氟苯尼考膠體金免疫層析定量檢測方法的建立

韓姣姣+胡莉明+易揚(yáng)+劉苗+夏駿+徐國茂+羅凱+王琦+賴衛(wèi)華

摘 要 建立了定量檢測氟苯尼考的膠體金免疫層析方法。對膠體金標(biāo)記抗體時溶液pH和抗體濃度、金標(biāo)抗體用量、檢測線上抗原濃度以及檢測時間進(jìn)行了優(yōu)化。采用膠體金試紙條讀取儀測定試紙條檢測線和質(zhì)控線的信號強(qiáng)度，以標(biāo)準(zhǔn)品的濃度為橫坐標(biāo)，陽性樣本和陰性樣本的檢測線/質(zhì)控線的信號比值（Bx/B0）為縱坐標(biāo)建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果表明，膠體金免疫層析試紙定量檢測氟苯尼考的線性范圍為0.1～1.5 ng/mL，檢出限為0.08 ng/mL，檢測時間為15 min。本方法具有簡便、快速和可定量等特點(diǎn)，適于大批量樣品的現(xiàn)場篩查。

關(guān)鍵詞 膠體金； 氟苯尼考； 免疫層析； 定量檢測； 試紙條

1 引 言

氟苯尼考（Florfenicol， FF）又稱氟甲砜霉素，是美國先靈-葆雅公司于1988年研制成功的一種新型獸醫(yī)專用氯霉素類廣譜抗菌藥[1]，被廣泛用于水產(chǎn)和畜禽養(yǎng)殖中[2]。研究表明，氟苯尼考具有血液系統(tǒng)毒性、胚胎毒性[3]和免疫抑制作用[4，5]，動物用藥后會出現(xiàn)短暫的厭食、腹瀉等不良反應(yīng)[3]。在養(yǎng)殖過程中，氟苯尼考的過度使用會造成其在動物性食品中產(chǎn)生殘留，進(jìn)而對消費(fèi)者的身體健康構(gòu)成潛在威脅[6]，并導(dǎo)致耐藥菌的產(chǎn)生[7，8]。因此，各國相繼規(guī)定了氟苯尼考在動物性食品中最高殘留限量標(biāo)準(zhǔn)，我國農(nóng)業(yè)部235號公告規(guī)定其在豬肉中的最高殘留限量為300 μg/kg[9]。

目前，氟苯尼考的檢測方法主要有高效液相色譜法[10]、氣相色譜法[11，12]、液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法[13，14]、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法[15]和酶聯(lián)免疫吸附法[16，17]。這些方法的靈敏度高，重現(xiàn)性好，其中國家標(biāo)準(zhǔn)方法為液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法[18]，但樣品的前處理比較復(fù)雜、耗時較長，需要專業(yè)人員且需要特定的儀器設(shè)備。

膠體金免疫層析法是近年來發(fā)展迅速的一項快速檢測技術(shù)，其特點(diǎn)是簡便、高效、成本低、污染小，非常適合于大批量樣品的現(xiàn)場篩查[19～21]。Zhu等[22]和Guo等[23]建立了膠體金免疫層析法檢測氟苯尼考，檢出限分別為1.0 μg/mL和1.0 ng/mL，但只適于定性檢測。氟苯尼考的其它快速定量檢測方法，如極譜法[24]、旋光分析法[25]和分光光度法[26]等，特異性不強(qiáng)、干擾因素較多，一般用于檢測制劑產(chǎn)品中氟苯尼考的含量，較少用于動物源食品中殘留檢測分析。本研究以膠體金為標(biāo)記物，采用競爭抑制原理，結(jié)合膠體金試紙條讀取儀，建立了高靈敏的氟苯尼考膠體金免疫層析定量檢測方法。

2 實驗部分

2.1 儀器與試劑

XYZ-3050型三維噴點(diǎn)平臺（美國Bio-Dot公司）； HGS-201可編程切條機(jī)（杭州峰航科技有限公司）； TGL-16型高速冷凍離心機(jī)（湘儀儀器開發(fā)有限公司）； 膠體金試紙條讀取儀（上?；娇茖W(xué)儀器有限公司）。

