丹酚酸B對(duì)金黃色葡萄球菌肺炎幼年小鼠肺組織修復(fù)及腦神經(jīng)保護(hù)作用的觀察

李建成，馮 斌

1)駐馬店市中心醫(yī)院重癥醫(yī)學(xué)科 河南駐馬店 463000 2)河南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院兒科 鄭州 450003

肺炎是兒童常見的呼吸系統(tǒng)疾病之一，且以金黃色葡萄球菌等細(xì)菌性及病毒性肺炎較為多見[1]，同時(shí)，由于兒童免疫系統(tǒng)發(fā)育尚未成熟，如果肺炎治療不及時(shí)，疾病可能進(jìn)展為細(xì)菌性腦膜炎等，造成肺組織及腦神經(jīng)損傷，甚至造成患兒死亡[2]。丹酚酸B是從傳統(tǒng)中藥材丹參中提取得到的活性成分，近年來(lái)研究[3-4]表明，丹酚酸B具有抗炎、神經(jīng)保護(hù)等多種藥理作用。本文通過(guò)研究丹酚酸B對(duì)金黃色葡萄球菌肺炎幼年小鼠(幼鼠)肺組織修復(fù)及腦神經(jīng)保護(hù)的作用及機(jī)制，為丹酚酸B在肺炎患兒中的臨床應(yīng)用提供參考和依據(jù)。

1 材料與方法

1.1試劑和儀器丹酚酸B購(gòu)自上海源葉生物科技有限公司；SOD活性檢測(cè)試劑盒及MDA檢測(cè)試劑盒,TNF-α、IL-6、IL-1β ELISA檢測(cè)試劑盒，離子鈣接頭分子(Iba-1)、p-NF-κBp65、NF-κBp65及GAPDH抗體，免疫熒光染色試劑盒購(gòu)自碧云天生物科技有限公司；金黃色葡萄球菌菌株(編號(hào)ATCC4300)購(gòu)自美國(guó)ATCC；ECLIPSETS100-F 倒置顯微鏡購(gòu)自日本 Nikon 公司；MRZ14M010高速冷凍離心機(jī)購(gòu)自美國(guó)Beckman公司；SpectraMax190多功能酶標(biāo)儀購(gòu)自上海美谷分子儀器有限公司；ChemiDoc XRS凝膠成像儀購(gòu)自美國(guó)Bio-Rad公司；BX50/BX-FLA/DP70型光學(xué)/熒光顯微鏡購(gòu)自日本Olympus公司；UniCel DxC 800 Synchron全自動(dòng)生化分析儀購(gòu)自貝克曼庫(kù)爾特商貿(mào)(中國(guó))有限公司。

1.2動(dòng)物分組及處理健康雄性C57BL/6幼鼠125只，購(gòu)自河南省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，4～6周齡，動(dòng)物房溫度(22±2) ℃，濕度(50±10)%，適應(yīng)性喂養(yǎng)1周，除25只幼鼠作為對(duì)照組外，其余100只幼鼠參照文獻(xiàn)[5]方法建立金黃色葡萄球菌肺炎幼鼠模型。7.5 g/L的戊巴比妥鈉腹腔注射對(duì)幼鼠進(jìn)行麻醉后，使用移液槍取金黃色葡萄球菌菌液10 μL(1×1010CFU/mL)緩慢滴入幼鼠鼻腔，使幼鼠與操作臺(tái)成45°角保持1 min，1次/d，連續(xù)3 d，以幼鼠出現(xiàn)呼吸急促、活動(dòng)量減少及肺組織病理改變視為造模成功。100只均造模成功。將造模成功的幼鼠分為4組，每組25只，分別為模型組、丹酚酸B低劑量組、丹酚酸B中劑量組、丹酚酸B高劑量組。丹酚酸B低、中、高劑量組分別按照5、10、20 mg/kg腹腔注射丹酚酸B[6-7]，對(duì)照組及模型組腹腔注射等體積生理鹽水，1次/d，連續(xù)7 d[5-6]。

