p16/Ki67雙染、HPV E6/E7 mRNA檢測(cè)對(duì)于TCT檢查為低級(jí)別鱗狀上皮內(nèi)病變及以下且HPV檢測(cè)為陰性或其他高危型HPV陽(yáng)性患者的分流作用

李碧軍，郭瑞霞，王春芳，陳 曦，褚丹霞，王凱麗，杜建敏，白 晶

1)鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院婦科 鄭州 450052 2) 鄭州大學(xué)第三附屬醫(yī)院婦科 鄭州 450052

宮頸癌是威脅全球婦女健康及生命的主要惡性腫瘤之一，目前其發(fā)病率占女性惡性腫瘤第4位[1]。近幾十年，隨著宮頸癌知識(shí)的普及和“兩癌”篩查的大力推廣，我國(guó)宮頸癌前病變及早期宮頸癌的檢出率逐年提高[2]。宮頸細(xì)胞學(xué)檢查是最早采用的宮頸癌篩查技術(shù)，具有較高的特異度，但其診斷敏感度可能因制片方法、染色水平及檢測(cè)醫(yī)師閱片水平而降低[3]。目前宮頸細(xì)胞學(xué)檢查主要采用TCT檢查。人乳頭狀瘤病毒(human papillomavirus，HPV)檢測(cè)對(duì)無(wú)癥狀感染者的癌前病變及宮頸癌的早期發(fā)現(xiàn)有重要的臨床價(jià)值，但特異度較低。細(xì)胞學(xué)聯(lián)合HPV檢查能提高宮頸癌前病變及宮頸癌的檢出率[4]，但同時(shí)也伴隨著高假陽(yáng)性率及高比例陰道鏡轉(zhuǎn)診率，甚至由于過(guò)度干預(yù)帶來(lái)一系列并發(fā)癥，在育齡期女性尤為嚴(yán)重[5]。因此，一些生物標(biāo)記物被嘗試應(yīng)用于臨床，來(lái)分流細(xì)胞學(xué)結(jié)果為輕度異?；蚱渌呶Ｐ虷PV陽(yáng)性患者中的高危人群，以便更好地識(shí)別真正的高級(jí)別病變。p16/Ki67、HPV E6/E7 mRNA即是其中2種新的生物標(biāo)記物。p16/Ki67是一種能提示HPV轉(zhuǎn)化性感染的聯(lián)合生物學(xué)標(biāo)志物；HPV E6/E7是宮頸致癌基因，對(duì)于宮頸癌前病變的診斷具有較好的特異性，能有效降低其誤診率[6-7]。本文將探討2種新的檢測(cè)方法對(duì)TCT提示為低級(jí)別鱗狀上皮內(nèi)病變(LSIL) 及以下且HPV檢測(cè)為陰性或其他高危型HPV陽(yáng)性患者的分流作用。

1 對(duì)象與方法

1.1研究對(duì)象收集2018年10月至2019年10月在鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院婦科門(mén)診接受宮頸癌篩查的患者資料。納入標(biāo)準(zhǔn)：①TCT檢查為L(zhǎng)SIL及以下且HPV檢測(cè)為陰性或其他高危型HPV陽(yáng)性(不包括HPV16、18陽(yáng)性)，包括未見(jiàn)上皮內(nèi)病變或惡變細(xì)胞(NILM)、意義未明的不典型鱗狀細(xì)胞(ASCUS)、LSIL。②有TCT、高危型HPV、p16/Ki67雙染色法(簡(jiǎn)稱(chēng)雙染)、高危型HPV E6/E7 mRNA(簡(jiǎn)稱(chēng)E6/E7)檢測(cè)及陰道鏡下活檢結(jié)果。陰道鏡活檢指征：高危HPV陽(yáng)性，同時(shí)TCT為ASCUS或更高級(jí)別病變；高危HPV陽(yáng)性持續(xù)超過(guò)12個(gè)月，TCT為NILM；高危HPV陰性，TCT為L(zhǎng)SIL；高危HPV陰性，TCT為ASCUS持續(xù)超過(guò)12個(gè)月；高危HPV陰性，TCT為NILM，但婦科檢查時(shí)肉眼觀(guān)察疑似宮頸癌。排除既往曾接受過(guò)治療的宮頸病變患者，合并其他惡性腫瘤、自身免疫性疾病或正在接受免疫抑制治療的患者，合并妊娠的患者。共入組414例，年齡19～70(43.6±12.1)歲，<30歲者63例(15.2%)，≥30歲者351例(84.8%)。

1.2雙染檢測(cè)使用p16/Ki67檢測(cè)試劑盒(CINtec PLUS 瑞士羅氏公司)，將盛在新柏氏細(xì)胞保存液中的宮頸脫落細(xì)胞進(jìn)行程序化處理，制片、染色、封固，加蓋玻片，讀片。結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)：以同一個(gè)細(xì)胞中同時(shí)出現(xiàn)細(xì)胞質(zhì)棕色染色和細(xì)胞核紅色染色者為p16/Ki67雙染色陽(yáng)性，否則為陰性。

