適于標記核酸適配子膠體金的制備及性能

解瑤，劉中成，張艷芬，趙麗健，劉利鵬

（1.河北大學 藥學院，河北 保定 071002；2.河北大學 實驗室管理辦公室，河北 保定 071002）

1990年，Tuerk等首次利用指數(shù)富集配體系統(tǒng)進化技術（systematic evolution of ligands by exponential enrichment，SELEX），從人工合成的隨機寡核苷酸文庫中篩選出與噬菌體T4DNA 聚合酶有高親和力和特異性結(jié)合的寡核苷酸，即核酸適配子［1］.適配子功能與單克隆抗體類似，但在諸多方面優(yōu)于抗體：可化學合成、性質(zhì)穩(wěn)定、容易修飾、可以用半抗原小分子作為靶標進行篩選等，在化學、藥學等領域受到諸多學者的關注［2］.近年來，基于適配子制作傳感器，檢測靶物質(zhì)，正成為適配子應用的新熱點，其中膠體金標記適配子可制作光學、化學傳感器，它具有和免疫膠體金相同的優(yōu)勢，可簡單、快速地檢測靶物質(zhì)，且無需專業(yè)人員和大型儀器［3－5］.

制備膠體金標記抗體主要利用膠體金在弱堿環(huán)境下帶負電荷，可與蛋白質(zhì)分子正電荷基團牢固結(jié)合，目前對于適于標記抗體的膠體金制備工藝已有很多報道，但有關膠體金標記適配子的研究相對較少［6－7］.宋宏新等［8］制備適于標記抗體的膠體金時僅對檸檬酸三鈉和抗壞血酸2種還原劑進行了優(yōu)化，未考慮其他因素的影響，以及各種參數(shù)之間的交叉影響.楊玉新等［9］人也只是并列比較4種還原劑制備單分散膠體金顆粒的方法.本實驗在前人對適于標記抗體膠體金制備研究基礎上，采用了固定變量法，優(yōu)化了制備適于標記適配子膠體金的條件.因為適配子可通過正電荷與膠體金顆粒形成靜電吸引作用，所以膠體金顆粒均勻度、顆粒大小等因素將直接影響適配子的標記以及傳感器的靈敏度.考慮到膠體金與蛋白及核酸結(jié)合的不同，探索適合標記核酸適配子的膠體金制備工藝，將為適配子在物質(zhì)檢測分析中的應用提供基礎.

本文系統(tǒng)地比較了檸檬酸三鈉、抗壞血酸、鞣酸等還原劑的種類及其加入量，并對pH 值、反應時間、沸騰時間等關鍵參數(shù)進行了優(yōu)化.將所制備膠體金與適配子進行反應，經(jīng)紫外可見光譜掃描和透射電鏡鑒定，獲得了滿足標記核酸適配子要求的膠體金.

1 材料與方法

1.1 實驗材料

氯金酸（HAuCl4）購自Aladdin公司；鏈霉素購自中國藥品生物制品檢定所；檸檬酸三鈉購自天津市北辰驊躍化學試劑廠；抗壞血酸購自上海至新化工有限公司；鞣酸購自天津市達潤能化工有限公司；實驗所用的單鏈和雙鏈核酸及鏈霉素適配子均由上海生工公司合成.其余均為國產(chǎn)分析純試劑.

1.2 膠體金制備

用王水浸泡所用玻璃容器，蒸餾水清洗5次直至干凈，烘干備用.用超純滅菌水配制0.1g／L 氯金酸溶液.首先對不同還原劑進行條件優(yōu)化：分別取20mL氯金酸溶液，調(diào)節(jié)pH 值為3.0，加入到3個50mL的圓底燒瓶中，做好標記，攪拌煮沸，分別立即加入500μL 10g／L 的檸檬酸三鈉、抗壞血酸、鞣酸3種不同的還原劑，顏色變?yōu)榫萍t色后，繼續(xù)加熱攪拌6min，撤去熱源，攪拌至室溫.將所得膠體金溶液轉(zhuǎn)入棕色瓶中，4 ℃保存.同時采用單一變量法對還原劑加入量、反應溶液pH 值、加入檸檬酸三鈉前的沸騰時間以及加入還原劑變色后繼續(xù)煮沸時間等反應條件進行優(yōu)化，利用紫外可見光譜掃描法對優(yōu)化結(jié)果進行檢測.

