急性腦梗死患者外周血髓源抑制性細(xì)胞比例與預(yù)后的關(guān)系

何謙益，石曉娟，連晶瑤，劉莎莎，張 毅

1)鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院生物細(xì)胞治療中心 鄭州 450052 2)鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)二科 鄭州 450052 3)鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院腫瘤中心 鄭州 450052 4)河南省腫瘤免疫與生物治療重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 鄭州 450052 5)鄭州大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院 鄭州450001

卒中是人類致死和致殘的最主要病因之一，且多數(shù)為缺血性卒中(腦梗死)。既往研究[1]顯示，發(fā)揮免疫抑制功能的免疫調(diào)節(jié)細(xì)胞能促進(jìn)腦梗死后神經(jīng)修復(fù)并發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用。髓源抑制性細(xì)胞(myeloid-derived suppressive cell, MDSC)是一群異質(zhì)性未成熟骨髓細(xì)胞，是樹(shù)突狀細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和粒細(xì)胞的前體，具有顯著的抑制免疫細(xì)胞應(yīng)答的能力。MDSC根據(jù)細(xì)胞形態(tài)可以分為兩大類，粒細(xì)胞或多形核MDSC(polymorphonuclear MDSC, PMN-MDSC)與單核MDSC(monocytic MDSC, M-MDSC)。MDSC在缺血性疾病中發(fā)揮重要作用。急性心肌梗死24 h后，小鼠外周血以及缺血心肌組織中MDSC比例顯著上調(diào)，上調(diào)的MDSC在缺血心肌組織中發(fā)揮免疫抑制功能并起到加重心肌損傷的作用[2]。與健康人以及穩(wěn)定性心絞痛患者相比，急性冠脈綜合征患者外周血MDSC比例上調(diào)并且發(fā)揮更強(qiáng)的免疫抑制功能[3]。在腎臟缺血再灌注模型小鼠中，脾臟以及骨髓中的MDSC比例均上調(diào)[4]，上調(diào)的MDSC發(fā)揮了減輕急性腎臟損傷和缺血再灌注損傷后的慢性腎纖維化的作用[5]。在缺血性肌肉損傷小鼠模型中，MDSC遷移至缺血肌肉組織中，并且發(fā)揮促進(jìn)缺血組織血管新生的作用[6]。在腦缺血再灌注損傷小鼠模型中，脾臟、骨髓以及缺血半球中MDSC比例均上調(diào)，并且可能通過(guò)抑制細(xì)胞凋亡減輕腦缺血損傷[7]。但是，目前尚缺乏關(guān)于急性腦梗死患者外周血中MDSC比例變化的研究報(bào)道。本研究旨在探討急性腦梗死患者外周血MDSC比例是否較健康人增加，以及MDSC比例與急性腦梗死患者預(yù)后之間的關(guān)系。

1 對(duì)象與方法

1.1研究對(duì)象選擇2018年10月至2019年10月鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院收治的128例急性腦梗死患者為急性腦梗死組。另外從該院體檢科選取同時(shí)期年齡、性別相匹配的健康體檢者100例作為對(duì)照組。急性腦梗死患者均為首次發(fā)病，發(fā)病時(shí)間均在7 d以內(nèi)，均經(jīng)過(guò)核磁共振檢查確認(rèn)并且符合《中國(guó)急性缺血性腦卒中診治指南2018》診斷標(biāo)準(zhǔn)，均根據(jù)該指南給予腦梗死常規(guī)治療。研究對(duì)象均自愿參加本研究并且簽署知情同意書。排除標(biāo)準(zhǔn)：①患有感染、自身免疫性疾病、癌癥或其他可能影響免疫系統(tǒng)穩(wěn)態(tài)的疾病。②近期應(yīng)用過(guò)類固醇、他汀類藥物、免疫抑制劑等影響外周血中免疫細(xì)胞水平的藥物。③妊娠或合并其他重要臟器功能不全者。