1.3各組幼鼠動(dòng)脈氧分壓(PaO2)、氧合指數(shù)(OI)的測(cè)定各組幼鼠最后一次給藥24 h后，每組取10只幼鼠，7.5 g/L戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉后，自左心室采血2 mL，采用血?dú)夥治鰞x檢測(cè)PaO2、OI。

1.4各組幼鼠肺組織濕干重比值(W/D)的測(cè)定每組取10只幼鼠，頸椎脫臼法處死幼鼠后迅速分離幼鼠肺組織，并用濾紙吸干水分后置于玻璃試管中稱重，然后置于烘箱中，80 ℃烘烤24 h至恒重后，計(jì)算各組幼鼠肺組織W/D。W/D=幼鼠肺組織濕重(mg)/幼鼠肺組織干重(mg)。

1.5各組幼鼠學(xué)習(xí)記憶能力的測(cè)定利用Morris水迷宮，對(duì)各組幼鼠進(jìn)行定位巡航實(shí)驗(yàn)和空間探索實(shí)驗(yàn)。每組取15只幼鼠，將幼鼠放入水槽自由游泳2 min，適應(yīng)迷宮內(nèi)、外環(huán)境及游泳狀態(tài)，持續(xù)訓(xùn)練3 d，2次/d。于第4天進(jìn)行定位巡航實(shí)驗(yàn)，幼鼠從4個(gè)不同的標(biāo)記點(diǎn)分別入水，記錄其自入水到爬上平臺(tái)所需要的時(shí)間，記為逃避潛伏期；如果幼鼠在90 s內(nèi)未找到平臺(tái)，則將其引導(dǎo)至平臺(tái)休息10 s，逃避潛伏期記為90 s。定位巡航實(shí)驗(yàn)結(jié)束后進(jìn)行空間探索實(shí)驗(yàn)：撤出平臺(tái)，將幼鼠放入水中自由游泳，記錄首次穿過(guò)平臺(tái)所在象限需要的時(shí)間以及在90 s內(nèi)穿過(guò)平臺(tái)的次數(shù)。采用Morris水迷宮圖像自動(dòng)監(jiān)視處理系統(tǒng)測(cè)定逃避潛伏期、首次穿過(guò)平臺(tái)時(shí)間、90 s內(nèi)穿過(guò)平臺(tái)次數(shù)。

1.6各組幼鼠血清TNF-α、IL-6、IL-1β水平的測(cè)定水迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，每組取15只幼鼠摘除眼球取血至干凈離心管中，于4 ℃靜置4 h，然后置于離心機(jī)中4 ℃ 3 500 r/min離心10 min，取上清液，按照ELISA 試劑盒說(shuō)明書檢測(cè)幼鼠血清TNF-α、IL-6及IL-1β水平。

1.7各組幼鼠肺組織SOD活性及MDA水平的測(cè)定每組取15只幼鼠，取肺組織，用4 ℃預(yù)冷的生理鹽水洗去表面血液后，用濾紙吸干表面水分，按照試劑盒說(shuō)明書檢測(cè)幼鼠肺組織SOD活性及MDA水平。

1.8各組幼鼠肺組織病理學(xué)檢查每組取15只幼鼠，處死后取肺組織，在體積分?jǐn)?shù)10%中性甲醛中固定后脫水、石蠟包埋，5 μm厚切片，常規(guī)HE染色，顯微鏡下進(jìn)行病理學(xué)觀察。

