基于對(duì)熒光銅納米簇合成的抑制檢測(cè)三聚氰胺

歐麗娟+羅建新+孫愛(ài)明+陳思羽+王凌云

摘 要 三聚氰胺能與銅離子（Cu2+）形成配合物，對(duì)熒光銅納米簇的合成有明顯抑制作用，且其抑制程度與三聚氰胺濃度在一定范圍內(nèi)呈線性關(guān)系。基于此構(gòu)建了一種簡(jiǎn)單、快速檢測(cè)三聚氰胺的方法。以聚T單鏈DNA為模板合成的銅納米簇作為熒光探針，當(dāng)三聚氰胺存在時(shí)，Cu2+與三聚氰胺生成配合物，阻礙銅納米簇的合成，導(dǎo)致熒光強(qiáng)度降低。在優(yōu)化的實(shí)驗(yàn)條件下，三聚氰胺濃度在5～120 μmol/L范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系，檢出限為1.5 μmol/L，牛奶樣品中三聚氰胺加標(biāo)回收率為96.3%～104.4%。與傳統(tǒng)納米金/銀、量子點(diǎn)等方法相比，本方法具有簡(jiǎn)單、快速、靈敏等優(yōu)點(diǎn)。

關(guān)鍵詞 銅納米簇； 銅-三聚氰胺配合物； 熒光； 非標(biāo)記

1 引 言

三聚氰胺是一種低毒性的氮雜環(huán)有機(jī)化工原料，常用于制造三聚氰胺樹(shù)脂，是建筑業(yè)常用的防火材料。由于其分子中含氮量為66%，且無(wú)味，摻雜后不易被發(fā)現(xiàn)，一些不良企業(yè)為降低成本，在乳制品和飼料中添加三聚氰胺，以提高食品檢測(cè)中蛋白質(zhì)含量指標(biāo)。然而，三聚氰胺會(huì)與尿酸結(jié)合生成難溶于水的結(jié)石[1]，導(dǎo)致腎積水、腎結(jié)石等腎臟膀胱疾病，甚至死亡。因此，發(fā)展快速、準(zhǔn)確、靈敏的三聚氰胺的測(cè)定方法對(duì)保障乳制品安全具有重要的實(shí)際意義。

傳統(tǒng)的三聚氰胺檢測(cè)方法包括高效液相色譜法[2]、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法[3]、電位滴定法[4]、酶聯(lián)免疫吸附分析法[5]等，上述方法一般需要專(zhuān)業(yè)的操作人員，且存在選擇性低或者精確度不高的不足，難以滿足實(shí)際食品監(jiān)管中快速、高效、低成本的檢測(cè)要求。近年發(fā)展的新方法， 如納米材料比色法[6～8]、熒光探針?lè)╗9]、分子印跡聚合物法[10]和表面增強(qiáng)拉曼散射技術(shù)[11，12]等，與傳統(tǒng)方法相比，具有檢出限低、靈敏度高的優(yōu)勢(shì)，但是預(yù)處理過(guò)程繁瑣耗時(shí)，需要衍生或者昂貴的儀器。

最近，Qing等[13]發(fā)現(xiàn)，富含胸腺嘧啶T的單鏈DNA可作為合成銅納米簇的有效模板。聚T為模板合成的銅納米簇?zé)晒鈴?qiáng)度高，而且尺寸和熒光強(qiáng)度可以通過(guò)聚T單鏈DNA的長(zhǎng)度來(lái)調(diào)節(jié)；此外，基于聚T單鏈DNA 的銅納米簇的合成在幾分鐘內(nèi)即可完成，比其它金屬納米簇的合成快速、簡(jiǎn)捷。如隨機(jī)dsDNA-銅納米簇合成中，為了保證雙鏈DNA模板的有效雜交，耗時(shí)需1 h以上[14]；DNA-銀納米簇的合成需要在黑暗中反應(yīng)24 h[15]；BSA-金納米簇的合成需要2 d[16]。

三聚氰胺可以通過(guò)芳香環(huán)上的氮原子與Cu2+形成配合物[17]。基于此，本研究提出了一種檢測(cè)三聚氰胺的方法。利用聚T單鏈DNA為模板合成的銅納米簇作為熒光探針，由于三聚氰胺與Cu2+發(fā)生配位反應(yīng)，阻礙了銅納米簇的合成，導(dǎo)致銅納米簇?zé)晒庑盘?hào)減弱。此方法用于三聚氰胺的檢測(cè)快速、操作簡(jiǎn)單、成本低，并成功用于實(shí)際牛奶樣品中三聚氰胺的檢測(cè)，在食品安全監(jiān)管等方面具有良好的應(yīng)用前景。

