細(xì)顆粒物（PM2.5）滴注對(duì)小鼠肺組織代謝輪廓的影響的研究方法。通過(guò)分析肺組織細(xì)胞內(nèi)代謝物的變化，研究不同濃度PM2.5對(duì)小鼠肺組織代謝的毒性機(jī)制。鼻腔分別滴注0、7.5、20.0和37.5 g/L的PM2.5懸液，提取肺組織胞內(nèi)物質(zhì)，預(yù)處理后進(jìn)行GCMS分析，結(jié)合主成分分析法（PCA）、偏最小二乘判別分析法（PLSDA）進(jìn)行數(shù)據(jù)解析，通過(guò)PLSDA得分圖可將不同PM2.5染毒濃度下的肺組織胞內(nèi)物質(zhì)明顯區(qū)分。運(yùn)用PLSDA載荷圖及模型的變量重要性因子（VIP）值，發(fā)現(xiàn)了7種代謝物可作為區(qū)別不同濃度PM2.5下代謝組的潛在生物標(biāo)志物，分別為丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、鳥(niǎo)氨酸、延胡索酸、檸檬酸、嘌呤（p<0.01）。代謝途徑分析結(jié)果表明，PM2.5滴注使小鼠肺組織受到氧化損傷，氧化應(yīng)激反應(yīng)增強(qiáng)，抑制了三羧酸循環(huán)（TCA循環(huán)）及嘌呤代謝。本研究為深入解析PM2.5致毒機(jī)理提供了新的方法及理論依據(jù)。

關(guān)鍵詞 大氣細(xì)顆粒物； 代謝輪廓； 主成分分析； 毒性機(jī)理

1 引 言

大氣細(xì)顆粒物（PM2.5）是指空氣動(dòng)力學(xué)直徑小于2.5 μm的顆粒物，含有有機(jī)/無(wú)機(jī)碳（OC/EC）、硫酸鹽、硝酸鹽、重金屬和多環(huán)芳烴（PAHs）等多種有害物質(zhì)[1，2]。PM2.5顆粒隨呼吸進(jìn)入人體肺泡后，可破壞肺泡組織，導(dǎo)致矽肺病，其攜帶的重金屬、PAHs等可進(jìn)入血液系統(tǒng)，危害人體健康[3]。在中國(guó)城市環(huán)境中，PM2.5中的PAHs及其衍生物是導(dǎo)致人體患肺癌的主要原因[4]。目前，研究PM2.5的健康效應(yīng)主要采用流行病學(xué)及毒理學(xué)研究方法。流行病學(xué)研究證實(shí)，PM2.5的污染程度會(huì)影響人群的發(fā)病率和死亡率，大氣中PM2.5濃度每升高10 μg/m3，人群呼吸系統(tǒng)疾病的死亡率從2.1%升高到3.75%[5]。PM2.5可在肺部沉積，導(dǎo)致慢性阻塞性肺疾病（Chronic obstructive pulmonary diseases， COPD）或肺癌[6]。目前，定量分析PM2.5劑量效應(yīng)關(guān)系的研究都是基于環(huán)境流行病學(xué)研究數(shù)據(jù)，而毒理學(xué)研究結(jié)果可為流行病學(xué)研究所發(fā)現(xiàn)的顆粒物健康效應(yīng)提供機(jī)理解釋[7]。PM2.5的成分復(fù)雜，并隨著時(shí)空變換而不斷變化，其損傷程度和機(jī)制也會(huì)相應(yīng)改變，這類(lèi)研究是當(dāng)今PM2.5研究中的熱點(diǎn)。

