慢性睡眠限制對幼鼠空間學(xué)習(xí)記憶能力的影響

劉 艷，吳衛(wèi)平

解放軍總醫(yī)院 南樓神經(jīng)內(nèi)科，北京 100853

慢性睡眠限制對幼鼠空間學(xué)習(xí)記憶能力的影響

劉 艷，吳衛(wèi)平

解放軍總醫(yī)院 南樓神經(jīng)內(nèi)科，北京 100853

目的探討慢性睡眠限制對幼鼠空間學(xué)習(xí)記憶能力的影響。方法將24只1月齡SD雄性鼠隨機分為慢性睡眠限制組、睡眠剝奪組和對照組，每組8只。對慢性睡眠限制組幼鼠進行連續(xù)5 d每天6 h的睡眠限制，采用“溫和處理法”；對睡眠剝奪組幼鼠進行連續(xù)5 d每天6 h的睡眠剝奪，采用“多平臺水環(huán)境法”。分別在睡眠干預(yù)前和干預(yù)第1、3、5天應(yīng)用Morris水迷宮方法檢測幼鼠的空間學(xué)習(xí)記憶能力。結(jié)果水迷宮實驗顯示睡眠限制組、睡眠剝奪組幼鼠在睡眠干預(yù)的第3天、第5天，到達平臺的平均潛伏期、探索路程較對照組延長(P＜0.05)，其中睡眠剝奪組在第5天的影響最顯著(P＜0.01)；在睡眠干預(yù)的第5天，睡眠限制組、睡眠剝奪組幼鼠之間出現(xiàn)了差別，睡眠剝奪組幼鼠的潛伏期、探索路程較睡眠限制組延長(P＜0.05)；而在空間探測實驗中，3組幼鼠在平臺所在象限時間的百分比、穿環(huán)次數(shù)有顯著差異：睡眠剝奪組較睡眠限制組減少(P＜0.05)，較對照組顯著減少(P＜0.01)；睡眠限制組較對照組減少(P＜0.05)。結(jié)論連續(xù)5 d、每天6 h的慢性睡眠限制可減弱幼鼠的空間學(xué)習(xí)記憶能力，但其影響程度小于同等時間的睡眠剝奪。

慢性睡眠限制；睡眠剝奪；學(xué)習(xí)記憶；幼鼠

睡眠是維持人類許多生理功能穩(wěn)態(tài)所必需的，睡眠對記憶的形成、存儲等都具有重要作用[1-2]。睡眠不足可引起學(xué)習(xí)記憶的損害，這一點已有廣泛的研究證實[3-6]。但目前國內(nèi)此類研究，主要集中于快速眼球運動(rapid eyes movement，REM)睡眠的剝奪，對慢性睡眠限制(chronic sleep restriction，CSR)的研究較少。許志強等[7]曾報道慢性睡眠限制可對成年大鼠的空間學(xué)習(xí)記憶能力造成損傷，但國內(nèi)未見到慢性睡眠限制對未成年幼鼠影響的相關(guān)報道。Yang等[8]通過“輕觸法”對未成年幼鼠實施每日4 h、連續(xù)7 d的CSR，結(jié)果導(dǎo)致幼鼠的空間學(xué)習(xí)記憶能力受損；但該研究未將REM睡眠剝奪與慢性睡眠限制兩種睡眠干預(yù)模型進行比較。CSR采用較溫和的方式在每天特定時間段限制睡眠，連續(xù)數(shù)天，與傳統(tǒng)睡眠剝奪方式相比，CSR對研究對象產(chǎn)生的額外應(yīng)激壓力更小[9]。為進一步探討二者作用異同，我們分別對未成年鼠進行了兩組睡眠干預(yù)方式，并比較了其學(xué)習(xí)記憶能力的差異?，F(xiàn)報道如下。

材料和方法

1 動物及分組 選用健康雄性1月齡SD鼠24只，置22℃室溫下，12 h明暗交替光照環(huán)境(光照周期7：00 - 19：00)，自由飲水、進食。將24只幼鼠隨機分為慢性睡眠限制組、睡眠剝奪組(sleep deprivation，SD)和對照組，每組各8只。

