高靈敏甲胎蛋白夾心免疫傳感器的制備

王雪+李鵬君+邱萍+王小磊

摘 要 構(gòu)建了新型甲胎蛋白（AFP）夾心免疫傳感器。采用金納米粒子-氧化石墨烯-普魯士藍(lán)納米立方體（AuNP-GO-PBNCs）納米復(fù)合材料標(biāo)記甲胎蛋白（AFP）二抗，將制備的金-聚多巴胺-四氧化三鐵（Au-PDA-Fe3O4）磁性納米復(fù)合物固定在自制的磁性電極表面，通過(guò)吸附作用固定AFP一抗，用牛血清白蛋白（BSA）封閉電極上的非特異性吸附位點(diǎn)。在37℃下與AFP抗原溶液孵育50 min，最后將電極放入AuNP-GO-PBNCs納米復(fù)合材料標(biāo)記的二抗溶液中孵育，基于此建立了采用普魯士藍(lán)（PB）標(biāo)記的的夾心免疫傳感器檢測(cè)AFP的方法。在最佳實(shí)驗(yàn)條件下，PB催化H2O2氧化的響應(yīng)電流與AFP的濃度表現(xiàn)出兩段線性關(guān)系，線性范圍分別為0.005～1.000 ng/mL和1～20 ng/mL， 檢出限（LOD， S/N=3）為1.0 pg/mL。本方法具有靈敏度高、選擇性好的特點(diǎn)。

關(guān)鍵詞 金納米粒子； 氧化石墨烯； 甲胎蛋白； 普魯士藍(lán)； 夾心免疫傳感器

1 引 言

甲胎蛋白（AFP）是臨床診斷中常用的特異性的腫瘤標(biāo)志物，對(duì)原發(fā)性肝癌的早期診斷具有重要的臨床意義。目前，檢測(cè)血清中甲胎蛋白主要采用放射免疫法、電化學(xué)發(fā)光法、化學(xué)發(fā)光法和酶聯(lián)免疫法等[1～5]。放射免疫法檢測(cè)AFP能達(dá)到納克水平，但存在放射性污染； 電化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)速度快，但檢測(cè)成本比酶聯(lián)免疫法高； 化學(xué)發(fā)光法技術(shù)較為成熟，但是檢測(cè)時(shí)間較長(zhǎng)； 酶聯(lián)免疫法（ELISA）具有簡(jiǎn)單、靈敏、特異、快速及易于自動(dòng)化操作等特點(diǎn)，在生物工程[6]、臨床診斷[7～9]、藥物及環(huán)境分析[10～12]等方面應(yīng)用廣泛。ELISA法通常采用酶標(biāo)記抗體（或者抗原），標(biāo)記酶通常是分子量小、易制備的辣根過(guò)氧化酶（HRP）[7，12～14]。然而，HRP的本質(zhì)是蛋白質(zhì)，使用過(guò)程中存在易失活的問(wèn)題。

為了克服HRP等標(biāo)記酶易失活的缺點(diǎn)，很多具有優(yōu)良類過(guò)氧化酶催化活性的納米材料被應(yīng)用于ELISA檢測(cè)方法中[8～10]，其中普魯士藍(lán)（PB）具有獨(dú)特的三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，具備穩(wěn)定性好且制備成本低的優(yōu)點(diǎn)。另外，它還具有優(yōu)良的電化學(xué)可逆性，作為電子轉(zhuǎn)移媒介體，對(duì)過(guò)氧化氫表現(xiàn)出良好的電催化能力[15]。使用PB代替常規(guī)酶蛋白標(biāo)記抗體或抗原，可以克服現(xiàn)有酶標(biāo)記方法操作繁瑣、成本高、酶容易失活等缺陷。石墨烯具有導(dǎo)電性強(qiáng)、比表面積大、成本低等優(yōu)點(diǎn)[16～19]。將石墨烯做為PB的載體，可大大提高PB的負(fù)載量； 此外，它可以增加普魯士藍(lán)的穩(wěn)定性[20]。Fe3O4磁性納米材料具有良好的超順磁性、低毒性和生物兼容性，在生物催化、生物標(biāo)記等領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用[21～24]。磁性納米材料具有大的表面Gibbs自由能，可以降低體系的能量，化學(xué)穩(wěn)定性高。

