膠體金制備技術(shù)的改進(jìn)與優(yōu)化

劉穎沙，李建科，張琳，劉美慧

(陜西師范大學(xué)食品工程與營養(yǎng)科學(xué)學(xué)院，陜西西安，710119)

膠體金標(biāo)記技術(shù)是一種常見的標(biāo)記技術(shù)，利用膠體金為標(biāo)記物的免疫金染色方法現(xiàn)已廣泛應(yīng)用于組織病理學(xué)和免疫學(xué)診斷等領(lǐng)域［1］。在食品安全快速檢測領(lǐng)域，包括獸藥殘留、農(nóng)藥殘留、動物傳染病等也越來越廣泛的被應(yīng)用［2-5］。

自Faulk等［6］用兔抗沙門氏菌抗血清與膠體金顆粒結(jié)合、制備成金標(biāo)抗體檢測細(xì)菌表面抗原的分布，Romano等［7］用膠體金標(biāo)記抗球蛋白抗體，建立間接免疫金染色法以來，膠體金作為一種新型免疫標(biāo)記技術(shù)得到快速發(fā)展。它具有方便快捷、特異敏感、穩(wěn)定性強(qiáng)、不需要特殊設(shè)備和試劑、結(jié)果判斷直觀等優(yōu)點(diǎn)。

膠體金的制備常采用化學(xué)還原法，主要有白磷還原法、抗壞血酸還原法、檸檬酸三鈉還原法、鞣酸-檸檬酸三鈉還原法、乙醇超聲波還原法和硼氫化鈉還原法［8-10］。氯金酸(HAuCl4)在還原劑作用下，可聚合成一定大小的金顆粒，形成帶負(fù)電的疏水膠溶液。由于靜電作用而成為穩(wěn)定的膠體狀態(tài)，故稱膠體金。膠體金標(biāo)記是蛋白質(zhì)等高分子被吸附到膠體金顆粒表面的包被過程。吸附機(jī)理可能是膠體金顆粒表面的負(fù)電荷與蛋白質(zhì)的正電荷基團(tuán)靜電吸附，達(dá)到牢固的結(jié)合狀態(tài)。

本文采用3種不同的方法制備納米膠體金，并對其進(jìn)行比較分析，選擇最優(yōu)的制備條件，以提高均一度和穩(wěn)定性。故本文在膠體金制備前，先經(jīng)0.22 μm濾膜過濾以提高顆粒均勻性，4℃下保存。

1 材料與方法

1.1 試劑和材料

氯化金(AuCl3)、NaCl、檸檬酸三鈉、抗壞血酸、鞣酸、K2CO3，均為化學(xué)分析純，西安晶博生物科技有限公司;試驗(yàn)用水為去離子水。

1.2 儀器設(shè)備

紫外-可見掃描分光光度計(jì)(UV-2450型)，上海天普儀器有限公司;臺式高速冷凍離心機(jī)(TGL-16G型)，上海安亭科學(xué)儀器廠;超凈工作臺(SJ-CJ-2FQ型)，蘇州蘇潔凈化設(shè)備公司;高壓蒸汽滅菌鍋(LS-B型)，日本SANYO公司;分析天平(ML104型)，瑞士梅特勒—托利多公司;數(shù)顯加熱磁力攪拌器(SH21-1型)，上海梅穎浦儀器儀表制造有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 膠體金的制備

根據(jù)不同的制備方法，可以制備出直徑1～500 nm的膠體金粒子，但做為免疫標(biāo)記探針，其直徑應(yīng)在3～30 nm。膠體金一般采用還原氯金酸(HAuC14)來制備，常見的方法有檸檬酸三鈉還原法、抗壞血酸還原法、白磷還原法、硼氫化鈉還原法、檸檬酸—鞣酸還原法。

1.3.1.1 膠體金制備前處理

各種玻璃器具均需要經(jīng)蒸餾水多遍洗凈并用雙蒸水多次沖洗，烘干;并將器皿放入濃硫酸溶液中浸泡24 h超純水多遍浸泡沖洗，烘干，避免粉塵等污染。經(jīng)高壓滅菌進(jìn)行滅菌處理，最后經(jīng)過去離子水沖洗多遍，高溫干燥，備用。