1.2臨床參數(shù)的采集及預(yù)后的評(píng)價(jià)收集研究對(duì)象的臨床資料，如年齡、性別、高血壓病史、糖尿病病史、房顫病史、冠心病病史、吸煙史、飲酒史等。納入研究的當(dāng)天或第2天清晨采集研究對(duì)象空腹靜脈血，運(yùn)用日立7600-20全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)血清高密度脂蛋白膽固醇(high density lipoproteins cholesterol, HDL-C)、低密度脂蛋白膽固醇(low density lipoproteins cholesterol, LDL-C)、總膽固醇、甘油三酯等指標(biāo)。從患者納入本研究開(kāi)始計(jì)算，對(duì)急性腦梗死患者進(jìn)行為期90 d的電話或門診隨訪，隨訪結(jié)束時(shí)進(jìn)行改良Rankin評(píng)分(modified Rankin scale, mRS)，mRS 0～2分的患者為預(yù)后好，3～5分為預(yù)后差[8]。本研究無(wú)患者死亡或失訪。

1.3外周血中MDSC的檢測(cè)取研究對(duì)象清晨空腹靜脈血5 mL置于加入肝素的無(wú)菌管中，用紅細(xì)胞裂解液(北京索來(lái)寶科技有限公司)裂解紅細(xì)胞后，剩下的細(xì)胞懸液清洗離心。向紅細(xì)胞裂解后的細(xì)胞懸液中加入HLA-DR-APC、CD11b-PE-Cy7、CD14-FITC、CD3-PerCP抗體4 ℃避光孵育30 min，用PBS清洗細(xì)胞并且用300 μL的FACS Buffer將細(xì)胞重懸，用流式細(xì)胞儀(BD FACSAria Ⅱ)檢測(cè)PMN-MDSC與M-MDSC比例。所用抗體均購(gòu)于Biolegend公司。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS 23.0對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。兩組性別構(gòu)成、高血壓、糖尿病、房顫、冠心病、吸煙史、飲酒史的比較采用χ2檢驗(yàn)；年齡、血脂指標(biāo)、MDSC不同亞群細(xì)胞比例的比較采用兩獨(dú)立樣本的t檢驗(yàn)；采用logistic回歸分析年齡、性別、糖尿病、高血壓、吸煙史、MDSC不同亞群細(xì)胞比例是否為預(yù)后的影響因素，并繪制ROC曲線。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1兩組臨床資料的比較結(jié)果見(jiàn)表1。急性腦梗死組高血壓患病率高于健康對(duì)照組；兩組研究對(duì)象的年齡、性別構(gòu)成，糖尿病、房顫、冠心病患病率，吸煙、飲酒情況，膽固醇、甘油三酯、LDL-C以及HDL-C水平等比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表1 兩組臨床資料的比較

2.2兩組外周血中MDSC比例的比較結(jié)果見(jiàn)表2。與健康對(duì)照組相比，急性腦梗死患者外周血中PMN-MDSC以及M-MDSC比例均升高。

表2 兩組外周血中MDSC比例的比較 %

2.3急性腦梗死患者預(yù)后好組與預(yù)后差組臨床參數(shù)的比較結(jié)果見(jiàn)表3。預(yù)后好組PMN-MDSC以及M-MDSC比例均高于預(yù)后差組，總膽固醇水平低于預(yù)后差組。

表3 急性腦梗死預(yù)后好組與預(yù)后差組臨床參數(shù)的比較

2.4急性腦梗死預(yù)后影響因素分析以PMN-MDSC比例、M-MDSC比例、年齡、性別(女=0，男=1)、吸煙史(無(wú)=0，有=1)、高血壓病史(無(wú)=0，有=1)、糖尿病病史(無(wú)=0，有=1)等為自變量，以急性腦梗死患者的預(yù)后為應(yīng)變量(預(yù)后好為1，預(yù)后差為0)，進(jìn)行l(wèi)ogistic回歸分析，結(jié)果見(jiàn)表4?？芍?，PMN-MDSC及M-MDSC比例是急性腦梗死預(yù)后的影響因素，且PMN-MDSC及M-MDSC比例越高患者的預(yù)后越好。