2 睡眠干預(yù)措施 對慢性睡眠限制組幼鼠進行連續(xù)5 d每天6 h的睡眠限制方案，時間為7：00 -13：00，剝奪方法采用“溫和處理法”：當(dāng)發(fā)現(xiàn)幼鼠有睡眠行為出現(xiàn)時，通過輕敲或晃動飼養(yǎng)籠、將幼鼠從籠子中移出等方法來阻止幼鼠睡眠行為的發(fā)生[9]。每天剩余時間即從當(dāng)日13：00至次日晨7：00，幼鼠可有充分的睡眠時間。對睡眠剝奪組幼鼠進行連續(xù)5 d每天6 h的睡眠剝奪方案，采用“多平臺水環(huán)境法”制作大鼠REM睡眠剝奪模型：睡眠剝奪箱大小為150 cm×30 cm×30 cm，放置直徑為4.5 cm、高8 cm的平臺8只。剝奪箱內(nèi)注有水，水面低于平臺2 cm，水溫保持在(20±2)℃。大鼠可以在平臺上自由攝取食物和水，但當(dāng)進入睡眠時，由于骨骼肌的松弛使大鼠掉入水中而驚醒，造成REM睡眠剝奪。剝奪時間段等其他情況同睡眠限制組。對照組幼鼠不采取任何睡眠干預(yù)措施。

3 學(xué)習(xí)記憶能力測試 采用Morris水迷宮測量幼鼠的學(xué)習(xí)和記憶能力[10]。Morris水迷宮直徑150 cm，高50 cm，水深30 cm，水溫22℃。玻璃平臺位于固定于東北象限中央，直徑10 cm，高29 cm。用墨水將水染黑。實驗分為定位航行實驗和空間探測實驗兩個部分：1)定位航行實驗：分別在睡眠干預(yù)前和睡眠干預(yù)第1、3、5天進行4次測試，每次測試時將幼鼠從東、南、西、北4個入水點放入水中，入水時面向池壁。每只幼鼠在各個入水點進行兩個輪次測試。測試時每只幼鼠有120 s時間尋找站臺，找到站臺后，允許其在站臺上呆30 s，然后開始同一入水點第二輪次的測試。如果120 s內(nèi)沒有找到站臺，那就把幼鼠引到站臺上放置30 s。觀察并記錄幼鼠找到并爬上平臺的潛伏期、探索路程。2)空間探測實驗：在第5天睡眠干預(yù)完成并進行完定位航行實驗后，撤除水下平臺，將幼鼠從最后一次入水點面向池壁放入水中，使幼鼠在水迷宮中連續(xù)游泳，記錄其在90 s內(nèi)在平臺所在象限時間的百分比和穿越原平臺所在地的次數(shù)。

4 統(tǒng)計學(xué)分析 應(yīng)用SPSS13.0統(tǒng)計學(xué)軟件進行處理，計量資料以±s表示，組間比較采用t檢驗。

結(jié) 果

1 Morris水迷宮定位航行實驗 在定位航行實驗的檢測中，睡眠干預(yù)前、干預(yù)的第1天各個入水點兩輪次的平均潛伏期在CSR組、SD組和對照組差異無統(tǒng)計學(xué)意義，其對應(yīng)的平均路程在3組間差異也無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)；睡眠干預(yù)的第3天、第5天，在各個入水點兩輪次檢測中，CSR組、SD組幼鼠到達平臺的平均潛伏期較對照組明顯延長，平均路程明顯延長(P＜0.05)；其中SD組在第5天的延長最顯著(P＜0.01)；睡眠干預(yù)的第5天，SD組幼鼠到達平臺的平均潛伏期、探索路程較CSR組明顯延長(P＜0.05)。見表1、表2。

2 Morris水迷宮空間探測實驗 3組幼鼠在平臺所在象限時間的百分比、穿環(huán)次數(shù)有顯著性差異，睡眠剝奪組較睡眠限制組明顯減少(P＜0.05)，較對照組顯著減少(P＜0.01)；睡眠限制組較對照組明顯減少(P＜0.05)。見表3。

表1 定位航行實驗中各組幼鼠的潛伏期(s)比較Tab. 1 Latent periods in different groups undergoing place navigation test (±s, n=8)

表1 定位航行實驗中各組幼鼠的潛伏期(s)比較Tab. 1 Latent periods in different groups undergoing place navigation test (±s, n=8)

aP＜0.05, vs SD group; bP＜0.05, cP＜0.01, vs control group 1st: first training; 2nd: second training; SI: sleep intervention

CSR group (s)SD group (s)Control group (s) 1st SI 0 d76.35±9.7274.11±8.9778.29±10.01 SI 1 d54.67±7.3352.72±6.8455.09±7.81 SI 3 d38.36±4.18b39.55±6.21b33.14±5.19 SI 5 d29.28±2.23ab32.45±3.26c26.03±2.81 2nd SI 0 d67.84±8.9765.97±9.1569.33±9.84 SI 1 d45.47±5.2343.86±6.1247.11±5.35 SI 3 d28.14±2.26b29.02±3.46b24.94±3.07 SI 5 d22.34±3.13ab25.95±2.98c19.16±2.34