2 實(shí)驗(yàn)部分

2.1 儀器與試劑

含30個(gè)堿基的聚胸腺嘧啶寡聚核苷酸鏈（T30）由上海生工生物工程公司合成。3-（N-嗎啉基）-丙磺酸（MOPs）、抗壞血酸、CuSO4·5H2O、NaCl 和三聚氰胺（北京鼎國(guó)生物技術(shù)公司）；其它試劑均為分析純；實(shí)驗(yàn)用水為超純水（>18.25 MΩ·cm）。

Cary Eclipse熒光分光光度計(jì)（美國(guó)安捷倫公司），激發(fā)波長(zhǎng)340 nm，掃描范圍500～660 nm，激發(fā)狹縫設(shè)定為5.0 nm，發(fā)射狹縫設(shè)定為10.0 nm。

2.2 熒光銅納米簇的制備

T30DNA為模板的銅納米簇的制備參照文獻(xiàn)[13]的方法稍作修改，簡(jiǎn)述如下：將5 μmol/L T30-DNA、MOPs緩沖液（10 mmol/L MOPs，150 mmol/L NaCl，pH 7.6）、3 mmol/L抗壞血酸溶液混合均勻后，加入300 μmol/L CuSO4溶液，避光反應(yīng)1 min，得到熒光銅納米簇。

2.3 三聚氰胺的檢測(cè)

將300 μmol/L CuSO4溶液與不同濃度的三聚氰胺溶液混勻，室溫下孵育20 min。反應(yīng)后的溶液加入到含有5 μmol/L T30-DNA、MOPs緩沖液、3 mmol/L抗壞血酸溶液的體系中，室溫下避光反應(yīng)1 min，立即進(jìn)行熒光檢測(cè)。

3 結(jié)果與討論

3.1 實(shí)驗(yàn)原理

三聚氰胺可以通過(guò)芳香環(huán)上的N與Cu2+形成配合物[17]，基于此，本研究構(gòu)建了檢測(cè)三聚氰胺的策略，如圖1所示。以含30個(gè)堿基的聚胸腺嘧啶的單鏈DNA為模板，以抗壞血酸為還原劑， Cu2+被還原為Cu0，并富集在T30單鏈DNA上，生成具有強(qiáng)熒光的銅納米簇，并作為信號(hào)報(bào)告探針（圖1A）。當(dāng)三聚氰胺存在時(shí)，與Cu2+發(fā)生配位反應(yīng)，不利于Cu2+被還原為Cu0簇?fù)碓趩捂淒NA上，從而阻礙銅納米簇的合成，導(dǎo)致合成銅納米簇的熒光強(qiáng)度大大降低（圖1B），熒光強(qiáng)度降低的程度與三聚氰胺的濃度相關(guān)，基于此可以實(shí)現(xiàn)三聚氰胺的檢測(cè)。

3.2 三聚氰胺對(duì)熒光銅納米簇合成的影響

為了考察三聚氰胺是否能夠間接抑制CuNCs的合成，測(cè)定了三聚氰胺存在與否時(shí)CuNCs的熒光光譜。如圖2a所示， Cu2+不存在時(shí)，無(wú)熒光信號(hào)，說(shuō)明未合成CuNCs；Cu2+存在時(shí)，630 nm出現(xiàn)強(qiáng)的熒光發(fā)射峰（圖2b），證明在抗壞血酸作用下，Cu2+被還原為Cu0，聚集在T30單鏈DNA上，生成CuNCs，產(chǎn)生強(qiáng)的熒光信號(hào)。當(dāng)加入120 μmol/L三聚氰胺后，熒光強(qiáng)度大大降低（圖2c），說(shuō)明三聚氰胺與Cu2+形成配合物，阻礙了銅納米簇的合成，導(dǎo)致體系的熒光強(qiáng)度降低。以上結(jié)果表明，可以利用三聚氰胺對(duì)銅納米簇?zé)晒鈴?qiáng)度的減弱程度檢測(cè)三聚氰胺。

3.3 實(shí)驗(yàn)條件優(yōu)化

銅納米簇的合成時(shí)間對(duì)熒光檢測(cè)三聚氰胺有重要影響。研究表明，隨著銅納米簇合成時(shí)間的延長(zhǎng)，不加三聚氰胺時(shí)的空白熒光信號(hào)值F0基本趨于平穩(wěn)，但是加三聚氰胺的響應(yīng)熒光信號(hào)強(qiáng)度F有略微的增加，導(dǎo)致F0/F逐漸降低，降低了信噪比（圖3A）。因此，實(shí)驗(yàn)選用銅納米簇合成時(shí)間為1 min。