1.3.1.2 膠體金制備的具體步驟［11］

(1)檸檬酸三鈉法制備膠體金。① 取250 mL三角瓶一個(gè)，加99 mL雙蒸水及1 mL 1%氯化金(淺黃色溶液)，用0.22 μm濾膜過濾，加熱沸騰。② 取0.75，1，1.5，2，4 mL 的1%檸檬酸鈉先用0.22 μm 濾膜過濾，再加入上述溶液中，迅速混合均勻，再保持沸騰一定時(shí)間，在上述攪拌過程中，錐形瓶中溶液顏色呈現(xiàn)由淺黃色—紫色—酒紅色的變化過程，取下錐形瓶冷卻至室溫，并用雙蒸水補(bǔ)充至原體積，制備成酒紅色的膠體金溶液，經(jīng)0.22 μm濾膜過濾。③ 將膠體金溶液用試劑瓶分別保存于常溫和4℃保存，備用;若膠體金溶液表面有漂浮物，說明不穩(wěn)定以及均一度較差，應(yīng)棄去。

(2)抗壞血酸還原法制備膠體金。與檸檬酸三納法在開始階段制法相同，只是在上述攪拌過程中，錐形瓶中溶液顏色呈現(xiàn)由淺黃色—紅色的變化過程，取下錐形瓶冷卻至室溫，并用雙蒸水補(bǔ)充至原體積，制備成酒紅色的膠體金溶液，經(jīng)0.22 μm濾膜過濾，備用。

(3)檸檬酸三鈉—鞣酸制備膠體金。第一步與檸檬酸三納法相同，之后取4 mL 1%檸檬酸三鈉，加入0～5 mL 1%鞣酸，0～5 mL 25 mmol/L K2CO3(體積與鞣酸加入量相等)，于此溫度下保持一定時(shí)間，待溶液顏色變成深紅色后，將溶液加熱至沸騰，保持沸騰一定時(shí)間。取下錐形瓶冷卻至室溫，并用雙蒸水補(bǔ)充至原體積，制備成酒紅色的膠體金溶液，經(jīng)0.22 μm濾膜過濾，備用。

1.3.2 膠體金顆粒質(zhì)量評價(jià)及粒徑的確定

通過目測可以得到膠體金的外觀特征，UV-2450紫外-可見光分光光度計(jì)對膠體金在可見光范圍(400～700 nm)進(jìn)行掃描，記錄結(jié)果。400～700 nm波段分光光度進(jìn)行全波長掃描，膠體金的最大吸收峰波長與平均粒徑的線性關(guān)系根據(jù)回歸方程［12］:Y=0.427 1X+514.56(X，納米金平均粒徑;Y，最大吸收峰)，可得到膠體金的粒徑并由相對寬峰寬/峰高大小可以知道膠體金顆粒的均勻度，分別測定OD520與OD580的比值可進(jìn)行均一性的比較。

2 結(jié)果與討論

2.1 最佳燒制時(shí)間和最佳外觀顏色的判定

對膠體金在可見光范圍(400～700 nm)進(jìn)行掃描，結(jié)果如圖1。由圖1可以看出，在燒制過程中，當(dāng)膠體金顏色呈現(xiàn)黃色、深紫色、淺紫色均無明顯的波峰出現(xiàn)，表明金離子未還原或未還原完全，不能聚合成的一定大小的金顆粒，故無明顯的峰波出現(xiàn);當(dāng)顏色變?yōu)樽霞t色時(shí)，金粒子還原后聚合成金顆粒，即有明顯的波峰出現(xiàn)。故選擇膠體金顏色為紫紅色為最佳外觀顏色。若膠體金溶液繼續(xù)保持沸騰時(shí)間過長，容易在沸騰狀態(tài)下體系變得不穩(wěn)定，膠體金溶液容易發(fā)生聚沉現(xiàn)象，使得過多的金顆粒沉淀。結(jié)合試驗(yàn)得到檸檬酸三鈉法選擇沸騰10 min，抗壞血酸還原法選擇沸騰10 min、檸檬酸三鈉-鞣酸法選擇沸騰5 min為不同方法的最佳燒制時(shí)間，即可達(dá)到顏色均一。