1.9各組幼鼠肺組織中NF-κBp65、p-NF-κBp65蛋白的檢測(cè)每組取15只幼鼠，取肺組織裂解后提取總蛋白，蛋白定量后，取等量蛋白進(jìn)行電泳分離、轉(zhuǎn)膜，經(jīng)NF-κBp65、p-NF-κBp65及內(nèi)參GAPDH抗體(均1∶1 000稀釋)4 ℃孵育過(guò)夜。PBST充分洗膜后，加入二抗(1∶2 000稀釋)室溫孵育1 h，PBST清洗后顯色液顯影，應(yīng)用Image J圖像分析系統(tǒng)測(cè)定條帶灰度值。目的蛋白相對(duì)表達(dá)量=目的蛋白條帶灰度值/GAPDH條帶灰度值。

1.10各組幼鼠腦組織中Iba-1蛋白的免疫熒光染色每組取15只幼鼠腦組織制作石蠟切片，體積分?jǐn)?shù)5%胎牛血清封閉后，滴加Iba-1一抗 (1∶200稀釋)，4 ℃過(guò)夜，依次經(jīng)山羊抗兔二抗(1∶500稀釋)室溫下孵育50 min，CY3孵育10 min，經(jīng)含吐溫磷酸鹽緩沖液洗滌3次，滴加抗熒光淬火封片液，孵育5 min，DAPI染色10 min后使用熒光顯微鏡觀察，利用Image Pro Plus 6.0合成Merge圖，Image J圖像分析系統(tǒng)分析平均熒光強(qiáng)度，即蛋白的表達(dá)水平。平均熒光強(qiáng)度=區(qū)域熒光強(qiáng)度總和/區(qū)域面積。

1.11統(tǒng)計(jì)學(xué)處理應(yīng)用SPSS 19.0對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。5組幼鼠W/D、PaO2、OI，逃避潛伏期、首次穿過(guò)平臺(tái)時(shí)間、90 s內(nèi)穿過(guò)平臺(tái)次數(shù)，血清TNF-α、IL-6、IL-1β水平，肺組織SOD活性、MDA水平，肺組織NF-κBp65、p-NF-κBp65蛋白表達(dá)水平及p-NF-κBp65/NF-κBp65比值，腦組織Iba-1蛋白表達(dá)水平的比較均采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.15組幼鼠肺組織W/D、PaO2、OI的比較結(jié)果見表1。由表1可知，與對(duì)照組相比，模型組幼鼠肺組織W/D升高，PaO2、OI降低；與模型組相比，丹酚酸B低、中、高劑量組幼鼠肺組織W/D降低，PaO2、OI升高，隨劑量升高，各指標(biāo)改善更為顯著。

表1 5組幼鼠肺組織W/D、PaO2、OI的比較

2.25組幼鼠學(xué)習(xí)記憶能力的比較結(jié)果見表2。由表2可知，與對(duì)照組相比，模型組幼鼠逃避潛伏期及首次穿過(guò)平臺(tái)時(shí)間延長(zhǎng)，90 s內(nèi)穿過(guò)平臺(tái)次數(shù)減少；與模型組相比，丹酚酸B低、中、高劑量組幼鼠逃避潛伏期及首次穿過(guò)平臺(tái)時(shí)間縮短，90 s內(nèi)穿過(guò)平臺(tái)次數(shù)增加，隨劑量升高，各指標(biāo)改善更為顯著。

表2 5組幼鼠逃避潛伏期、首次穿過(guò)平臺(tái)時(shí)間、90 s內(nèi)穿過(guò)平臺(tái)次數(shù)的比較

2.35組幼鼠血清炎癥因子水平的比較結(jié)果見表3。由表3可知，與對(duì)照組相比，模型組幼鼠血清TNF-α、IL-6、IL-1β水平升高；與模型組相比，丹酚酸B低、中、高劑量組幼鼠血清TNF-α、IL-6、IL-1β水平降低，隨劑量升高，3種炎癥因子水平降低更為顯著。