1.3 膠體金性能測定

將不同長度單鏈和雙鏈DNA（20，80，3 482bp）用滅菌水配制成100nmol／L 溶液.不同長度的單鏈DNA（ssDNA）煮沸5min，冰浴10min，加入到50μL膠體金中室溫震蕩孵育1h，雙鏈DNA（dsDNA）則直接加入到50μL膠體金中室溫震蕩孵育1h，加入50μL 200mmol／L NaCl，充分反應10min，檢測反應結(jié)果.標記ssDNA（80bp）的膠體金以及未標記ssDNA 的膠體金（純膠體金），加入NaCl后的結(jié)果用透射電鏡進行鑒定.

1.4 標記適配子的膠體金性能測定

50μL膠體金中加入100nmol／L鏈霉素特異性適配子室溫孵育1h，制得了標記適配子的膠體金［8］.在所制得的標記適配子膠體金中，分別加入0，0.8，1.6μmol／L 鏈霉素，室溫孵育2h，加入200 mmol／L NaCl.觀察顏色變化，用紫外可見光譜掃描和透射電鏡對其結(jié)果進行綜合評價.

2 結(jié)果與討論

2.1 最佳還原劑的確定

采用檸檬酸三鈉制備膠體金，得到的膠體金呈酒紅色，外觀效果良好，透明，無懸浮物出現(xiàn)；采用抗壞血酸制備膠體金，得到的膠體金溶液呈紫紅色，透明，無漂浮物，符合外觀要求；采用鞣酸制備的膠體金，顏色為亮紅色，透明，無懸浮物.對400～800nm 處吸光值進行掃描，得到掃描圖譜，如圖1所示，檸檬酸三鈉作為還原劑時峰寬相對于其他較窄，說明膠體金顆粒大小均一，分散良好［1］.所以選擇檸檬酸三鈉作為還原劑.

2.2 檸檬酸三鈉添加量的確定

10g／L檸檬酸鈉添加量分別為200，300，400，500，600μL 時，制備得到的膠體金均透明且無懸浮物出現(xiàn).其中，檸檬酸三鈉添加量為200μL 時溶液呈紫色，300，400μL 時呈紫紅色，500，600μL 呈酒紅色.經(jīng)400～800nm 紫外可見分光光度計掃描，如圖2所示，檸檬酸三鈉添加量為200μL 時峰位置在535nm 處，300，400μL時峰位置在525nm 處，500，600μL時峰位置在520nm 處，由此可知隨著還原劑添加量增加，峰位置逐漸變小，顆粒也逐漸變小.所以選擇500μL為檸檬酸三鈉的最佳添加量.

圖1 不同還原劑制得膠體金的掃描圖譜Fig.1 Spectrum scanning of AuNPs synthesized by different reductants

圖2 不同檸檬酸三鈉添加量制備膠體金掃描圖譜Fig.2 Spectrum scanning of AuNPs synthesized by different amounts of sodium citrate

2.3 膠體金溶液pH 值的確定

在溶液pH 值分別為3.0，4.0，6.0，8.0，10.0的情況下制備膠體金.在pH 為3.0，4.0時，溶液呈酒紅色，且峰型和峰寬相同，峰位置都在520nm 左右；在pH 為6.0，8.0時，溶液呈紫紅色，峰型和峰寬接近，峰位置都在539nm 左右；pH 為10.0時，顏色為淺紫色，峰位置在530nm 左右.從圖3可以看出，降低pH 值，吸收峰的最大值向波長短的方向移動，所以，選擇3.0作為最優(yōu)pH.

圖3 不同pH 值條件下所得的膠體金的掃描圖譜Fig.3 Spectrum scanning of AuNPs synthesized in different pH

2.4 氯金酸沸騰時間的確定

如圖4所示，0，2，4min時的最大吸收峰接近，基本處于523nm 處，此時制備得到的膠體金溶液呈酒紅色，透明度較高，色澤穩(wěn)定.而沸騰時間往后推移，經(jīng)紫外分光光度計掃描得到的最大吸收峰有所偏移，且得到的溶液顏色加深，一般呈現(xiàn)紫色，若時間再延長，甚至會出現(xiàn)黑色物質(zhì)，所得到的膠體金溶液較之前穩(wěn)定性較差.