K2CO3（上?；瘜W(xué)試劑公司）； 氟苯尼考全抗原（FF-BSA）、抗氟苯尼考單克隆抗體（北京百奧泰安科技有限公司）； 羊抗鼠多克隆抗體（北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司）； 樣本墊、結(jié)合墊、硝酸纖維膜（NC膜）、吸水紙和底板（PVC板）購自上海金標(biāo)生物技術(shù)有限公司； 甲砜霉素（Thiamphenicol， TAP）、氟苯尼考胺（Florfenicol Amine， FFA）和氯霉素（Chloramphenicol， CAP）購于美國Earthox公司； 氟苯尼考標(biāo)準(zhǔn)品、牛血清白蛋白（Bovineserum albumin， BSA）、氯金酸和檸檬酸三鈉（美國Sigma公司）； 豬肉購自本地超市； 0.01 mol/L磷酸鹽緩沖液（PBS）； 其余試劑均為分析純。

2.2 實驗方法

2.2.1 膠體金的制備[27] 取0.01%（w/V）氯金酸溶液100 mL，加熱至沸騰后，快速加入1.45 mL 1%（w/V） 檸檬酸三鈉溶液，當(dāng)溶液的顏色變至紫紅色后停止加熱，持續(xù)攪拌直至冷卻至室溫。

2.2.2 膠體金標(biāo)記抗體的制備 取膠體金溶液1 mL，用0.2 mol/L K2CO3調(diào)節(jié)溶液至pH 6.5。邊攪拌邊緩慢滴加100 μL用超純水溶解和稀釋的抗氟苯尼考單克隆抗體溶液，常溫下攪拌30 min后， 加入10%（w/V）BSA溶液100 μL，繼續(xù)攪拌30 min； 4℃，8500 r/min離心30 min，棄上清液，以100 μL重懸液（0.01 mol/L PBS，5% 蔗糖； 2% 海藻糖，1% PEG-20000，1% BSA （w/V），0.25% Tween-20 （V/V））重懸沉淀。

2.2.3 樣品的預(yù)處理 取豬肉樣本3 g，勻漿后，加乙酸乙酯6 mL， 振蕩10 min后，室溫下4000 r/min離心10 min。取4 mL上層有機(jī)相，50 ℃下用氮吹儀吹干，加入正已烷1 mL，渦旋混勻30 s，再加入0.01 mol/L PBS緩沖液（pH 7.4） 1 mL，渦旋混勻1 min后，室溫下4000 r/min 離心17 min。棄上層有機(jī)相，取下層溶液用于后續(xù)分析。

2.2.4 膠體金免疫層析法的建立 取0.2 mg/mL 氟苯尼考全抗原和0.6 mg/mL羊抗鼠多克隆抗體，采用XYZ-3050型三維噴點(diǎn)平臺以0.76 μL/cm的噴量噴于NC膜上，分別作為檢測線（T線）和質(zhì)控線（C線）。將噴好的NC膜置于37 ℃真空干燥箱中干燥2 h。在底板（PVC板）上依次粘貼樣本墊、結(jié)合墊、NC膜、吸收墊，并切成4 mm寬的試紙條，如圖1所示。取2 μL 金標(biāo)抗體溶液和100 μL 樣品溶液加入到酶標(biāo)孔中，孵育3 min后滴加到試紙條的樣本墊上[21]，15 min后用膠體金試紙條讀取儀測定結(jié)果。

2.2.5 實驗條件的優(yōu)化 將0.2 mol/L K2CO3溶液加入到1 mL 膠體金溶液中，調(diào)節(jié)膠體金溶液的pH值至5.5、 6.0、 6.5、 7.0和7.5后進(jìn)行抗體標(biāo)記，分別對陰性樣本進(jìn)行檢測，確定最佳pH值。

將0.05、 0.1、 0.2、 0.4和0.8 mg/mL的氟苯尼考全抗原分別噴在NC膜的T線上，分別對陰性樣本和陽性樣本（0.5 ng/mL）進(jìn)行檢測，確定最佳T線抗原濃度。