本研究制備了氧化石墨烯/普魯士藍(lán)（GO-PBNCs）復(fù)合物，用聚二烯丙基二甲基氯化銨（PDDA）功能化的帶正電的GO-PBNCs吸附帶負(fù)電的金納米粒子（AuNPs），制得AuNP-GO-PBNCs納米復(fù)合材料，用此納米復(fù)合材料標(biāo)記AFP二抗（Ab2）。另外合成了磁性Fe3O4立方體，基于多巴胺（DA）與HAuCl4·4H2O反應(yīng)可生成聚多巴胺（PDA） 及金納米粒子，采用原位化學(xué)氧化聚合的方法制得Au-PDA-Fe3O4磁性納米復(fù)合物。利用磁性將Au-PDA-Fe3O4磁性納米復(fù)合物固定在自制的磁性電極表面后[25]，吸附固定anti-AFP，制備檢測(cè)AFP的磁性傳感電極。將此傳感電極與含有AFP抗原的樣品孵育； 再將已結(jié)合AFP抗原的電極與AuNP-GO-PBNCs納米復(fù)合材料標(biāo)記的二抗孵育，測(cè)定電極的電化學(xué)響應(yīng)信號(hào)。制備的以普魯士藍(lán)為標(biāo)記物的夾心免疫傳感器具有靈敏度高、檢出限低和穩(wěn)定性好的特性，在生物醫(yī)學(xué)、臨床診斷等方面有潛在的應(yīng)用價(jià)值。

2 實(shí)驗(yàn)部分

2.1 儀器與試劑

Quanta 200掃描電子顯微鏡（SEM，，美國(guó)FEI公司）； UV-2450紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)（日本Shimadzu公司）； X-射線衍射儀 （XRD， 英國(guó)Bede公司）； Autolab PGSTAT30/FRA2 電化學(xué)工作站（瑞士Metrohm公司）。采用三電極工作系統(tǒng)，修飾的磁性玻碳電極（MGCE）作為工作電極，飽和甘汞電極（SCE） 作為參比電極，鉑絲電極作為對(duì)電極（CE）。

甲胎蛋白（AFP）、anti-AFP（博賽生物有限公司）； 天然石墨片（99.8%，325目）、多巴胺（DA，99%）（Alfa Aesar公司）； 氯金酸（HAuCl4·4H2O，99.8% ）、牛血清白蛋白（BSA，≥98%） （Sigma公司）。以0.1 mol/L Na2HPO4-NaH2PO4磷酸鹽緩沖液（PBS， pH 5.91）為支持電解質(zhì)溶液。其它試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純，使用前未經(jīng)進(jìn)一步處理。實(shí)驗(yàn)用水為超純水（≥18 MΩ cm）。

2.2 實(shí)驗(yàn)方法2.2.1 Au-PDA-Fe3O4磁性納米復(fù)合材料的制備

根據(jù)文獻(xiàn)[26]制備磁性Fe3O4納米立方體。將Fe3O4納米立方體加入到1.0 mL PBS緩沖溶液中，濃度為0.5 mg/mL，在4℃劇烈攪拌條件下，加入500 μL 60 mmol/L （過(guò)量）多巴胺，再逐滴加入300 μL 2%（m/V） HAuCl4溶液，繼續(xù)攪拌30 min，得到Au-PDA-Fe3O4磁性納米復(fù)合材料。

2.2.2 Ab2-AuNP-GO-PBNCs生物復(fù)合材料的制備 采用Hummers方法合成氧化石墨烯（GO） [27，28]。在超聲條件下，用水將GO稀釋成1 mg/mL的懸浮液。取5 mL加入圓底燒瓶中，再加入0.2 mL 5 mmol/L FeCl3-K3[Fe（CN）6]（pH 1.6），置于30℃水浴中攪拌反應(yīng)2 h，溶液顏色由黃棕色變?yōu)樯钏{(lán)綠色，即得GO-PBNCs復(fù)合物。離心，用水清洗沉淀，再離心，至上清液為無(wú)色。如圖 1A 所示，在超聲條件下，將制得的GO-PBNCs復(fù)合材料加入到含0.625 mol/L KCl和1.25 mg/mL PDDA溶液中，繼續(xù)超聲處理3 h，離心清洗后，得到PDDA@GO-PB NCs復(fù)合材料，然后將其分散到5 mL 水中。根據(jù)文獻(xiàn)[29]方法制得AuNPs，在超聲條件下向10 mL AuNPs溶液中加入0.5 mL制得的PDDA@GO-PB NCs復(fù)合材料，放置過(guò)夜，次日離心，清洗后，將其分散在1 mL PBS緩沖溶液中，加入150 μL 2.0 μg/mL Ab2，在4℃下反應(yīng)12 h后，離心，用100 μL 1%（w/w） BSA封閉，得到Ab2-AuNP-GO-PBNCs復(fù)合材料。離心，沉淀分散在1 mL PBS溶液中，待用。