表2 定位航行實驗中各組幼鼠的探索路程(m)比較Tab. 2 Exploring distance in different groups undergoing spatial probe test ±s, n=8)

表2 定位航行實驗中各組幼鼠的探索路程(m)比較Tab. 2 Exploring distance in different groups undergoing spatial probe test ±s, n=8)

aP＜0.05, vs SD group; bP＜0.05, cP＜0.01, vs control group

CSR group (m)SD group (m)Control group (m) 1st SI 0 d12.75±4.0711.94±3.7913.43±4.36 SI 1 d10.18±2.179.47±1.4411.25±2.23 SI 3 d8.84±1.98b9.13±2.18b6.86±1.61 SI 5 d5.93±1.28ab7.82±1.76c4.51±1.12 2nd SI 0 d11.46±3.4710.88±2.9112.36±4.01 SI 1 d9.52±2.138.64±2.3410.41±3.14 SI 3 d7.86±2.01b8.57±2.21b5.77±1.69 SI 5 d4.85±1.31ab6.73±1.67c3.46±1.02

表3 各組幼鼠在平臺所在象限的時間比和穿環(huán)數(shù)比較Tab. 3 TTQ and NPC in different groups (±s)

表3 各組幼鼠在平臺所在象限的時間比和穿環(huán)數(shù)比較Tab. 3 TTQ and NPC in different groups (±s)

aP＜0.05, vs SD group; bP＜0.05, cP＜0.01, vs control group TTQ: time in target quadrant; NPC: numbers of platform crossing

CSR groupSD groupControl group TTQ (%)42.11±5.42ab36.46±4.47c48.35±5.69 NPC (times)5.79±1.26ab4.41±1.13c7.24±1.37

討 論

學(xué)習(xí)與記憶是相當(dāng)復(fù)雜的腦力活動，學(xué)習(xí)是神經(jīng)系統(tǒng)接受環(huán)境的變化而獲得新行為習(xí)慣的過程，記憶是學(xué)習(xí)后經(jīng)驗的存儲和保持。Morris水迷宮定位航行實驗中各個不同入水點的第1輪次的成績反映空間分辨學(xué)習(xí)能力，第2輪次成績和空間探測實驗成績反映記憶保持能力、工作記憶[11-12]。從結(jié)果可以看出，慢性睡眠限制組、睡眠剝奪組幼鼠在睡眠干預(yù)的第3天、第5天，都造成了幼鼠短時記憶獲得能力和工作記憶的明顯損傷，而睡眠剝奪的損傷更嚴(yán)重，睡眠限制與睡眠剝奪的作用程度區(qū)別在睡眠干預(yù)的第5天就顯現(xiàn)了出來。無論睡眠限制還是睡眠剝奪模型，均造成了受試對象的睡眠不足，進而造成學(xué)習(xí)、記憶的損害，在這一點上，本研究的結(jié)果與其他眾多相關(guān)研究的結(jié)果基本一致；而兩模型的不同點在于睡眠剝奪模型更傾向于REM睡眠剝奪，同時伴有較強的應(yīng)激壓力刺激，而慢性睡眠限制模型相對溫和。從本研究的結(jié)果也可以進一步印證，雖然CSR模型和SD模型剝奪的睡眠時間總長度一致，但其對幼鼠的學(xué)習(xí)記憶功能影響是有差別的。

本研究結(jié)果與Yang等[8]的研究結(jié)果基本相似，不同之處在于后者在CSR的第7天才造成幼鼠的記憶損害，而本研究幼鼠在CSR的第3天就出現(xiàn)了記憶功能損害，其原因可能在于兩個研究每日睡眠限制的時間不同：Yang等干預(yù)措施為每日4 h的CSR，第7天出現(xiàn)陽性結(jié)果；本研究的干預(yù)措施為每日6 h的CSR，第3天就有陽性發(fā)現(xiàn)。這一發(fā)現(xiàn)提示慢性睡眠限制對幼鼠的空間學(xué)習(xí)記憶能力的影響程度可能存在量效關(guān)系。

綜上所述，CSR模型和SD模型對幼鼠的空間記憶均可造成損害，在總睡眠長度相等的情況下，CSR對幼鼠的記憶影響程度小于SD；CSR對幼鼠的記憶影響程度可能存在量效依賴關(guān)系。這些發(fā)現(xiàn)仍有待于其他研究的進一步證實，其具體機制尚有待于進一步研究。

1 Yoo SS， Hu PT， Gujar N， et al. A deficit in the ability to form new human memories without sleep［J］. Nat Neurosci， 2007， 10（3）：385-392.