表3 5組幼鼠血清TNF-α、IL-6、IL-1β水平的比較 ng/L

2.45組幼鼠肺組織SOD活性及MDA水平的比較結(jié)果見表4。由表4可知，與對(duì)照組相比，模型組幼鼠肺組織SOD活性降低，MDA水平升高；與模型組相比，丹酚酸B低、中、高劑量組幼鼠肺組織SOD活性升高，MDA水平降低，隨劑量升高，各指標(biāo)改善更為顯著。

表4 5組幼鼠肺組織SOD活性及MDA水平的比較

2.55組幼鼠肺組織病理學(xué)觀察結(jié)果見圖1。與對(duì)照組相比，模型組幼鼠肺泡邊緣不整齊，間質(zhì)水腫，可見大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，支氣管上皮細(xì)胞壞死，腔內(nèi)有大量的炎性細(xì)胞，血管周圍水腫，提示造模成功；與模型組相比，丹酚酸B低、中、高劑量組幼鼠肺泡邊緣結(jié)構(gòu)明顯改善，丹酚酸B低、中劑量組幼鼠肺間質(zhì)水腫及支氣管上皮細(xì)胞壞死明顯減輕，少見炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，丹酚酸B高劑量組幼鼠肺組織病理學(xué)明顯改善，偶見炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，少見支氣管上皮細(xì)胞壞死。

A:對(duì)照組；B:模型組；C:丹酚酸B低劑量組；D:丹酚酸B中劑量組；E:丹酚酸B高劑量組

2.65組幼鼠肺組織NF-κBp65、p-NF-κBp65及腦組織Iba-1水平的比較結(jié)果見圖2、3及表5?？芍?，與對(duì)照組相比，模型組幼鼠肺組織NF-κBp65和p-NF-κBp65水平、p-NF-κBp65/NF-κBp65比值、腦組織Iba-1水平升高；與模型組相比，丹酚酸B低、中、高劑量組幼鼠肺組織NF-κBp65和p-NF-κBp65水平、p-NF-κBp65/NF-κBp65比值、腦組織Iba-1水平降低，隨劑量升高，各指標(biāo)改善更為顯著。

1:對(duì)照組；2:模型組；3:丹酚酸B低劑量組；4:丹酚酸B中劑量組；5:丹酚酸B高劑量組

圖3 5組幼鼠腦組織Iba-1的免疫熒光染色(×200)

表5 5組幼鼠肺組織NF-κBp65、p-NF-κBp65及腦組織Iba-1水平的比較

3 討論

肺炎以細(xì)菌性和病毒性肺炎較為多見，而細(xì)菌性肺炎的常見致病菌主要有金黃色葡萄球菌、肺炎鏈球菌、銅綠假單胞菌及鮑曼不動(dòng)桿菌等[1-2]。由于兒童自身免疫系統(tǒng)發(fā)育尚未完全，所以肺炎患者中以兒童較為多見，同時(shí)表現(xiàn)出治療周期長(zhǎng)的特點(diǎn)，若治療不及時(shí)，容易引發(fā)血行感染，進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)菌性腦膜炎的發(fā)生，嚴(yán)重者可導(dǎo)致患兒不可逆性智力下降，甚至死亡[2]。

丹酚酸B是從唇形科植物丹參的根及莖中提取得到的單體化合物，研究[3]表明丹酚酸B具有抗炎、心肌保護(hù)、抗腫瘤、免疫調(diào)節(jié)等多種藥理作用。近年來(lái)丹酚酸B對(duì)肺組織的保護(hù)作用及損傷修復(fù)作用也逐漸被發(fā)現(xiàn)。金粟等[8]發(fā)現(xiàn)丹酚酸B具有抑制博來(lái)霉素誘導(dǎo)的小鼠肺纖維化病理進(jìn)展的作用；同時(shí)，張敏等[9]發(fā)現(xiàn)丹酚酸B能夠通過(guò)抑制肺成纖維細(xì)胞TGF-β1/Smad信號(hào)通路抑制肺纖維化進(jìn)展；梁家紅等[10]研究發(fā)現(xiàn)丹酚酸B具有明顯的抗炎及抗凋亡作用，從而發(fā)揮對(duì)急性肺損傷小鼠的保護(hù)作用。同時(shí)，研究[11]表明，丹酚酸B也有顯著的神經(jīng)保護(hù)作用，其作用機(jī)制可能與抑制星形膠質(zhì)細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞的過(guò)度活化有關(guān)。研究[12]表明大鼠肺損傷后，TNF-α、IL-6、IL-1β水平升高加重肺組織損傷，同時(shí)肺組織MDA水平的升高及SOD活性下降則加重了肺組織氧化損傷，所以在肺損傷后上述指標(biāo)的改善直接關(guān)系到肺損傷的預(yù)后及轉(zhuǎn)歸。