將2、 4、 6、 8和10 μg的抗氟苯尼考單克隆抗體分別與1 mL 膠體金進(jìn)行標(biāo)記，分別對陰性樣本和陽性樣本（0.5 ng/mL）進(jìn)行檢測，確定最佳膠體金標(biāo)記抗體濃度。

取1.3、2.0、2.7、3.3和4.0 μL的金標(biāo)抗體分別用于陰性樣本和陽性樣本（0.5 ng/mL）的檢測，確定最佳金標(biāo)抗體用量。

2.2.6 檢測時間的確定 將陰性樣本和陽性樣本（0.5 ng/mL）分別與金標(biāo)抗體均相反應(yīng)3 min后，加入到試紙條的樣本墊上。2 min后，用膠體金試紙條讀取儀每30 s測定一次T、C線信號強(qiáng)度，共持續(xù)39 min。以時間為橫坐標(biāo)，T、C線信號強(qiáng)度和T/C值（T線與C線信號強(qiáng)度比值，AT/AC）為縱坐標(biāo)，繪制免疫反應(yīng)動力學(xué)曲線，選取最佳檢測時間。

2.2.7 膠體金免疫層析試紙條的性能評價

取FF標(biāo)準(zhǔn)品分別用液相色譜-質(zhì)譜法確證的陰性豬肉樣本提取液配置成一系列（0、0.02、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.5、1.8和2.0 ng/mL）的標(biāo)準(zhǔn)溶液，用試紙條進(jìn)行檢測后，以氟苯尼考標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度為橫坐標(biāo)，陽性樣本比陰性樣本的T/C值（Bx/B0）為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，其中Bx為陽性樣本T線和C線的信號強(qiáng)度比值，B0為陰性樣本T線和C線的信號強(qiáng)度比值。參考Anfossi等[28]的方法定義本方法的檢出限，以20個陰性豬肉樣本檢測平均值減去3倍標(biāo)準(zhǔn)差得出本方法的檢出限。抑制率計算公式為1-Bx/B0。

取FFA和CAP標(biāo)準(zhǔn)品分別用0.01 mol/L的PBS溶液（pH 7.4）配制成100 ng/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液，TAP和FF則配制成1.5 ng/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液。用本實驗建立的免疫層析法進(jìn)行檢測，每個條件重復(fù)3次。

將豬肉樣本提取液分別添加3個濃度的FF （0.2、0.5和1.0 ng/mL），選用同一批次和不同批次的試紙條對其進(jìn)行檢測，重復(fù)3次，計算不同濃度下的批內(nèi)與批間精密度（相對標(biāo)準(zhǔn)偏差）。

3 結(jié)果與討論

3.1 檢測原理

本研究采用競爭免疫層析原理。當(dāng)樣品中不含有氟苯尼考時（陰性樣本），金標(biāo)抗體在毛細(xì)管作用下沿著NC膜移動并被固定在T線上的FF-BSA捕獲。當(dāng)樣品中含有FF時（陽性樣本），金標(biāo)抗體與樣本溶液中的FF結(jié)合而不能被固定在T線上的FF-BSA捕獲，T線信號強(qiáng)度隨著樣本中FF濃度的增加而降低。剩余的金標(biāo)抗體會與固定在C線上的羊抗鼠二抗結(jié)合。通過膠體金試紙條讀取儀記錄試紙條上T線和C線信號強(qiáng)度，以FF標(biāo)品濃度為橫坐標(biāo)，陽性樣本和陰性樣本的檢測線/質(zhì)控線的信號比值（Bx/B0）為縱坐標(biāo)建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，實現(xiàn)氟苯尼考的快速定量檢測。

3.2 優(yōu)化實驗條件

標(biāo)記時膠體金溶液的pH值會影響抗體的活性與結(jié)合效率[29]，由圖2A可知，當(dāng)膠體金溶液pH=6.5，T線信號值最大（T線信號值為2138）。