2.5 不同反應時間的確定

改變氯金酸在沸騰后加入檸檬酸三鈉時的反應時間，所得到膠體金的顏色變化如圖5所示，在0，2，4，6，8min時，顏色依次呈現(xiàn)為淺粉色、粉色、紅色、酒紅色、紫紅色.紫外掃描圖譜中反應6min，吸光度最高.說明在0.1g／L氯金酸反應體系為20mL和500μL檸檬酸三鈉溶液條件下反應6min時溶液的顏色為酒紅色，符合膠體金制備要求.

圖4 氯金酸不同的初始沸騰時間所得膠體金的掃描圖譜Fig.4 Spectrum scanning of AuNPs synthesized by different times of boiling

圖5 不同反應時間制得膠體金的光譜Fig.5 Spectrum scanning of AuNPs synthesized by different reaction time

2.6 不同長度DNA 與膠體金反應

膠體金能夠分散良好的原因是膠體金表面檸檬酸離子的斥力作用，而適配子標記膠體金能夠分散良好的原因是適配子的負電子斥力和空間位阻的共同作用，比離子斥力作用要穩(wěn)定很多［12］.所以標記適配子的膠體金加入鹽后，不會發(fā)生聚沉.由圖6可知，長度分別為20，80，3 482bp的ssDNA 與膠體金孵育后，加入NaCl后顏色不變，而長度為20，80，3 482bp的雙鏈DNA 與膠體金孵育，加入NaCl后，顏色由紅變紫.其中陰性對照為不加適配子的膠體金，加入NaCl后，顏色變紫（圖6）.電鏡結(jié)果如圖7所示，標記ssDNA 的膠體金，加入NaCl后顏色不變，分散保持均勻，未標記適配子的膠體金，加入NaCl后，發(fā)生聚沉.由此可知，本研究制備的膠體金可與長度大小不同的單鏈核酸結(jié)合，不產(chǎn)生靜電作用，從而保護膠體金不發(fā)生聚沉，而雙鏈DNA 則不能保護膠體金，表明本實驗制備的膠體金可穩(wěn)定地標記單鏈核酸［13－14］.

圖6 不同長度DNA與膠體金反應結(jié)果Fig.6 Results of different lengths of DNA－lable AuNPs

膠體金粒徑越小，比表面積就越大，電鏡檢測結(jié)果顯示本實驗所制備的膠體金粒徑為15～20nm，而Cvak等［15］研究結(jié)果表明：標記抗體最適合膠體金粒徑范圍是15～40nm，二者較為接近，可能由于抗體和適配子與膠體金結(jié)合的原理相同，均是利用膠體金正電荷與抗體或適配子的負電荷靜電引力相互作用.

圖7 膠體金占ssDNA反應電鏡檢測結(jié)果Fig.7 Results of the reaction between aptamers and AuNPs by TEM

2.7 標記適配子的膠體金性能的測定

已知標記適配子的膠體金加入鹽后，不會發(fā)生聚沉.加入半抗原小分子鏈霉素后，適配子脫離了膠體金，和鏈霉素發(fā)生特異性結(jié)合，加入鹽后，膠體金發(fā)生聚沉，顏色發(fā)生變化.且隨著鏈霉素濃度的增加，聚沉程度加大，結(jié)果顯示顏色由紅變紫再變藍（圖略），且紫外分光光度計掃描圖譜顯示，620nm 處峰高逐漸增大，說明聚沉徹底（圖8）.掃描電鏡結(jié)果與此相同（圖9）.

圖8 不同濃度鏈霉素加入標記適配子的膠體金的光譜Fig.8 Spectrum scanning of different concentaions of streptomycin add to aptamer－labled AuNPs

圖9 不同濃度鏈霉素加入到標記適配子的膠體金的TEMFig.9 Results of different concentations of streptonycin add to aptamer－labled AuNPs by TEM

3 結(jié)論

膠體金在食品檢測、醫(yī)學初診、環(huán)境監(jiān)測等諸多領域得到了廣泛的應用，制備方法也有諸多文獻報道，但標記核酸適配子膠體金的成熟制備工藝未見報道［16－17］.本實驗對還原劑類型及加入量、pH 條件、初始沸騰時間及反應時間等參數(shù)進行了優(yōu)化，建立了適于標記適配子膠體金的制備工藝，并對所制備的膠體金進行了性能鑒定，為制備基于適配子的膠體金比色傳感器奠定了基礎.

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