咪康唑?qū)Υ笫笕毖跞毖栽绠a(chǎn)兒腦白質(zhì)損傷的保護(hù)作用

湯文燕蘇學(xué)文楊印祥欒 佐

1.南方醫(yī)科大學(xué)第三臨床醫(yī)學(xué)院（廣東廣州 510515）；2.中國人民解放軍海軍總醫(yī)院 （北京 100048）

咪康唑?qū)Υ笫笕毖跞毖栽绠a(chǎn)兒腦白質(zhì)損傷的保護(hù)作用

湯文燕1,2蘇學(xué)文2楊印祥2欒 佐1,2

1.南方醫(yī)科大學(xué)第三臨床醫(yī)學(xué)院（廣東廣州 510515）；2.中國人民解放軍海軍總醫(yī)院 （北京 100048）

目的探討咪康唑?qū)υ绠a(chǎn)兒腦白質(zhì)損傷（WMD）大鼠髓鞘的保護(hù)作用。方法新生3日齡SD大鼠隨機分為假手術(shù)組、WMD模型組、10 mg/(kg·d))和40 mg/(kg·d)咪康唑組，每組15只；采用結(jié)扎右側(cè)頸總動脈，缺氧80 min的方法制作早產(chǎn)兒WMD模型。咪康唑組于建模后第1～5天腹腔注射10 mg/(kg·d)和40 mg/(kg·d)咪康唑，WMD模型組注射等濃度二甲基亞砜(DMSO)。采用髓鞘堿性蛋白（MBP）免疫熒光染色及Western blot檢測腦白質(zhì)特異性MBP表達(dá)量，超微結(jié)構(gòu)電鏡觀察髓鞘超微結(jié)構(gòu)變化，并比較各組幼鼠體質(zhì)量變化。結(jié)果WMD大鼠經(jīng)咪康唑治療后，胼胝體MBP表達(dá)量較WMD模型組高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。咪康唑治療組MBP的表達(dá)量較模型對照組增高。模型對照組胼胝體髓鞘疏松，髓鞘內(nèi)小空泡形成，呈篩網(wǎng)狀改變，髓鞘厚度明顯降低，結(jié)構(gòu)紊亂。經(jīng)咪康唑治療后可明顯改善缺氧缺血所致的脫髓鞘改變。WMD模型組幼鼠體質(zhì)量增長速度較假手術(shù)組明顯減慢，咪康唑治療后大鼠的體質(zhì)量生長速度增快。結(jié)論咪康唑可通過促進(jìn)髓鞘形成保護(hù)新生大鼠腦缺氧缺血誘導(dǎo)的白質(zhì)損傷，并改善大鼠的生長發(fā)育情況。

腦白質(zhì)損傷； 咪康唑； 髓鞘堿性蛋白； 早產(chǎn)兒

腦白質(zhì)損傷（white matter damage，WMD）是早產(chǎn)兒腦損傷最主要的類型，也是導(dǎo)致早產(chǎn)兒認(rèn)知缺陷和腦性癱瘓等神經(jīng)發(fā)育障礙的主要原因[1]。WMD患兒的發(fā)病機制主要是由于腦血流的改變和腦組織代謝的改變，造成內(nèi)源性少突膠質(zhì)前體細(xì)胞（oligodendrocyte precursor cells，OPCs）大量丟失而出現(xiàn)少突膠質(zhì)細(xì)胞（oligodendrocytes，OLs）成熟、髓鞘形成障礙，從而引起腦白質(zhì)損傷[2]。缺氧缺血和感染是引起新生兒腦白質(zhì)損傷最主要的原因[3]，最終病理結(jié)果均為白質(zhì)的損傷與丟失。對新生兒缺氧缺血性腦損傷的治療，目前國內(nèi)外尚無統(tǒng)一、有效的治療方案，探尋更有效的治療方法己成為目前研究的重點之一。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)咪康唑可促進(jìn)OPCs分化和髓鞘形成，從而改善多發(fā)性硬化（multiple sclerosis, MS）的臨床癥狀[4]。本研究初步探討新型促髓鞘再生藥物咪康唑?qū)υ绠a(chǎn)兒WMD模型大鼠髓鞘形成的保護(hù)作用，為咪康唑用于早產(chǎn)兒WMD的治療提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動物模型建立及分組