代謝組學(xué)是研究健康效應(yīng)的有力工具，其揭示的小分子代謝產(chǎn)物變化是機(jī)體內(nèi)基因、蛋白質(zhì)、酶等功能變化的一系列事件的最終結(jié)果，直接反映了生物體系的最終狀態(tài)，可反映機(jī)體特定病理生理狀態(tài)下整體代謝物質(zhì)的變化，為疾病診斷、揭示致病機(jī)理提供新的研究思路[8，9]。Belén等[10]采用直接輸注電噴霧電離四極桿飛行時(shí)間質(zhì)譜（DIESIQTOFMS）和氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用（GCMS）檢測(cè)肺癌（LC）組和對(duì)照組的支氣管肺泡灌洗液（BALF）代謝物差異，采用偏最小二乘法（PLSDA）分析和篩選生物標(biāo)志物，發(fā)現(xiàn)肺癌導(dǎo)致谷氨酸鹽和谷氨酰胺代謝途徑的變化，并評(píng)估及驗(yàn)證了其潛在的生物標(biāo)志物。Izabella等[11]對(duì)在空氣污染中暴露的人肺灌洗液進(jìn)行多平臺(tái)代謝組學(xué)研究，結(jié)果表明，結(jié)合GCMS、液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用（LCMS）、核磁共振（NMR）可檢測(cè)出支氣管液（BW）和支氣管肺泡灌洗液中的82種代謝物，其中46種代謝物顯示出由于生物柴油暴露導(dǎo)致的代謝差異。

王曉飛等[12]利用LCMS的代謝組學(xué)技術(shù)，分析了經(jīng)PM2.5懸液氣管滴注暴露后成年雄性大鼠睪丸代謝組的全局變化，采用偏最小二乘判別分析（PLSDA）和非參數(shù)檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，最終鑒定了56種差異代謝物，并發(fā)現(xiàn)PM2.5暴露會(huì)引起大鼠睪丸的氨基酸和核苷酸代謝紊亂、脂類(lèi)代謝異常和類(lèi)固醇激素代謝失衡。但該研究未對(duì)大鼠肺臟進(jìn)行PM2.5毒理研究。Wang等[13]利用超高效液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)（UPLCMS）對(duì)成年大鼠以1 mg/kg/周的劑量進(jìn)行PM2.5懸液滴注，連續(xù)滴注3月后解析肺組織代謝物，發(fā)現(xiàn)31種代謝物含量升高、19種代謝物含量降低，通過(guò)代謝途徑分析推測(cè)PM2.5可干擾助氧化抗氧化平衡，并與磷脂、甘油磷酸、鞘脂和嘌呤的變化密切相關(guān)。但該研究主要針對(duì)單一濃度下的PM2.5對(duì)大鼠肺組織的健康效應(yīng)，并未研究PM2.5濃度變化對(duì)其影響。本研究通過(guò)采集PM2.5樣品，并配制成不同濃度懸浮液（7.5、20.0和37.5 g/L），對(duì)小鼠進(jìn)行鼻腔滴注，通過(guò)對(duì)實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組的代謝物進(jìn)行主成分分析（PCA）、偏最小二乘判別分析（PLSDA），研究其對(duì)小鼠肺組織的濃度效應(yīng)關(guān)系，尋找不同濃度PM2.5影響肺組織代謝的潛在生物標(biāo)志物，及其對(duì)相關(guān)代謝的影響。

2 實(shí)驗(yàn)部分

2.1 儀器與試劑

TH150C型智能中流量空氣總懸浮微粒采樣器（武漢市天虹儀表公司）； Trace130型氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀（美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司）； QL861 型旋鍋混合器（海門(mén)市其林貝爾儀器制造有限公司）； TB215D型（十萬(wàn)分之一）電子天平（美國(guó)DENVER公司）； 114 型低溫高速離心機(jī)（德國(guó)Sigma公司）； SANYO MDF382型超低溫冰箱（日本SANYO公司）。

乙醚、氯化鈉（分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）； 乙腈（美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司）； 分析純甲氧基胺、吡啶、甲基三甲基甲硅烷基三氟乙酰胺（MSTFA）、二十二烷、庚烷，均購(gòu)于上海阿拉丁生化科技股份有限公司。實(shí)驗(yàn)用水為超純水。清潔級(jí)雄性KM小鼠購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，5周齡，體重38～42 g （動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（京）20160011）。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)環(huán)境：SPF級(jí)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室，控制室內(nèi)溫度18～22℃，相對(duì)濕度40%～50%，小鼠給予標(biāo)準(zhǔn)飼料和飲用水，于室內(nèi)保持12 h光照、12 h避光循環(huán)飼養(yǎng)。