1.3E6/E7檢測(cè)利用細(xì)胞學(xué)檢查的剩余細(xì)胞液在1周內(nèi)采用定量檢測(cè)試劑盒(Quanti Virus 科蒂亞)檢測(cè)高危型HPV E6/E7 mRNA。結(jié)果用相關(guān)光單位(relative light units, RLUs)表示，超過(guò)發(fā)光閾值為陽(yáng)性。

1.4陰道鏡檢查及活檢病理由專(zhuān)門(mén)婦科陰道鏡室醫(yī)師進(jìn)行陰道鏡檢查(歐普C5陰道鏡)，并對(duì)可疑病變部位進(jìn)行多點(diǎn)活檢，由2位病理醫(yī)師獨(dú)立閱片。根據(jù)2014年WHO女性下生殖道腫瘤分類(lèi)標(biāo)準(zhǔn)將慢性炎癥、LSIL判為陰性；將高級(jí)別鱗狀上皮內(nèi)病變(HSIL)及各種類(lèi)型的宮頸癌判為陽(yáng)性。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)處理應(yīng)用MedCalc和SPSS 21.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。比較不同方法單獨(dú)或聯(lián)合檢測(cè)宮頸HSIL+病變的效能(靈敏度、特異度、陽(yáng)性預(yù)測(cè)值、陰性預(yù)測(cè)值)。3種方法聯(lián)合檢測(cè)時(shí)有2種及以上檢測(cè)方法為陽(yáng)性時(shí)，診斷為陽(yáng)性；TCT聯(lián)合HPV檢測(cè)時(shí)有1種及以上檢測(cè)方法為陽(yáng)性時(shí)，診斷為陽(yáng)性(其中HPV檢測(cè)陽(yáng)性為任一其他高危型HPV陽(yáng)性)。采用McNemar檢驗(yàn)比較雙染和E6/E7檢測(cè)以及TCT+HPV+雙染、TCT+HPV+E6/E7及TCT+HPV檢測(cè)HSIL+病變的效能，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1雙染和E6/E7檢測(cè)檢出宮頸HSIL+病變的結(jié)果和效能比較結(jié)果見(jiàn)表1、2。陰道鏡活檢病理結(jié)果中慢性炎癥156例，LSIL 108例，HSIL120例，鱗狀細(xì)胞癌21例，腺癌6例，神經(jīng)內(nèi)分泌癌3例。以活檢病理結(jié)果為金標(biāo)準(zhǔn)，HSIL+(HSIL和癌)患者占36.2%(150/414)，LSIL及以下(LSIL和慢性炎癥)患者占63.8%(264/414)。雙染檢出HSIL+96例，E6/E7檢出90例。

表1 雙染和E6/E7檢測(cè)檢出宮頸HSIL+病變的結(jié)果比較 例

2.2聯(lián)合檢測(cè)檢出HSIL+病變的結(jié)果和效能比較結(jié)果見(jiàn)表3～6，TCT+HPV+雙染檢出HSIL+118例，TCT+HPV+E6/E7檢出111例，TCT+HPV檢出135例。

表2 雙染和E6/E7檢測(cè)檢出宮頸HSIL+病變的效能比較 %

表3 聯(lián)合檢測(cè)檢出宮頸HSIL+病變的結(jié)果比較 例

表4 TCT+HPV+雙染和TCT+HPV+E6/E7檢出宮頸HSIL+病變的效能比較 %

表5 TCT+HPV+雙染和TCT+HPV檢出宮頸HSIL+病變的效能比較 %

表6 TCT+HPV+E6/E7和TCT+HPV檢出宮頸HSIL+病變的效能比較 %

3 討論

根據(jù)指南[8]推薦，對(duì)細(xì)胞學(xué)結(jié)果為ASCUS者，進(jìn)行高危HPV檢測(cè)，結(jié)果陽(yáng)性者推薦陰道鏡檢查，陰性者則繼續(xù)常規(guī)篩查；對(duì)結(jié)果為L(zhǎng)SIL者，直接行陰道鏡檢查。但由于ASCUS中高危HPV的陽(yáng)性率較高，因此大量患者被推薦陰道鏡檢查。但ASCUS中僅有15%、LSIL中僅有12%～28%的患者經(jīng)組織學(xué)活檢證實(shí)為HSIL+，造成大量的過(guò)度診療[9]。HPV16陽(yáng)性(有或無(wú)HPV18陽(yáng)性)、其他高危型HPV 陽(yáng)性和高危型HPV陰性婦女中發(fā)生HSIL+的比例分別為11.4%、6.1% 和0.8%[10]。由于大眾對(duì)宮頸癌的過(guò)度恐慌，出現(xiàn)其他高危型HPV陽(yáng)性或TCT輕度異常(ASCUS、LSIL)時(shí)可能有焦慮情緒，由此會(huì)產(chǎn)生一系列的過(guò)度檢查和治療。