新生3日齡Sprague-Dawley（SD）大鼠60只，雌雄不限，體質(zhì)量7～8 g，由北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司提供。飼養(yǎng)環(huán)境清潔級，維持12 h明暗交替，自由進(jìn)食、水。實驗動物隨機分為假手術(shù)組、WMD模型組、10 mg/(kg·d)和40 mg/(kg·d)咪康唑組，每組15只。新生3日齡SD大鼠無菌環(huán)境下戊巴比妥鈉麻醉后，四肢仰臥位固定于手術(shù)臺，醫(yī)用碘伏消毒頸部皮膚，行頸部正中切口，逐層分離右側(cè)皮下組織，找到與頸內(nèi)靜脈及迷走神經(jīng)相伴行的頸總動脈并游離，用電凝筆切斷血管永久性結(jié)扎右側(cè)頸總動脈，分層縫合皮膚切口。假手術(shù)組僅游離出右側(cè)頸總動脈，不做結(jié)扎及缺氧處理；術(shù)后將幼鼠置37 ℃恒溫墊上，待幼鼠麻醉復(fù)蘇后，置于6%氧氣、94%氮氣的33 ℃恒溫缺氧箱中缺氧80min后返回母鼠籠中繼續(xù)喂養(yǎng)[5]。咪康唑處理組腹腔注射不同劑量，10 mg/(kg·d)和40 mg/(kg·d)的咪康唑，注射藥物時間為造模后第1、2、3、4、5天，1次/d，連續(xù)注射5天。模型對照組腹腔注射與咪康唑處理組等濃度的DMSO溶液，假手術(shù)組不做任何處理。

1.2 方法

1.2.1 腦組織切片制備 生后12天，行戊巴比妥鈉（50 mg/kg）腹腔注射麻醉，開胸暴露心臟，經(jīng)左心室灌注生理鹽水（總量約為100 mL）的同時剪開右心耳，再用4%多聚甲醛（約100 mL）灌注固定；斷頭取腦后，腦組織立即置于4%多聚甲醛固定24 h，次日換為30%蔗糖溶液內(nèi)脫水直至組織塊沉底。脫水腦組織于－20 ℃冰凍切片機連續(xù)切片，切片厚約10 μm。

1.2.2 免疫熒光染色 磷酸鹽緩沖液（PBS）洗滌腦組織切片3次，0.03% TritonX-100破膜45 min后，用5%羊血清封閉60 min。吸除封閉液，不清洗，加入MBP一抗，4 ℃過夜。次日，吸除一抗，PBS洗滌3次，加入抗小鼠二抗，室溫避光孵育兩小時，孵育后，PBS洗滌3次，于熒光顯微鏡下觀察并進(jìn)行拍照。應(yīng)用Image-Pro Plus 6.0軟件將熒光照片轉(zhuǎn)換為黑白圖片然后選取相同的黑色作為判斷所有照片陽性的統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)，對每張照片進(jìn)行分析得出每張照片陽性的累積光密度值（IOD），檢測腦白質(zhì)特異性MBP表達(dá)（n=5）。

1.2.3 Western blot檢測 按照術(shù)前實驗分組設(shè)計，各分組每次分別取3只幼鼠，行戊巴比妥鈉（50 mg/ kg）腹腔注射麻醉后，幼鼠迅速斷頭取腦。利用蛋白提取試劑盒提取大鼠胼胝體腦組織蛋白，然后進(jìn)行蛋白定量，樣品加熱變性后每孔加等質(zhì)量蛋白樣品，采用10% SDS-PAGE電泳，10 V轉(zhuǎn)膜過夜。5%脫脂牛奶室溫封閉0.5 h后，加入MBP一抗（1:1 000），4 ℃孵育12 h后，辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記的對應(yīng)二抗（1:3 000）室溫孵育0.5 h，然后放入化學(xué)發(fā)光儀中顯影。運用AlphaEase FC軟件分析目的條帶灰度值（GAPDH標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)參對照），計算MBP相對值表達(dá)量。