2.2 PM2.5采集與制備

2.2.1 PM2.5采集 本研究采用TH150C型智能中流量空氣總懸浮微粒采樣器與PM2.5切割器配合采樣，采樣濾膜為潔凈的玻璃纖維濾膜。樣品采自北京工商大學(xué)東校區(qū)（北京市海淀區(qū)阜成路11號(hào)），連續(xù)采樣15 d，每天采樣時(shí)間24 h。

2.2.2 采樣濾膜處理及PM2.5懸液制備 采樣后的濾膜，將有塵面兩次對(duì)折剪成小塊，用超純水低溫超聲處理3次，每次20 min，6層紗布過(guò)濾去掉濾膜，濾液冷凍真空干燥，待其水分完全蒸發(fā)，可得到灰色絮狀物，稱(chēng)重，低溫保存，備用。測(cè)定時(shí)用生理鹽水分別配制成7.5、20.0和37.5 g/L懸浮液，4℃保存，測(cè)定前超聲振蕩使懸液混勻后進(jìn)行測(cè)定。

2.3 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)

28只雄性ICR小鼠隨機(jī)分成4組（n=7）：對(duì)照組（生理鹽水組）、低劑量組（7.5 g/L）、中劑量組（20 g/L）、高劑量組（37.5 g/L）。采用鼻腔滴入式氣管滴注法，用乙醚將小鼠麻醉，用絲線掛住小鼠上門(mén)齒，使其自然懸掛在自制泡沫架上，用移液槍吸取懸浮液并注入鼻腔中，每天滴注一次，滴注量3 mL/kg（60 μL/只），連續(xù)滴注3天，滴注后立即恢復(fù)自由飲食。于第三次滴注24 h后處死，采集肺組織。

將肺組織剪成小碎片后置于玻璃勻漿管中，加入2倍質(zhì)量的生理鹽水，將玻璃勻漿管插入冰水混合物中，上下轉(zhuǎn)動(dòng)研磨數(shù)十次（6～8 min），充分研碎，使組織勻漿化。將制備好的勻漿于4℃ 3000 r/min離心10 min，收集上清液，80℃保存。

2.4 GCMS分析

GCMS的樣品制備過(guò)程包括去蛋白化、甲氧基化和最終衍生化三個(gè)基本步驟。將肺組織勻漿樣品從80℃冰箱取出后，冰上解凍，移取100 μL樣品于1 mL離心管中，加入300 μL預(yù)冷的乙腈沉淀蛋白，旋渦3 min，氮?dú)獯蹈?，加?0 μL 15 mg/mL甲氧基胺的吡啶溶液，混勻，80℃水浴振蕩反應(yīng)15 min。再加入衍生化試劑MSTFA 50 μL，振蕩30 s，80℃水浴振蕩反應(yīng)15 min； 加入0.1 g/L二十二烷（內(nèi)標(biāo)L）的庚烷溶液150 μL。混勻后離心，取上清液到微量進(jìn)樣管，供GCMS分析。

氣相色譜條件：TGWAX毛細(xì)管柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm）； 進(jìn)樣口溫度，250℃； 升溫程序：起始溫度50℃，保持1 min，以5℃/min升溫至300℃，保持5 min； 載氣（He）； 流速1.0 mL/min； 進(jìn)樣量1.0 μL； 分流比20：1。質(zhì)譜條件：電子轟擊（EI）離子源； 電子碰撞能70 eV； 離子源溫度280℃； 傳輸線溫度250℃； 質(zhì)量掃描范圍m/z 50～600。全掃描方式掃描； 溶劑延遲8 min； 調(diào)諧文件為標(biāo)準(zhǔn)調(diào)諧。