有研究[11]表明，抑癌基因p16及增殖細(xì)胞核抗原Ki67活性與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及預(yù)后密切相關(guān)，在宮頸病變的診斷中是很有意義的標(biāo)志物。90%以上的HSIL+中P16蛋白呈現(xiàn)高表達(dá)，而在LSIL和慢性炎癥中常為局灶弱陽(yáng)性或陰性表達(dá)[12]。在生理?xiàng)l件下,同一細(xì)胞內(nèi)P16和Ki67蛋白的表達(dá)應(yīng)當(dāng)彼此排斥，當(dāng)P16與Ki67蛋白在同一宮頸上皮細(xì)胞中同時(shí)檢出時(shí)，則提示細(xì)胞周期循環(huán)被破壞，細(xì)胞異常增殖，可作為提示HSIL+的指標(biāo)[13]。國(guó)內(nèi)外均有研究[6,12，14]表明，p16/Ki67雙染在宮頸癌篩查中表現(xiàn)出較高的靈敏度和特異度。Bergeron等[15]以及Atkins等[16]的研究均發(fā)現(xiàn)，在TCT檢查結(jié)果為ASCUS或LSIL的患者中，p16/Ki67雙染發(fā)現(xiàn)HSIL+的敏感度均與HPV檢測(cè)相似，但p16/Ki67雙染有著較高的特異度。但也有研究[17]指出，p16/Ki67雙染靈敏度較低，不能確保一些HPV持續(xù)感染者不被漏診。金蓉蓉等[18]、于靜等[19]研究發(fā)現(xiàn)p16/Ki67雙染在分流ASCUS/LSIL患者中有較好的篩查效能。Wright等[20]研究發(fā)現(xiàn)p16/Ki67在分流其他12種HPV高危陽(yáng)性患者中具有重要作用。

眾所周知，HPV感染是宮頸癌的主要危險(xiǎn)因素，而HPV E6/E7蛋白的表達(dá)水平與宮頸病變的進(jìn)展程度及細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)化密切相關(guān)，HPV E6/E7 mRNA可能成為篩查HSIL+的有效指標(biāo)。李曉林等[7]發(fā)現(xiàn)HPV E6/E7 mRNA在宮頸病變檢出中具有較高的敏感度與特異度，在宮頸病變篩查中具有潛在應(yīng)用價(jià)值。有研究[21]發(fā)現(xiàn)HSIL+組的 HPV E6/E7 mRNA 陽(yáng)性率高于LSIL 組。HPV E6/E7 mRNA陽(yáng)性提示癌基因正在轉(zhuǎn)錄期，對(duì)于這類(lèi)患者是否應(yīng)加強(qiáng)隨訪(fǎng)，進(jìn)行3～5 a的密切隨診，及是否能預(yù)測(cè)LSIL的轉(zhuǎn)歸，仍有待進(jìn)一步證實(shí)。

本研究收集了414例TCT檢查為L(zhǎng)SIL及以下且HPV檢測(cè)為陰性或其他高危型HPV陽(yáng)性(不包括HPV16、18陽(yáng)性)的患者，發(fā)現(xiàn)p16/Ki67雙染和HPV E6/E7檢測(cè)的靈敏度相近，均在60%左右，但雙染特異度高于HPV E6/E7；聯(lián)合檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，TCT+HPV+雙染檢測(cè)靈敏度略低于TCT+HPV檢測(cè)，但特異度較高，與上述文獻(xiàn)相符。說(shuō)明在篩查時(shí)聯(lián)合雙染檢測(cè)，不僅保持了較高的靈敏度，還提高了篩查的特異度。但本研究尚存在一定局限性：首先，入組病例數(shù)還不足，需要多中心、大數(shù)據(jù)再進(jìn)行驗(yàn)證；其次，進(jìn)行雙染制片時(shí)存在細(xì)胞數(shù)量過(guò)少、細(xì)胞稀疏和細(xì)胞團(tuán)塊等，導(dǎo)致制片效果差；同時(shí)由于閱片時(shí)過(guò)于保守，導(dǎo)致雙染結(jié)果假陰性較多。本研究中TCT聯(lián)合HPV的篩查效能較低，可能與研究樣本不同有關(guān)，排除了許多HPV其他陽(yáng)性或TCT結(jié)果為L(zhǎng)SIL及以下但未進(jìn)行活檢的患者，造成本研究中HSIL+例數(shù)過(guò)高。目前尚無(wú)研究證實(shí)p16/Ki67雙染對(duì)除宮頸鱗癌外其他類(lèi)型病變的檢出作用，如宮頸腺癌、神經(jīng)內(nèi)分泌癌等特殊類(lèi)型的病變。本研究中共有9例宮頸腺癌和宮頸神經(jīng)內(nèi)分泌癌，而p16/Ki67的結(jié)果均為陰性。由于樣本量較小，具體結(jié)論應(yīng)擴(kuò)大樣本量后進(jìn)一步驗(yàn)證。

綜上所述，HPV E6/E7 mRNA、p16/Ki67表達(dá)與宮頸高級(jí)別病變密切相關(guān)，在TCT檢查為L(zhǎng)SIL及以下且HPV檢測(cè)為陰性或其他高危型HPV陽(yáng)性患者中，再聯(lián)合p16/Ki67檢測(cè)分流，不僅能保持較高的靈敏度還能提高特異度，從而提高篩查效能，降低陰道鏡轉(zhuǎn)診率，避免過(guò)度診療。