1.2.4 超微結(jié)構(gòu)電鏡 生后12天，戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉，用2%戊二醛心臟灌注，斷頭取腦，選取右側(cè)胼胝體腦組織1 mm×1 mm×1 mm，立即置于2%戊二醛4 ℃固定保存。1%鋨酸4 ℃下固定2 h 后，用30%～100%濃度丙酮梯度脫水。將脫水后組織置環(huán)氧樹脂包埋劑中浸泡、包埋，再行加溫聚合。修整組織包埋塊，用超薄切片機制備髓鞘橫斷面切片，片厚約50 nm，載網(wǎng)收集切片，并對切片用蠟酸鈾染色。在透射電鏡下觀察髓鞘形成情況，拍照分析電鏡結(jié)果（n=2）。

1.2.5 大鼠體質(zhì)量變化 各組實驗大鼠分別于術(shù)前、術(shù)后1、3、5、7、9天及生后11天同一時間段電子天平稱量體質(zhì)量，記錄并觀察四組實驗大鼠體質(zhì)量的變化（n=5）。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS 21.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，各組間均數(shù)比較采用單因素方差分析，組內(nèi)比較采用t檢驗。P<0.05為具有統(tǒng)計學(xué)差異。

2 結(jié)果

2.1 免疫熒光染色MBP表達(dá)情況

通過MBP免疫熒光染色觀察到：WMD模型組白質(zhì)區(qū)胼胝體可見明顯的髓鞘丟失（圖1A）。WMD模型組、10 mg/(kg·d)咪康唑組、40 mg/(kg·d)咪康唑組的胼胝體MBP表達(dá)量差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=37.37，P<0.001）；10 mg/(kg·d)咪康唑組和40 mg/(kg·d)咪康唑組的胼胝體MBP表達(dá)量均高于WMD模型組，40 mg/(kg·d)咪康唑組高于10 mg/(kg·d)咪康唑組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。見表1、圖1。

圖1 髓鞘堿性蛋白（MBP）免疫熒光染色

表1 各組大鼠IOD比較(±s)

表1 各組大鼠IOD比較(±s)

注：1)與WMD模型組比較，P<0.05；2)與10 mg·kg－1·d－1咪康唑組比較，P<0.05

組 別 IOD WMD模型組 8 681.10±1 396.50 10 mg·kg－1·d－1咪康唑組 16 478.90±2 652.401)40 mg·kg－1·d－1咪康唑組 25 316.46±1 940.321)2)F值 37.37 P <0.001

2.2 Western blot檢測胼胝體MBP表達(dá)

Western blot結(jié)果顯示，與WMD模型組（0.17）比較，咪康唑處理組MBP蛋白的表達(dá)量（目的條帶灰度值和內(nèi)參條帶灰度值比值）有所提高。且10 mg/(kg·d)咪康唑組（0.52）較10 mg/(kg·d)咪康唑組（0.31）高。由此可見，咪康唑增加胼胝體MBP髓鞘蛋白的表達(dá)，提示其對缺氧缺血導(dǎo)致的腦白質(zhì)損傷具有一定的保護(hù)作用。見圖2。

圖2 Western blot檢測髓鞘堿性蛋白（MBP）的表達(dá)量

2.3 超微結(jié)構(gòu)電鏡結(jié)果

透射電鏡觀察各組大鼠腦室周圍白質(zhì)髓鞘的超微結(jié)構(gòu)，WMD模型組罕見髓鞘形成，神經(jīng)纖維形態(tài)不規(guī)則，排列松散，髓鞘厚度明顯降低。經(jīng)10 mg/(kg·d)和40 mg/(kg·d)咪康唑治療后髓鞘數(shù)量較WMD模型組明顯增多，并可明顯改善缺血所致的脫髓鞘和髓鞘厚度降低。提示咪康唑明顯有助于改善早產(chǎn)兒WMD大鼠腦白質(zhì)髓鞘形成不良的狀況。見圖3。