圖1 氯金酸溶液為黃色的全波長掃描曲線Fig.1 The spectrum scanning of AuNPs synthesized is yellow

圖2 膠體金顏色為紫色全波長掃描曲線Fig.2 The spectrum scanning of AuNPs synthesized is purple

圖3 膠體金顏色為淺紫色全波長掃描曲線Fig.3 The spectrum scanning of AuNPs synthesized is light purple

圖4 膠體金顏色為紫紅色全波長掃描曲線Fig.4 The spectrum scanning of AuNPs synthesized is fuchsia

2.2 紫外-可見光譜表征判定濾膜過濾前處理

未經(jīng)0.22 μm濾膜過濾處理的膠體金顏色與經(jīng)濾膜過濾的外觀顏色無明顯區(qū)別，但是經(jīng)全波長掃面可以看出(圖5)，在波長為540 nm時(shí)曲線不平滑，說明顆粒為達(dá)到均一穩(wěn)定的效果。故制備膠體金時(shí)，經(jīng)先將氯化金溶液和檸檬酸三鈉以及抗壞血酸等溶液進(jìn)行0.22 μm濾膜過濾處理以確保制成均一穩(wěn)定無雜質(zhì)的膠體金。

圖5 未經(jīng)濾膜處理的膠體金全波長掃描曲線Fig.5 The spectrum scanning of AuNPs synthesized without the filter processing

2.3 膠體金紫外-可見光譜表征判定最優(yōu)燒制條件

5種不同加入量的檸檬酸鈉，當(dāng)添加0.75，1，1.5 mL的1%檸檬酸三鈉所得到的膠體金的顏色偏紫色，且隨著添加量的增加，顏色逐漸加深;當(dāng)添加2，4 mL的1%檸檬酸三鈉時(shí)，制得的膠體金顏色偏紅色，視覺效果良好透明度高，無懸浮顆粒出現(xiàn)。對燒制而成的膠體金進(jìn)行400～700 nm波段分光光度掃描，得到的掃描圖譜(見圖6)，不同添加量得到的膠體金均有明顯的吸收峰。整理圖表數(shù)據(jù)見表1，可當(dāng)檸檬酸三鈉添加量為2 mL時(shí)，峰高/峰寬較大，OD520/OD580=3.46，與其他數(shù)值相比最大，表明該添加量得到的膠體金顆粒均勻穩(wěn)定性較好，顆粒分布均勻，粒徑為20 nm，呈現(xiàn)紫紅色，透明度高，更加適合后續(xù)的標(biāo)記試驗(yàn)。在反應(yīng)初期，隨著檸檬酸三鈉的增加，金離子更多還原成金顆粒，也能加快膠體金顆粒的形核速率。當(dāng)還原劑加入量達(dá)到一定程度時(shí)，金離子還原達(dá)到飽和，聚合成金顆粒。綜上所述故在檸檬酸三鈉法中，100 mL濃度為0.01%的四氯金酸溶液中，1%檸檬酸鈉的最佳添加量為2 mL。

圖6 檸檬酸三鈉法制成膠體金全波長掃描圖Fig.6 The spectrum scanning of AuNPs synthesized by trisodium citrate

表1 膠體金制法—檸檬酸三鈉法Table 1 AuNPs synthesized by trisodium citrate

4種不同加入量的抗壞血酸，形成的膠體金顏色偏紅色，且隨著添加量的增加，顏色逐漸加深，但制成的膠體金視覺效果一般，透明度較低，肉眼觀看有明顯的顆粒懸浮出現(xiàn)，放置一定時(shí)間，會有沉淀出現(xiàn)。對燒制而成的膠體金進(jìn)行400～700 nm波段分光光度掃描，得到的掃描圖譜(見圖7)，不同添加量得到的膠體金均有明顯的吸收峰。整理圖表數(shù)據(jù)見表2，對比第一種方法，此法在顆粒均一度上有明顯的差別。粒徑大致為60 nm左右，顆粒較大且不均勻。四種不同的添加量得到的膠體金在均一度、粒徑和吸收峰方面均無明顯差異。隨著抗壞血酸的增加，膠體金的不穩(wěn)定性增加，易發(fā)生聚沉現(xiàn)象，不適合膠體金后續(xù)的標(biāo)記試驗(yàn)。故不適宜采取抗壞血酸法制備膠體金。