由圖2B可知，T線信號強(qiáng)度隨著氟苯尼考全抗原（FF-BSA）濃度的增加而逐漸增強(qiáng)。

0.2 mg/mL時，T線信號值相對較強(qiáng)，抑制率最高（T線信號值為1450.5，抑制率為61.2%），抗原的用量也較少。

由圖2C可知，標(biāo)記膠體金時，當(dāng)所用的抗氟苯尼考單克隆抗體的濃度為6 μg/mL時，T線信號強(qiáng)度和抑制率都相對較高（T線信號強(qiáng)度為1646，抑制率為62.2%），SD也相對較小，抗體較少，成本也相應(yīng)降低。

由圖2D可知，T線和C線信號強(qiáng)度隨著金標(biāo)抗體用量的增加而逐漸增強(qiáng)，但抑制率卻逐漸降低。這是由于待檢物的量一定時，金標(biāo)抗體的用量越多，則與T線上氟苯尼考全抗原和C線上羊抗鼠多克隆抗體結(jié)合的越多。當(dāng)金標(biāo)抗體的用量為2.0 μL時，抑制率最高且陰性樣本T線與C線信號值較強(qiáng)（T線信號強(qiáng)度為1536，C線信號強(qiáng)度為722，抑制率為56.1%）。

圖3中A和B分別為陰性樣本和陽性樣本免疫反應(yīng)動力學(xué)曲線，隨著時間延長，T、C線的信號強(qiáng)度均增加，而T/C線的強(qiáng)度比值（T/C值）逐漸趨于穩(wěn)定。當(dāng)加樣15 min后，T/C值基本保持不變，故檢測時間確定為15 min。

3.3 膠體金免疫層析試紙條的分析性能

采用膠體金免疫層析試紙條檢測FF的標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖4A所示，線性范圍為 0.1～1.5 ng/mL，線性方程為y=0.5735x + 0.9001。其中，x表示氟苯尼考濃度（ng/mL），y表示Bx/B0（Bx為陽性樣本T線和C線的信號強(qiáng)度比值，B0為陰性樣本T線和C線的信號強(qiáng)度比值），R2=0.9848，檢出限為0.08 ng/mL。

3.4 特異性

用所制備的免疫層析試紙條分別檢測FFA、CAP、TAP和FF。當(dāng)待檢物為FFA和CAP時，抑制率分別為4.8%和3.4%。當(dāng)待檢物為TAP和FF時，抑制率分別為75.7%和89.8%。這是由于FF是TAP的氟化物，兩者在化學(xué)結(jié)構(gòu)上較為相似，因此TAP能與抗氟苯尼考單克隆抗體結(jié)合而發(fā)生交叉反應(yīng)。

3.5 重復(fù)性評價

選用不同批次的試紙條，對加標(biāo)水平為0.2、0.5和1.0 ng/mL的陰性豬肉樣本提取液進(jìn)行檢測，結(jié)果如表1所示，試紙條的批內(nèi)回收率為90.5%～103.5%，批間回收率為90.8%～101.2%。

3.6 與LC-MS/MS方法的比較

用氟苯尼考膠體金免疫層析試紙條與國標(biāo)法（LC-MS/MS）[18]同時檢測18份不同的豬肉樣品，根據(jù)實驗結(jié)果繪制線性相關(guān)曲線（圖5）。兩種方法的線性相關(guān)系數(shù)（R2）為0.9886，11個陰性樣本和7個陽性樣本的檢測結(jié)果一致（閾值為300 μg/kg）。本研究建立的氟苯尼考免疫層析法定量檢測結(jié)果準(zhǔn)確可靠。

4 結(jié) 論

建立了氟苯尼考膠體金免疫層析定量檢測方法，對影響膠體金免疫層析試紙條的主要因素進(jìn)行了優(yōu)化。試紙條的檢出限為0.08 ng/mL，線性范圍為0.1～1.5 ng/mL，檢測時間為15 min。本方法具有操作簡單、穩(wěn)定性好和靈敏度高等特點(diǎn)，可以滿足豬肉中氟苯尼考的限量檢測，適合于大批量樣品的快速篩查，有較好的應(yīng)用前景。

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