本研究結(jié)果表明，與模型組相比，丹酚酸B低、中、高劑量組幼鼠血清TNF-α、IL-6、IL-1β水平，肺組織W/D、MDA水平降低；PaO2、OI、肺組織SOD活性升高，肺組織病理學(xué)損傷明顯改善；提示丹酚酸B能夠降低金黃色葡萄球菌肺炎幼鼠體內(nèi)炎癥因子水平和肺組織氧化應(yīng)激水平，改善肺炎幼鼠肺組織病理學(xué)變化。NF-κB信號(hào)通路是機(jī)體內(nèi)重要的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，與免疫、炎癥、應(yīng)激反應(yīng)等多種生物過(guò)程密切相關(guān)，研究[13]表明，NF-κB信號(hào)通路的過(guò)度激活可以誘導(dǎo)并加重體內(nèi)炎癥反應(yīng)。NF-κBp65為NF-κB蛋白家族的成員之一，在機(jī)體炎癥反應(yīng)的發(fā)生及進(jìn)展過(guò)程中起到關(guān)鍵作用。本研究表明，丹酚酸B各劑量組幼鼠肺組織NF-κBp65、p-NF-κBp65水平及p-NF-κB p65/NF-κB p65比值降低，提示丹酚酸B能夠降低肺炎幼鼠NF-κB信號(hào)通路及相關(guān)蛋白水平，抑制NF-κBp65的磷酸化，進(jìn)而發(fā)揮其抗炎及肺組織保護(hù)作用。

小膠質(zhì)細(xì)胞廣泛分布在中樞神經(jīng)系統(tǒng)，正常狀態(tài)下的小膠質(zhì)細(xì)胞處于休眠或靜息狀態(tài)，當(dāng)腦組織發(fā)生炎癥反應(yīng)時(shí)，會(huì)激活小膠質(zhì)細(xì)胞發(fā)生形態(tài)及功能變化，激活免疫應(yīng)答，釋放大量炎癥介質(zhì)及細(xì)胞毒素[14]，而Iba-1的高表達(dá)是腦組織小膠質(zhì)細(xì)胞激活的標(biāo)志。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，與模型組比較，丹酚酸B各劑量組幼鼠逃避潛伏期及首次穿過(guò)平臺(tái)時(shí)間縮短，90 s內(nèi)穿過(guò)平臺(tái)次數(shù)增加，提示丹酚酸B能明顯改善幼鼠的學(xué)習(xí)記憶能力；丹酚酸B各劑量組幼鼠腦組織Iba-1水平降低，提示丹酚酸B能夠顯著改善肺炎幼鼠腦組織小膠質(zhì)細(xì)胞的激活，抑制腦組織炎癥反應(yīng)，進(jìn)而起到神經(jīng)保護(hù)作用。

綜上所述，丹酚酸B能夠減輕金黃色葡萄球菌肺炎幼鼠體內(nèi)炎癥狀態(tài)，改善幼鼠肺組織及腦組織炎癥水平，保護(hù)幼鼠腦神經(jīng)，提高幼鼠學(xué)習(xí)記憶能力。