2.4 體質(zhì)量增長速度

各組大鼠術(shù)前平均體質(zhì)量分別為（7.7±0.3）g、（7.6±0.4）g、（7.6±0.3）g、（7.5±0.3）g，各組間體質(zhì)量差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。術(shù)后第1天，假手術(shù)組的體質(zhì)量最高，高于其他三組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），而其他三組之間的差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。術(shù)后第3、5、7、9、11天，假手術(shù)組的體質(zhì)量仍然最高，高于其他三組。并且，10 mg/(kg·d)和40 mg/(kg·d)咪康唑組的體質(zhì)量均高于WMD模型組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），值得注意的是，10 mg/ (kg·d)和40 mg/(kg·d)咪康唑組之間的體質(zhì)量差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。見表2。

圖3 超微結(jié)構(gòu)電鏡

3 討論

早產(chǎn)兒WMD可引起長期的運動和認(rèn)知功能障礙，是兒童腦癱和智力障礙的主要病因之一。極低出生體質(zhì)量兒（<1 500 g）是早產(chǎn)兒WMD的高危人群，10%～15%可出現(xiàn)運動功能障礙，25%～50%呈現(xiàn)認(rèn)知、行為缺陷或社會化功能障礙[6]，是早產(chǎn)兒神經(jīng)系統(tǒng)和智能發(fā)育障礙的最主要原因，已成為影響早產(chǎn)兒生存質(zhì)量的嚴(yán)重問題，引起了廣泛關(guān)注。遺憾的是，目前早產(chǎn)兒WMD沒有任何有效的治療方法。WMD發(fā)病的主要原因是腦內(nèi)OPCs損傷，腦白質(zhì)髓鞘化延遲或被破壞。近年來，不斷有研究學(xué)者將外源性O(shè)PCs移植入動物腦內(nèi)，驗證其是否存活并分化為成熟OLs，發(fā)揮髓鞘化的作用。2009年，研究者將OPCs移植到脂多糖誘導(dǎo)的腦室周圍白質(zhì)軟化（PVL）模型大鼠，7周后觀察發(fā)現(xiàn)絕大多數(shù)移植細(xì)胞存活，但仍表達(dá)NG2、O4、Olig2等OPCs特異性標(biāo)記物，這說明移植的OPCs沒有分化為成熟的OLs[7]。又有研究者將人神經(jīng)干細(xì)胞誘導(dǎo)而來的OPCs移植到脫髓鞘模型小鼠，盡管移植8周后仍可見大量植入細(xì)胞，僅有不到2%細(xì)胞表達(dá)成熟OLs特異性標(biāo)記物MBP[8]。這些研究結(jié)果表明，盡管移植的OPCs能夠遷移至損傷區(qū)域并長期存活，但絕大多數(shù)細(xì)胞并不能分化為成熟OLs，而是保持在前體細(xì)胞階段。神經(jīng)系統(tǒng)的自我修復(fù)一直以來都是世界難題，研究發(fā)現(xiàn)中樞神經(jīng)生長微環(huán)境是影響神經(jīng)元、軸突再生的一個關(guān)鍵因素[9]；近年來，從改善神經(jīng)再生微環(huán)境入手，尋找促進(jìn)軸突再生的有效靶點成為了神經(jīng)修復(fù)研究的新方向[10]。

既然外源性O(shè)PCs在腦內(nèi)難以分化為OLs，發(fā)揮成髓鞘作用。因此，我們嘗試尋找一種促進(jìn)內(nèi)源性O(shè)PCs存活、分化及髓鞘形成的方法來治療各種脫髓鞘病變將會是脫髓鞘性疾病新的曙光。目前，大多數(shù)的藥物都是依靠強大的抗炎和免疫抑制作用來減少免疫系統(tǒng)對髓鞘的攻擊來緩解脫髓鞘病變的臨床癥狀，但這類藥物對疾病的進(jìn)展卻影響甚微。因此，尋找非免疫性介導(dǎo)的藥物來促進(jìn)體內(nèi)OPCs的分化和髓鞘再生至關(guān)重要。研究發(fā)現(xiàn)，像苯托品[11]等毒蕈堿受體拮抗劑類小分子藥物，可促進(jìn)髓鞘再生，進(jìn)而改善MS的疾病進(jìn)展。值得一提的是，該類拮抗劑中的另一成員，已獲FDA批準(zhǔn)且目前廣泛用于抗真菌感染治療的咪康唑，可高效地促進(jìn)體外培養(yǎng)的OPCs的分化，并可促進(jìn)MS脫髓鞘鼠內(nèi)源性O(shè)PCs的分化，這表明咪康唑在OPCs分化早期起重要的調(diào)控作用。鑒于此，我們發(fā)現(xiàn)咪康唑同樣可以促進(jìn)早產(chǎn)兒WMD模型大鼠內(nèi)源性O(shè)PCs的分化，發(fā)揮成髓鞘作用，對早產(chǎn)兒WMD導(dǎo)致的缺氧缺血性損傷具有保護(hù)性作用。