2 Mueller AD， Pollock MS， Lieblich SE， et al. Sleep deprivation can inhibit adult hippocampal neurogenesis Independent of adrenal stress hormones［J］. Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol， 2008， 294（5）： R1693-R1703.

3 Walsh CM， Booth V， Poe GR. Spatial and reversal learning in the Morris water maze are largely resistant to six hours of REM sleep deprivation following training［J］. Learn Mem， 2011， 18（7）：422-434.

4 Hagewoud R， Bultsma LJ， Barf RP， et al. Sleep deprivation impairs contextual fear conditioning and attenuates subsequent behavioural，endocrine and neuronal responses［J］. J Sleep Res， 2011， 20（2）：259-266.

5 楊遙，劉靜，徐江濤.睡眠剝奪對認(rèn)知功能的影響研究進展［J］.現(xiàn)代生物醫(yī)學(xué)進展，2013，13（4）：791-794.

6 趙忠新，張紅菊.重視睡眠剝奪導(dǎo)致認(rèn)知功能障礙機制的腦功能成像研究［J］.中國現(xiàn)代神經(jīng)疾病雜志，2013，13（5）：359-362.

7 許志強，高長越，方傳勤，等.睡眠剝奪對小鼠學(xué)習(xí)記憶和海馬pCREB水平的影響［J］.中華行為醫(yī)學(xué)與腦科學(xué)雜志，2010，19（5）：392-393.

8 Yang SR， Sun H， Huang ZL， et al. Repeated sleep restriction in adolescent rats altered sleep patterns and impaired spatial learning/ memory ability［J］. Sleep， 2012， 35（6）： 849-859.

9 Poe GR， Walsh CM， Bjorness TE. Both duration and timing of sleep are important to memory consolidation［J］. Sleep， 2010， 33（10）：1277-1278.

10 Vorhees CV， Williams MT. Morris water maze： procedures for assessing spatial and related forms of learning and memory［J］. Nat Protoc， 2006， 1（2）： 848-858.

11 司江華，楊金升，石向群，等.丹紅注射液對睡眠剝奪大鼠學(xué)習(xí)記憶的影響［J］.時珍國醫(yī)國藥，2010，21（10）：2511-2513.

12 王嫄，陳景元，張云，等.睡眠剝奪對大鼠空間學(xué)習(xí)記憶能力的影響［J］.衛(wèi)生研究，2007，36（2）：234-236.

Effect of chronic sleep restriction on spatial learning and memory in infantile rats

LIU Yan, WU Wei-ping
Department of Neurology in South Building, Chinese PLA General Hospital, Beijing100853, China
Corresponding author: WU Wei-ping. Email: wuwp@vip.sina.com

ObjectiveTo study the effect of chronic sleep restriction (CSR) on spatial learning and memory ability in infantile rats.MethodsTwenty-four male infantile SD rats at the age 1 month were randomly divided into CSR group, sleep deprivation (SD) group, and control group (8 in each group). Rats in CSR group and SD group underwent sleep restriction by gentle handing and multiple water platform techniques, respectively, 6 h a day for 5 days. Their spatial learning and memory ability were assessed by Morris water maze test before and 1, 3, 5 days after sleep intervention.ResultsMorris water maze test showed that the average latent period and distance were significantly longer in CSR group and SD group than in control group on days 3 and 5 after sleep intervention (P＜0.05), especially in SD group than in control group on day 5 after sleep intervention (P＜0.01). The latent period and distance were significantly longer in SD group than in CSR group on day 5 after sleep intervention (P＜0.05). Spatial probe test showed that the time in target quadrant (TTQ) and the number of platform crossings (NPC) were significantly lower in SD group than in CSR group and control group (P＜0.05).ConclusionCSR (6 h a day for 5 days) impairs the spatial learning and memory ability in infantile rats. However, its effect is ≤that of sleep deprivation on the spatial learning and memory ability in infantile rats.

chronic sleep restriction; sleep deprivation; learning and memory; infantile rats

R 749.71

A

2095-5227(2014)06-0620-03

10.3969/j.issn.2095-5227.2014.06.029

2014-03-07 16:41

http://www.cnki.net/KCMS/detail/11.3275.R.20140307.1641.012.html

2013-10-24

劉艷，女，在讀博士，主治醫(yī)師，研究方向：神經(jīng)內(nèi)科。Email: neoyen3011@126.com

吳衛(wèi)平，男，主任醫(yī)師，博士生導(dǎo)師。Email: wuwp@vip. sina.com