2.2.3 制備修飾電極及檢測(cè)AFP 依據(jù)文獻(xiàn)[30]制備磁性玻碳電極（MGCE）。將10 mg石墨粉和1.2 mL石蠟油混合均勻，調(diào)成碳糊，然后將適量碳糊填入長(zhǎng)50 mm、直徑3 mm聚四氟乙烯管中，將銅絲插在聚四氟乙烯管的一端，將一個(gè)厚2 mm、直徑3 mm的圓形磁鐵（其表面可產(chǎn)生0.2 T的非均勻磁場(chǎng)）放在距離管口約2 mm處的另一端，再在管口處放進(jìn)一個(gè)厚2 mm、直徑3 mm的玻碳，將磁鐵與玻碳緊緊連在一起，并將玻碳的邊沿用膠密封起來(lái)，即得到磁性玻碳電極。

將制備好的MGCE依次用1.0、0.3 和0.05 μm的Al2O3在麂皮上拋光至鏡面后，再依次用超純水、無(wú)水乙醇、0.1 mol/L HNO3、超純水超聲清洗，氮?dú)獯蹈?。吸? μL Au-PDA-Fe3O4磁性納米復(fù)合材料懸浮液，小心滴涂在MGCE表面，在磁場(chǎng)的作用下，電極表面緊緊固定一層Au-PDA-Fe3O4磁性納米復(fù)合材料，室溫下自然干燥，制得Au-PDA-Fe3O4修飾的MGCE。將已修飾好的MGCE浸入AFP一抗溶液中，在4℃條件下過(guò)夜。在室溫下，將電極浸入1% BSA溶液中約1 h，封閉電極上的非特異性吸附位點(diǎn)，即制得免疫傳感器。將制備好的傳感器分別浸入到不同濃度的AFP溶液中孵育50 min，吸取10 μL Ab2-AuNP-GO-PBNCs溶液，小心滴涂到修飾好的電極上，放置約1 h后，再用PBS緩沖液漂洗。將修飾好的電極浸入在含有1 mmol/L H2O2的PBS溶液（pH 5.91）中，采用差分脈沖伏安法（DPV）進(jìn)行檢測(cè)，免疫傳感器的制備以及檢測(cè)過(guò)程如圖1B所示。

3 結(jié)果與討論

3.1 GO-PBNCs與AuNP-GO-PBNCs復(fù)合材料的表征

由GO-PBNCs的掃描電鏡圖（圖2A）可見(jiàn)，大小均一的PBNCs附著在片狀的石墨烯表面； 用帶正電的PDDA功能化并吸附帶負(fù)電的AuNPs，其表面附著了一層均勻的Au NPs（圖2B）。UV-vis表征結(jié)果如圖2C所示，曲線a是GO的吸收光譜， 230 nm處的吸收對(duì)應(yīng)C=C雙鍵的π-π*躍遷[29]； 曲線b是GO-PBNCs復(fù)合物的吸收光譜，由于催化還原Fe3+，GO表面的電子密度發(fā)生了轉(zhuǎn)移，所以在230 nm處沒(méi)有明顯的吸收。而由于PB中的Fe2+與Fe3+的電荷轉(zhuǎn)移[28]，GO-PBNCs復(fù)合物約在740 nm處出現(xiàn)了一個(gè)寬峰，說(shuō)明在GO上成功生成PB[31]。曲線c在530 nm處有一吸收峰，為AuNPs的特征峰[32]，這是由于用PDDA功能化后的GO-PBNCs復(fù)合物帶正電，并吸附了帶負(fù)電的AuNPs后，這進(jìn)一步證實(shí)已成功合成AuNP-GO-PBNCs復(fù)合材料，上述結(jié)果與電鏡表征結(jié)果相一致。

3.2 Fe3O4與Au-PDA-Fe3O4磁性納米復(fù)合材料的表征

掃描電子顯微鏡（SEM）表征結(jié)果（圖3A）顯示，制備的Fe3O4的平均粒徑為30 nm，顆粒大小均勻。圖3B是Au-PDA-Fe3O4復(fù)合納米粒子的SEM圖像，未觀察到Fe3O4立方體粒子，這可能是由于利用多巴胺原位合成金納米粒子時(shí)， Fe3O4納米立方體被包裹在內(nèi)部。圖3C是Fe3O4納米立方體和Au-PDA-Fe3O4的UV-Vis圖譜，F(xiàn)e3O4納米立方體沒(méi)有明顯的紫外吸收（曲線a）； 曲線b是PDA的紫外吸收?qǐng)D譜，在280 nm出現(xiàn)了多巴胺的特征吸收[33]； 曲線c在530 nm處出現(xiàn)了金納米顆粒的特征吸收峰，表明在Fe3O4納米立方體表面確實(shí)形成了金納米層[34]，與電鏡的表征結(jié)果（圖3B）一致。