2.5 數(shù)據(jù)處理

采用NIST軟件對(duì)總離子色譜圖進(jìn)行質(zhì)譜峰的定性和定量分析，獲得代謝物的相對(duì)含量（與內(nèi)標(biāo)峰的比值）。然后將數(shù)據(jù)導(dǎo)入SIMCAP進(jìn)行PCA、PLSDA； 應(yīng)用SPSS軟件（Version 24.0， IBM）進(jìn)行顯著性分析。通過(guò)得分圖、載荷圖、F檢驗(yàn)和模型的變量重要性因子（Variable importance factor， VIP）考察不同濃度含量差異并試圖揭示其生物學(xué)效應(yīng)。

3 結(jié)果與討論

3.1 方法學(xué)考察

3.1.1 精密度與重復(fù)性 圖1為所獲得的GCMS生物體液（肺組織勻漿）分析的總離子流（TIC）圖，其中各種代謝物，如氨基酸、有機(jī)酸、糖類(lèi)、 （GCMS）脂肪酸、固醇等依次從GC色譜柱上洗脫。在分析樣品之前，首先對(duì)分析方法進(jìn)行考察，包括進(jìn)樣精密度、制備重復(fù)性、樣本穩(wěn)定性、線性和檢測(cè)限。分別對(duì)同一制備好的肺勻漿樣本連續(xù)進(jìn)樣6次，計(jì)算主要共有峰的峰面積相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD），發(fā)現(xiàn)主要共有峰的峰面積RSD<5%。對(duì)同一樣本平行制備6份，計(jì)算主要共有峰的RSD，肺組織勻漿的RSD<10%。

3.1.2 樣品穩(wěn)定性 為保證實(shí)驗(yàn)的重復(fù)性，生物樣品采集后需要在80℃低溫保存。然而，在反復(fù)的凍融過(guò)程中，代謝物的組成或濃度可能會(huì)發(fā)生變化。為了考察樣品在反復(fù)凍融后的穩(wěn)定性，將80℃凍存的樣品取出800 μL，室溫下解凍，取出200 μL進(jìn)行樣品制備。將剩余的600 μL樣品繼續(xù)于80℃凍存，第二天使用同樣方法進(jìn)行代謝物提取，并進(jìn)行測(cè)定。以此類(lèi)推，共進(jìn)行4次凍融。計(jì)算共有峰面積的RSD。實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，共有峰面積的RSD<15%。

3.1.3 代謝物譜分析與物質(zhì)鑒定 代謝物的物質(zhì)鑒定主要基于NIST質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫(kù)，在數(shù)據(jù)庫(kù)匹配中，匹配度（Match）表示所檢物質(zhì)的質(zhì)譜圖與庫(kù)中標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的質(zhì)譜圖的相似程度，而可能性（Probability）表示該物質(zhì)可被認(rèn)為是候選物質(zhì)的幾率。依據(jù)匹配度>900，且可能性>80%，共檢出32種代謝物。

3.2 代謝物相關(guān)性分析

3.2.1 肺組織勻漿代謝物譜數(shù)據(jù)處理 應(yīng)用PCA和PLSDA法對(duì)樣本進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，圖2為不同PM2.5滴注濃度下的小鼠血清代謝PLSDA得分圖和載荷圖。

由圖2A可見(jiàn)，小鼠肺組織在不同濃度的PM2.5滴注下，代謝輪廓呈現(xiàn)明顯差異，中濃度（20 g/L）和高濃度（37.5 g/L）組有個(gè)別樣品存在重疊，但仍可區(qū)分，且對(duì)照組與實(shí)驗(yàn)組差異明顯。隨著滴注濃度增大，小鼠死亡率升高。說(shuō)明小鼠的耐受性降低，當(dāng)?shù)巫舛葹?7.5 g/L時(shí)，小鼠耐受性接近極值，其代謝輪廓也與低、中濃度組及對(duì)照組差異明顯。