表4 急性腦梗死預(yù)后影響因素logistic回歸分析結(jié)果

2.5PMN-MDSC以及M-MDSC比例對(duì)急性腦梗預(yù)后的預(yù)測(cè)價(jià)值結(jié)果見(jiàn)表5。

表5 PMN-MDSC和M-MDSC比例對(duì)急性腦梗死患者預(yù)后的判斷價(jià)值

3 討論

在腦梗死的超早期，小膠質(zhì)細(xì)胞、粒細(xì)胞以及T細(xì)胞被招募至缺血腦組織并開(kāi)始分泌大量的炎癥細(xì)胞因子，如IL-1β、IL-6、IFN-γ等[9]。除此之外，與損傷修復(fù)相關(guān)的細(xì)胞因子如粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子以及游離脂肪酸等分別在急性腦梗死患者腦組織、外周血及腦脊液中的表達(dá)也明顯升高[9]。而上述兩種細(xì)胞因子在MDSC的誘導(dǎo)增殖方面起著關(guān)鍵作用[10]。這也就解釋了為什么本研究觀察到急性腦梗死組患者外周血PMN-MDSC以及M-MDSC比例均較健康對(duì)照組增高。

雖然MDSC可以抑制多種免疫細(xì)胞的功能，但是其主要作用靶細(xì)胞為T淋巴細(xì)胞。目前人們普遍認(rèn)為T細(xì)胞在急性腦梗死中起促進(jìn)炎癥反應(yīng)、加重神經(jīng)損傷的作用[9]。因此，我們猜測(cè)MDSC主要通過(guò)抑制T細(xì)胞的功能來(lái)發(fā)揮腦卒中后神經(jīng)保護(hù)作用。除此之外，MDSC還可能通過(guò)以下途徑發(fā)揮促進(jìn)腦梗死恢復(fù)的作用：①促進(jìn)血管新生。MDSC可以通過(guò)分泌血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子、堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子以及基質(zhì)金屬蛋白酶9等促進(jìn)腫瘤血管新生[11]。除了腫瘤，MDSC還可以在缺血性肌肉損傷小鼠模型中發(fā)揮促進(jìn)血管形成的作用[6]。②控制腦梗死的高危因素。高血壓、高血脂、糖尿病等均是腦梗死的高危因素。既往研究[12]發(fā)現(xiàn)MDSC對(duì)高血壓有調(diào)節(jié)作用，可以通過(guò)產(chǎn)生過(guò)氧化氫抑制高血壓模型小鼠的血壓升高。MDSC在肥胖患者以及急性冠脈綜合征患者外周血中增加[13]，并可以通過(guò)減少B2、Th1和Th17細(xì)胞來(lái)抑制動(dòng)脈粥樣硬化的進(jìn)展[14]。MDSC在2型糖尿病患者外周血中增加，并且與糖尿病并發(fā)癥相關(guān)指標(biāo)呈負(fù)相關(guān)，提示MDSC可能起著減緩糖尿病進(jìn)程的作用[15]。我們的研究發(fā)現(xiàn)PMN-MDSC與M-MDSC比例越高，急性腦梗死患者的預(yù)后越好，與上述研究結(jié)果一致。

綜上所述，該研究結(jié)果顯示，MDSC比例在急性腦梗死患者外周血中增加。相比預(yù)后差的急性腦梗死患者，預(yù)后好的急性腦梗死患者外周血中PMN-MDSC以及M-MDSC比例更高。而且PMN-MDSC和M-MDSC比例是急性腦梗死患者預(yù)后的影響因素，可以作為預(yù)后判斷指標(biāo)為臨床提供參考。