圖4為Fe3O4納米立方體和Au-PDA-Fe3O4的XRD圖譜。在圖4a上可見(jiàn)2θ=30.2°（220）、35.5°（311）、43.2°（400）、53.6°（422）、57.08°（511）和62.9°（440）等處的衍射峰，與ASTM標(biāo)準(zhǔn)數(shù)據(jù)卡片中Fe3O4圖相吻合，表明合成的物質(zhì)是立方尖晶石結(jié)構(gòu)的Fe3O4[35]。圖4b顯示，Au-PDA-Fe3O4復(fù)合物產(chǎn)物在2θ=38.1°、44.4°、64.6°和77.6°等處出現(xiàn)了清晰的特征衍射峰，分別對(duì)應(yīng)于Au （111）、（200）、（220）和（311）晶面，表明產(chǎn)物表面已經(jīng)覆蓋了一層金納米粒子[36]。另外，因?yàn)锳u是重金屬元素，且前文提到Fe3O4的外表面覆蓋了一層金，而Fe3O4的衍射峰相對(duì)Au的衍射峰太弱，因此很難觀測(cè)到。插圖是在外磁場(chǎng)條件下拍攝的，F(xiàn)e3O4懸浮液呈黑色，且均勻分散，若將一塊磁鐵放置在該懸浮液的一側(cè)，施加磁場(chǎng)，所有的Fe3O4立即聚沉，上清液則澄清透明。以上結(jié)果充分表明，F(xiàn)e3O4納米立方體具有良好的超順磁性，在外加磁場(chǎng)的作用下，可以將其固定在磁性玻碳電極（MGCE）表面[37，38]。

3.3 修飾電極的電化學(xué)行為

圖5A是在含有探針?lè)肿覽Fe（CN）6]3/4 （5.0 mmol/L）的電解質(zhì)溶液中，不同的修飾電極的交流阻抗復(fù)平面圖。曲線a為裸電極阻抗圖，在所有頻率范圍內(nèi)幾乎呈一條直線，表明探針?lè)肿臃浅Ｈ菀椎竭_(dá)MGCE電極表面發(fā)生氧化還原反應(yīng)，這一電化學(xué)過(guò)程是受擴(kuò)散控制的。當(dāng)在MGCE電極表面固定Fe3O4-PDA-Au時(shí)， Fe3O4-PDA-Au阻礙了探針?lè)肿酉螂姌O表面的擴(kuò)散，曲線在高頻區(qū)出現(xiàn)一個(gè)顯著的半圓，半圓直徑對(duì)應(yīng)于電極的電子傳遞阻抗（Rct），約145 Ω（曲線b）。Fe3O4-PDA-Au修飾電極吸附anti-AFP后（曲線c）， Rct增大，表明anti-AFP已成功吸附在電極MGCE/Fe3O4-PDA-Au上。用BSA封閉MGCE/Fe3O4-PDA-Au/anti-AFP 上的非特異性吸附位點(diǎn)即得MGCE/Fe3O4-PDA-Au/anti-AFP/BSA （曲線d），再與AFP孵育發(fā)生免疫反應(yīng)后得到MGCE/Fe3O4-PDA-Au/anti-AFP/BSA /AFP （曲線e），Rct逐漸增大，這證明AFP與anti-AFP發(fā)生了免疫反應(yīng)后，成功組裝在A修飾電極表面上，也證明了Fe3O4-PDA-Au可以保持anti-AFP的生物活性。然而，當(dāng)MGCE/Fe3O4-PDA-Au/anti-AFP/BSA /AFP進(jìn)一步與GO-PB-Au NPs-Ab2孵育后（曲線f），Rct相對(duì)發(fā)生免疫反應(yīng)后減小，這是由于GO和Au NPs具有很好的導(dǎo)電性，從而使得探針?lè)肿幽軌蜉^容易的到達(dá)電極表面。