三聚氰胺與銅離子發(fā)生配位反應(yīng)，繼而阻礙銅納米簇的合成，導(dǎo)致熒光強(qiáng)度降低。因此，配位反應(yīng)時(shí)間也是一個(gè)重要因素。從圖3B可見(jiàn)，隨著絡(luò)合時(shí)間延長(zhǎng)，F(xiàn)0/F逐漸增加， 20 min達(dá)到最大并趨于平穩(wěn)。故選取三聚氰胺與Cu2+的配位反應(yīng)時(shí)間為20 min。

Cu2+被還原為Cu0結(jié)合在單鏈DNA上，形成熒光銅納米簇[14]。低濃度的Cu2+不利于合成銅納米簇。但是高濃度的Cu2+可與抗壞血酸產(chǎn)生氧的自由基降解DNA鏈，導(dǎo)致模板濃度降低，從而使銅納米簇?zé)晒鈴?qiáng)度降低[18]。因此，Cu2+的濃度對(duì)銅納米簇的熒光信號(hào)有重要影響。從圖3C可見(jiàn)，Cu2+濃度在100～700 μmol/L范圍內(nèi)時(shí)，F(xiàn)0/F先增加，于300 μmol/L達(dá)到最大值，繼續(xù)增大Cu2+濃度，F(xiàn)0/F反而降低。故選擇最佳Cu2+濃度為300 μmol/L。

抗壞血酸濃度也是影響銅納米簇合成的一個(gè)重要參數(shù)。從圖3D可知，隨著抗壞血酸濃度的增加，F(xiàn)0/F逐漸增大，在3 mmol/L處達(dá)到最大。故選取3 mmol/L作為最佳抗壞血酸濃度。

3.4 傳感器的分析性能

在最佳的實(shí)驗(yàn)條件下，對(duì)不同濃度的三聚氰胺進(jìn)行了檢測(cè)。圖4A為630 nm處熒光強(qiáng)度與三聚氰胺濃度的校正曲線圖。結(jié)果表明，隨著三聚氰胺濃度升高，熒光信號(hào)逐漸降低，在5～120 μmol/L范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系，線性相關(guān)系數(shù)為R2=0.998，檢出限為1.5 μmol/L （S/N=3），遠(yuǎn)低于國(guó)家規(guī)定的三聚氰胺限量值1 mg/kg[19]。與文獻(xiàn)報(bào)道的納米金、納米銀等方法[6，7，8，11，12]相比， 本方法檢出限更低，并且方法操作簡(jiǎn)單、快速。

為了證明本方法對(duì)三聚氰胺檢測(cè)的特異性，考察了牛奶中存在的常見(jiàn)金屬離子（Ca2+，F(xiàn)e3+，Zn2+）及氨基酸（甘氨酸Gly，賴(lài)氨酸Lys，組氨酸His）等其它可能產(chǎn)生干擾的物質(zhì)（葡萄糖Glc，苯胺Ani）的影響。從圖4B可見(jiàn)，只有三聚氰胺會(huì)導(dǎo)致銅納米簇?zé)晒怙@著降低，大多數(shù)干擾物質(zhì)的加入對(duì)銅納米簇?zé)晒鉀](méi)有影響。盡管L-組氨酸的咪唑環(huán)也可與Cu2+發(fā)生配位反應(yīng)，導(dǎo)致銅納米簇?zé)晒鉁p弱，但是響應(yīng)信號(hào)遠(yuǎn)小于三聚氰胺。

3.5 實(shí)際牛奶樣品分析

采用本方法檢測(cè)了牛奶樣品中三聚氰胺。牛奶樣品處理方法同文獻(xiàn)[20]：在牛奶樣品中加入三氯乙酸，超聲提取20 min，15000 r/min離心兩次。上清液過(guò)濾后，用NaOH溶液調(diào)至pH 7.0，采用本法進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果表明，牛奶樣品中未檢測(cè)出三聚氰胺。加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表1。樣品的加標(biāo)回收率在96.3%～104.4%之間，表明本方法具有良好的可靠性和準(zhǔn)確性，可用于實(shí)際樣品中三聚氰胺的檢測(cè)。

4 結(jié) 論

基于三聚氰胺與Cu2+絡(luò)合形成配合物，阻礙銅納米簇的合成，從而降低銅納米簇的熒光，建立了一種檢測(cè)三聚氰胺的靈敏方法。本方法成本低、無(wú)需標(biāo)記，操作簡(jiǎn)單、快速、靈敏度高、特異性好，可用于牛奶樣品中三聚氰胺檢測(cè)，具有良好的的應(yīng)用前景。

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