研究證實，大鼠腦白質(zhì)的易損期是生后2～3天，而生后2天的大鼠手術(shù)后極易造成幼鼠死亡[12]。因此，本研究選取新生3日齡SD大鼠，采用結(jié)扎右側(cè)頸總動脈，缺氧80 min的方法制作早產(chǎn)兒WMD模型。造模后，缺氧缺血所致的脫髓鞘損傷開始逐漸加劇，并且，咪康唑可通過血腦屏障到達(dá)腦組織，因此，我們選擇在造模后第1天腹腔注射不同濃度的咪康唑，力圖在損傷的高峰期保護(hù)髓鞘的繼續(xù)脫失，并促進(jìn)內(nèi)源性O(shè)PCs的分化，從而達(dá)到治療的目的。

本研究主要還通過MBP免疫熒光染色、Western blot以及超微結(jié)構(gòu)電鏡等手段，觀察咪康唑?qū)Ls成髓鞘的保護(hù)作用。整個實驗結(jié)果將為咪康唑應(yīng)用于臨床治療WMD提供了實驗依據(jù)，并為治療WMD藥物的研發(fā)提供了新的思路。本研究發(fā)現(xiàn)，通過MBP免疫熒光染色觀察到WMD大鼠經(jīng)10 mg/(kg·d)和 40 mg/ (kg·d)咪康唑治療后，胼胝體MBP表達(dá)量較WMD模型組高，且40 mg/(kg·d)咪康唑組MBP表達(dá)水平較10 mg/(kg·d)咪康唑組高；Western blot結(jié)果也顯示咪康唑處理組MBP表達(dá)水平較模型對照組高；并且，電鏡結(jié)果進(jìn)一步證實了經(jīng)咪康唑治療后，可明顯改善缺氧缺血所致的脫髓鞘改變。因此，咪康唑有助于改善早產(chǎn)兒WMD大鼠腦白質(zhì)髓鞘形成不良的狀況。同時，本研究通過觀察各組大鼠的體質(zhì)量來評估其生長發(fā)育情況，發(fā)現(xiàn)咪康唑可有效改善缺氧缺血后幼鼠的生長發(fā)育情況，但40 mg/(kg·d)咪康唑組的體質(zhì)量增長速度與10 mg/(kg·d)咪康唑組相比，差異沒有統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05），我們分析這可能是由于高濃度的咪康唑會對新生大鼠的消化系統(tǒng)有一定的不良反應(yīng)，例如惡心、嘔吐、腹瀉和食欲減退等，從而導(dǎo)致早產(chǎn)兒WMD大鼠的生長發(fā)育產(chǎn)生一定的影響。

表2 各組大鼠不同日齡體質(zhì)量的比較 （±s, g）

表2 各組大鼠不同日齡體質(zhì)量的比較 （±s, g）

注：1)與WMD模型組比較，P<0.05；2)與10 mg·kg－1·d－1咪康唑組比較，P<0.05；3)與40 mg·kg－1·d－1咪康唑組比較，P<0.05