圖2B為小鼠肺組織的PLSDA載荷圖，圖中每個(gè)點(diǎn)代表胞內(nèi)一個(gè)代謝物變量，離原點(diǎn)較遠(yuǎn)的點(diǎn)為潛在的生物標(biāo)志物[14]。圖3為PLSDA的VIP圖，VIP因子可以用來(lái)反映代謝物對(duì)肺組織代謝差異的貢獻(xiàn)。結(jié)合載荷圖、以及第一主成分和第二主成分的VIP值，在0.95的置信區(qū)間內(nèi)，VIP>1的代謝物有：鳥(niǎo)氨酸、延胡索酸、檸檬酸、丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、嘌呤7種代謝物，說(shuō)明當(dāng)?shù)巫⒉煌瑵舛萈M2.5懸液時(shí)，這些代謝物在肺組織代謝通路中受到影響。

3.2.2 肺組織勻漿代謝物含量的改變 使用F檢驗(yàn)統(tǒng)計(jì)分析法檢查上述備選的潛在生物標(biāo)志物在對(duì)照組和不同PM2.5濃度差異的顯著性，結(jié)果表明，對(duì)這些代謝物分別進(jìn)行spss數(shù)據(jù)分析一般線性模型多變量F檢驗(yàn)， p<0.01，說(shuō)明這些代謝物在不同PM2.5濃度組中差異極其顯著，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。最終確定與PM2.5滴注密切相關(guān)的關(guān)鍵代謝物為鳥(niǎo)氨酸、延胡索酸、檸檬酸、丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、嘌呤。

3.3 代謝物含量變化

由圖4A可知，丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、鳥(niǎo)氨酸的相對(duì)濃度均隨PM2.5滴注濃度的增加而減少，可能表示支鏈氨基酸代謝紊亂，肺組織細(xì)胞處于氧化應(yīng)激狀態(tài)，TCA循環(huán)受到抑制。由圖4B可知，延胡索酸濃度下降，延胡索酸是TCA循環(huán)的重要中間體，其濃度下降代表TCA循環(huán)受到抑制[15]。檸檬酸先增加后減少，可能是由于細(xì)胞內(nèi)活性氧（ROS）含量的升高破壞了TCA循環(huán)而造成[16]。

隨著PM2.5染毒濃度的升高，氧化應(yīng)激反應(yīng)逐漸增強(qiáng)，嘌呤含量明顯升高（圖4C）。嘌呤的代謝產(chǎn)物為尿酸，由圖4D可見(jiàn)，嘌呤含量逐漸升高，而尿酸含量相應(yīng)減少，因此PM2.5染毒濃度增加使小鼠肺組織的嘌呤代謝受到了抑制。而尿酸是人體的嘌呤核苷降解途徑中的最終酶催化產(chǎn)物[17]。有研究表明，尿酸尿囊素轉(zhuǎn)換是血小板濃縮液中氧化損傷的一項(xiàng)生物標(biāo)志物； 尿酸作為過(guò)量的活性氧ROS的淬滅劑，其含量的提高有利于減少生物損傷[18，19]。而通過(guò)PM2.5滴注的小鼠出現(xiàn)嘌呤含量升高而尿酸減少，因此可推斷其受到了一定程度的氧化損傷。

4 結(jié) 論

本研究利用基于GC/MS的代謝組學(xué)方法研究了不同PM2.5染毒濃度對(duì)小鼠的肺組織代謝譜的變化。多元統(tǒng)計(jì)分析表明，滴注不同濃度PM2.5的小鼠肺代謝譜存在顯著差異。篩選出7種關(guān)鍵代謝產(chǎn)物，丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、鳥(niǎo)氨酸、延胡索酸、檸檬酸水平隨滴注濃度增加而降低，嘌呤含量呈增加趨勢(shì)。結(jié)合代謝途徑分析，發(fā)現(xiàn)PM2.5滴注時(shí)小鼠肺組織受到氧化損傷，氧化應(yīng)激反應(yīng)增強(qiáng)，削弱了肺細(xì)胞TCA循環(huán)，嘌呤代謝受到抑制。此研究為深入解析PM2.5致毒機(jī)理提供了新的視角及理論依據(jù)。

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