圖7 抗壞血酸還原法體制成膠體金全波長掃描圖Fig.7 The spectrum scanning of AuNPs synthesized by ascorbic acid reduction

表2 膠體金制法—抗壞血酸還原法Table 2 AuNPs synthesized by ascorbic acid reduction

6種不同加入量的檸檬酸三鈉-鞣酸，所制成的膠體金顏色與檸檬酸三鈉法制得的膠體金顏色類似，但是不同添加量制得的膠體金外觀顏色沒有明顯的區(qū)別，視覺效果良好，透明度高，無懸浮顆粒出現(xiàn)。對燒制而成的膠體金進(jìn)行400～700 nm波段分光光度掃描，得到的掃描圖譜(見圖8)，各曲線在400～500 nm處有略微的上升趨勢，造成吸收峰不明顯。整理圖表數(shù)據(jù)見表3，可知該法制得的膠體金粒徑較適宜于后續(xù)膠體金的標(biāo)記等試驗(yàn)探索。原因可能由于鞣酸具備還原性，同時(shí)其分子量相對較大，在膠體金的制備過程中常作為保護(hù)劑協(xié)同其他還原劑參與反應(yīng)，所以可能在操作過程中鞣酸與還原劑的量的比例對膠體金的質(zhì)量影響較大，不易操作。為了更加發(fā)揮鞣酸與檸檬酸三納的協(xié)同作用，在以后的探索試驗(yàn)中繼續(xù)摸索。

圖8 檸檬酸三鈉-鞣酸法制成膠體金全波長掃描圖Fig.8 The spectrum scanning of AuNPs synthesized by trisodium citrate-tannin

表3 膠體金制法—檸檬酸三鈉—鞣酸法Table 3 AuNPs synthesized by trisodium citrate-tannin

綜上述數(shù)據(jù)對比可得，檸檬酸三納法實(shí)驗(yàn)室制得的膠體金從外觀、吸收峰以及顆粒大小以及符合后續(xù)膠體金標(biāo)記試驗(yàn)的要求，故選用此法。故將最適膠體金做一定程度的稀釋得到下圖為最適檸檬酸鈉添加量的膠體金全波長掃描。紫外-可見光譜圖在523 nm處出現(xiàn)一吸收峰，這是球形金納米粒子特有的表面等離子共振吸收峰，其結(jié)果表明了金納米粒子的生成，顆粒較均勻。根據(jù)回歸方程:Y=0.427 1X+514.56(X，納米金平均粒徑;Y，最大吸收峰)，表明其粒度約為20 nm。

2.4 膠體金的保存條件

圖9 最適檸檬酸三鈉添加量的膠體金全波長掃描圖Fig.9 The spectrum scanning of AuNPs synthesized by the optimum amount of trisodium citrate

將不同方法制成的膠體金分別在常溫和4℃下進(jìn)行保存，檢測其穩(wěn)定性后可知膠體金溶液在常溫條件下保存3周就會出現(xiàn)肉眼可見的顆粒，而4℃膠體金的活力保持較好，膠體金溶液的最大吸收峰波長變化不明顯。與楊玉新等人［13］關(guān)于膠體金保存條件研究結(jié)果一致。故選擇4℃為保存條件。

3 結(jié)語

(1)本實(shí)驗(yàn)通過采用不同燒制方法制備膠體金，比較不同方法的優(yōu)缺點(diǎn)，選取最優(yōu)的制備方法。與目前膠體金產(chǎn)品相比，采用濾膜過濾法過濾膠體金可以提高均一性和穩(wěn)定性，4℃下保存更優(yōu)于常溫。

(2)玻璃器皿必須徹底清理，否則影響生物大分子與金顆粒結(jié)合和活化后金顆粒的穩(wěn)定性;氯金酸質(zhì)量要求高，配成1%水溶液在4℃環(huán)境下可保存數(shù)月，但由于氯金酸易潮解，故最好一次性配制。

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