電壓在0.2～0.5 V范圍內(nèi)，掃描速度為50 mV/s，對(duì)不同修飾電極進(jìn)行循環(huán)伏安掃描（圖5B）。PDA-Au/anti-AFP/BSA/AFP修飾電極未出現(xiàn)明顯的循環(huán)伏安峰，當(dāng)電極修飾Fe3O4-PDA-Au/anti-AFP/BSA/AFP后，背景電流顯著增大，說(shuō)明Fe3O4具有很強(qiáng)的導(dǎo)電性，起到增加電流的響應(yīng)信號(hào)的作用； 當(dāng)進(jìn)一步孵育GO-PB-Au NPs-Ab2后，出現(xiàn)了一對(duì)對(duì)稱的氧化還原峰，這是因?yàn)镻B是很好的氧化還原活性分子，當(dāng)在支持電解質(zhì)溶液中加入1 mmol/L H2O2后，還原峰電流明顯增大。因此，PB不僅起到了電子介體的作用，而且可作為一種“人工過(guò)氧化酶”，起到了電催化的作用。

3.4 孵化時(shí)間和溫度的影響

對(duì)免疫孵育時(shí)間進(jìn)行了優(yōu)化。隨著孵育時(shí)間的延長(zhǎng)，響應(yīng)電流也隨之增大，當(dāng)孵育時(shí)間超過(guò)50 min后，響應(yīng)電流信號(hào)基本保持不變，這表明當(dāng)孵育時(shí)間大于50 min時(shí)，電極上結(jié)合的AFP達(dá)到飽和，因此選擇50 min為最佳孵育時(shí)間。

溫度也是影響免疫反應(yīng)和抗原抗體穩(wěn)定性的重要因素。在15～50℃范圍內(nèi)，免疫傳感器的電流響應(yīng)信號(hào)隨著溫度的升高而先增大后降低，在37℃時(shí)達(dá)到最大，這是因?yàn)闇囟鹊纳哂欣谔岣呖乖c抗體的反應(yīng)。而溫度過(guò)高時(shí)，可能會(huì)導(dǎo)致抗原與抗體的蛋白分子變性，結(jié)合活性降低，使得組裝上的GO-PB-AuNPs-Ab2減少，從而相應(yīng)的PB及催化H2O2的響應(yīng)電流減小。因此選擇37℃為最佳測(cè)定溫度。

3.5 免疫傳感器的安培響應(yīng)

在最佳實(shí)驗(yàn)條件下，采用DPV檢測(cè)不同濃度AFP的結(jié)果如圖6所示。在不同濃度的AFP存在下，傳感器的電流響應(yīng)信號(hào)表現(xiàn)出兩段線性關(guān)系，線性范圍分別為 0.005～1.000 ng/mL和1～20 ng/mL，檢出限為1.0 pg/mL（S/N=3）。本方法與文獻(xiàn)報(bào)道方法的分析性能的比較見(jiàn)表1。

3.6 免疫傳感器的重現(xiàn)性和穩(wěn)定性

用同一根免疫電極對(duì)5 ng/mL AFP標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行重復(fù)測(cè)定6次，測(cè)量電化學(xué)響應(yīng)信號(hào)的RSD為2.7%。取6支同樣條件下制備的的免疫電極，對(duì)5 ng/mL AFP樣品進(jìn)行檢測(cè)，測(cè)定結(jié)果的RSD為4.3%，表明此傳感器具有良好的重現(xiàn)性。將制備好的免疫傳感器在4℃下放置30天后重新檢測(cè)，測(cè)得的電流值是初始電流響應(yīng)的93%，表明此傳感器具有良好的長(zhǎng)期穩(wěn)定性。

3.7 免疫傳感器的選擇性

為了進(jìn)一步研究傳感器測(cè)定AFP的選擇性，在最佳條件下，測(cè)定了免疫傳感器對(duì)5 ng/mL AFP及其它干擾物包括癌胚抗原（CEA，5 ng/mL）、牛血清白蛋白（BSA，5 ng/mL）、乙肝表面抗原（HBsAg， 5 ng/mL）的響應(yīng)，結(jié)果如圖7所示，免疫傳感器對(duì)AFP的響應(yīng)遠(yuǎn)大于其它干擾物，表明制備的免疫傳感器的抗干擾能力強(qiáng)，選擇性好。

4 結(jié) 論

以MGCE作為電極，基于AuNP-GO-PBNCs復(fù)合材料成功構(gòu)建了一種新型的甲胎蛋白夾心免疫傳感器，實(shí)現(xiàn)了對(duì)AFP的靈敏檢測(cè)。此傳感器靈敏度高，穩(wěn)定性好，線性范圍寬且成本低。所制備的AuNP-GO-PBNCs復(fù)合材料具有良好的導(dǎo)電性和大的比表面積，又可以作為電子介體催化過(guò)氧化氫，起到放大信號(hào)的作用。此免疫傳感器制作簡(jiǎn)單，使用方便，成本低，在生物醫(yī)學(xué)、臨床診斷、健康檢測(cè)等方面具有潛在的應(yīng)用價(jià)值。

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