組 別 術(shù)前 術(shù)后1天 術(shù)后3天 術(shù)后5天 術(shù)后7天 術(shù)后9天 術(shù)后11天WMD模型組 7.7±0.3 7.8±0.3 9.5±0.5 12.5±0.6 14.8±1.1 17.5±1.2 21.5±1.4 10 mg·kg－1·d－1咪康唑組7.6±0.4 8.0±0.7 10.8±0.41) 14.3±1.01) 17.7±0.81) 21.4±1.11) 25.0±1.51)40 mg·kg－1·d－1咪康唑組7.6±0.3 7.9±0.2 11.0±1.21) 14.1±0.71) 18.6±1.11) 21.9±1.01) 24.7±1.41)假手術(shù)組 7.5±0.3 9.0±0.41)2)3)13.0±0.71)2)3)16.6±1.11)2)3)21.2±1.51)2)3)27.2±1.01)2)3)32.3±1.71)2)3)F值 0.217 9.419 17.205 19.533 26.666 69.956 45.442 P 0.883 0.001 <0.001 <0.001 <0.001 <0.001 <0.001

綜上所述，咪康唑可以通過促進(jìn)髓鞘的形成保護(hù)缺氧缺血誘導(dǎo)的早產(chǎn)兒WMD，并改善其生長發(fā)育情況。然而，本研究僅僅是咪康唑?qū)Υ笫笕毖跞毖栽绠a(chǎn)兒WMD保護(hù)作用的初步探討，還需要進(jìn)一步的研究明確：①咪康唑促進(jìn)內(nèi)源性O(shè)PCs發(fā)育分化的最佳劑量，加大單次劑量或追加給藥次數(shù)是否對腦損傷有更好的保護(hù)作用；②咪康唑的最佳用藥方式，腹腔注射是否為最佳的用藥方式呢？其是否適用于肌肉注射，皮下注射或是靜脈注射呢等方式呢？這都需要進(jìn)一步的研究探討；③咪康唑的最佳給藥時間窗及其給藥次數(shù)；④此外，咪康唑促進(jìn)內(nèi)外源性O(shè)PCs發(fā)育分化以及髓鞘形成的作用機制也需要進(jìn)一步的研究探討，我們會在后續(xù)的實驗中探討這部分的研究。

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Protective effect of miconazole on white matter damage induced by anoxia and ischemia in rats

TANG Wenyan1,2, SU Xuewen2, YANG Yinxiang2, LUAN Zuo1,2
(1. The Third Clinical College of Southern Medical University, Guangzhou 510515, Guangdong, China；2. Navy General Hospital of Chinese People’s Liberation Army, Beijing 100048, China)

ObjectiveTo explore the protective effect of miconazole on white matter damage (WMD) in neonatal rats.MethodsThree-day-old neonatal SD rats were randomly divided into sham group, WMD model group, 10 mg/(kg·d) miconazole group and 40 mg/(kg·d) miconazole group with 15 rats each. Rats in WMD model group were subjected to the ligation of right carotid artery, and then kept in a chamber with 6% oxygen and 94% nitrogen for 80 min to establish the white matter damage model. The rats in miconazole group were intraperitoneally injected with different doses (10 and 40mg/kg) of miconazole, dissolved in dimethyl sulfoxide (DMSO), for fi ve consecutive days, and rats in WMD model group were injected with the same volume of DMSO. Myelin basic protein (MBP) of white matter was detected by immuno fl uorescence staining and western blot. Myelin sheaths of corpus callosum were observed by transmission electron microscopy. Weight changes of rats were compared among groups.ResultsImmuno fl uorescence staining and western blot showed that, after treatment with miconazole, the MBP expression level of corpus callosum was higher than in WMD model group (P<0.05). In WMD model group, the myelin sheath of corpus callosum had loose structure and a large number of small vacuoles with decreased thickness of myelin sheath. After treatment with miconazole, myelinolysis induced by anoxia and ischemia could be improved signi fi cantly. The increase in weight of rats in WMD model group was signi fi cantly less than that in sham group. And after miconazole treatment, the rate of weight gain of rats was increased. Conclusion Miconazole can signi fi cantly reduce the brain white matter damage induced by anoxia and ischemia through promoting myelination, and then improves the growth and development in rats.

white matter damage; miconazole; myelin basic protein; premature infant

10.3969/j.issn.1000-3606.2017.06.016

2016-10-16)

(本文編輯：鄒 強)

國家自然科學(xué)基金面上項目（No.81471486）；國家國際科學(xué)合作專項（No.2012DFA30880）

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