氧化苦參堿對糖尿病大鼠骨代謝及CREB/CRTC1信號通路的影響

張 瑩,李青菊,李江雁,吳蘇豫,周艷紅

1)新鄉(xiāng)市中心醫(yī)院內(nèi)分泌科 河南新鄉(xiāng) 453000 2)鄭州大學(xué)第二附屬醫(yī)院內(nèi)分泌科 鄭州 450014

糖尿病(diabetes mellitus，DM)是由于胰島β細胞功能下降或胰島素分泌障礙導(dǎo)致的一種代謝性疾病[1]。據(jù)統(tǒng)計，全世界已有3.82億糖尿病患者，估計到2035年將上升至5.92億[2]。糖尿病是導(dǎo)致骨量降低的因素之一，高血糖會破壞膠原蛋白的翻譯后修飾，如酶促不成熟和成熟的交聯(lián)以及非酶促高級糖基化終產(chǎn)物的形成，從而破壞骨組織結(jié)構(gòu)[3-4]。骨骼作為一種代謝活躍的器官，其消除量與合成新骨量處于平衡狀態(tài)。某些病理狀態(tài)引起的骨骼重塑失衡會導(dǎo)致代謝性骨疾病的發(fā)生，例如骨質(zhì)減少和骨質(zhì)疏松癥[5]。目前，糖尿病相關(guān)的骨代謝異常和骨骼微結(jié)構(gòu)變化越來越受到關(guān)注。

氧化苦參堿(oxymatrine，OMT)是苦參的主要成分喹嗪生物堿。OMT具有抗炎、抗癌和抗病毒等多種作用，可誘導(dǎo)腫瘤細胞周期停滯和凋亡，并抑制細胞活性、侵襲、遷移、血管生成和上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化[6-8]。Zuo等[9]研究發(fā)現(xiàn)OMT可以調(diào)節(jié)糖尿病大鼠肝臟組織中KSRP、PTEN 及AKT的表達，從而改善糖尿病大鼠的肝功能。Wang等[10]報道指出OMT能夠有效預(yù)防糖尿病神經(jīng)病變的發(fā)生，改善糖尿病大鼠的認知功能，其作用機制與減少海馬組織氧化應(yīng)激，抑制NF-κB 信號通路和Caspase-3 活性，抑制神經(jīng)細胞的凋亡等相關(guān)。此外，也有研究[11]表明OMT可提高胰島素釋放并增加胰島素敏感性來降低糖尿病大鼠的血糖。本研究進一步探討OMT對糖尿病后骨代謝相關(guān)指標(biāo)的影響。

1 材料與方法

1.1動物與主要試劑40只清潔級健康雄性SD 大鼠，6～7周齡，體重180～210 g，購于北京維通利華實驗技術(shù)有限公司，實驗動物許可證號：SCXK (京)2012-0001。

鏈脲佐菌素(streptozocin，STZ)、OMT購自美國Sigma公司，枸櫞酸-枸櫞酸鈉緩沖液、甲醛、EDTA購自北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限公司，Ⅰ型膠原C端肽(CTX-Ⅰ)、骨特異性堿性磷酸酶(BSAP)、骨鈣素(OC)ELISA試劑盒購自上海酶聯(lián)生物科技有限公司，BCA蛋白試劑盒、血清鈣磷檢測試劑盒(鄰甲酚酞絡(luò)合銅比色法)購自上海羽朵生物科技有限公司，Trizol試劑購自日本TaKaRa公司，RIPA裂解液、SDS-PAGE 凝膠、ECL顯色液、HE染色試劑盒及免疫組化染色試劑盒購自上海碧云天生物技術(shù)研究所，兔抗骨鈣蛋白(OCN)、兔抗p-活化的cAMP反應(yīng)元件結(jié)合蛋白(CREB)、兔抗t-CREB、兔抗轉(zhuǎn)錄共激活因子1(CRTC1)及辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔IgG抗體購自美國Abcam 公司，鼠抗β-actin購自美國Santa Cruz 公司。

1.2實驗分組大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1 周，自由進食、飲水。將40只大鼠隨機分為正常對照組、糖尿病模型組、OMT低劑量組、OMT高劑量組，每組10只。糖尿病模型組和OMT低、高劑量組大鼠空腹24 h后腹腔內(nèi)注射60 mg/kg的STZ，2 d和7 d后尾靜脈采血，使用羅氏血糖儀測定大鼠血糖，當(dāng)兩次血糖均≥16.9 mmol/L判定為糖尿病模型構(gòu)建成功。正常對照組大鼠同時注射等體積的枸櫞酸-枸櫞酸鈉緩沖液。3組均建模成功，且建模過程中無大鼠死亡。

模型建立成功1周后，OMT低、高劑量組分別給予100、200 mg/kg OMT灌胃，正常對照組、糖尿病模型組給予等體積蒸餾水灌胃，每日1次，均連續(xù)灌胃 7 d。給藥結(jié)束24 h后，取血樣測定各指標(biāo)。4周后，斷頸處死大鼠，摘取左側(cè)股骨，一部分甲醛固定，一部分置于-80 ℃中保存。

1.3血清鈣、磷和24h 尿鈣檢測給藥結(jié)束24 h后，留取大鼠24 h 尿液，記錄尿量。并通過尾靜脈取血，3 000 r/min低溫離心20 min，靜置后收集分離上層血清。采用鄰甲酚酞絡(luò)合銅比色法檢測血清鈣、磷水平和24 h尿鈣水平。

1.4血清CTX-Ⅰ、OC與BSAP水平測定取分離的上層血清，ELISA法測定血清CTX-Ⅰ、骨鈣素OC及BSAP含量，嚴(yán)格按照ELISA試劑盒說明書操作。

1.5骨密度檢測將大鼠左側(cè)股骨沿平臺長軸放置，使用Osteocore3 Digital 2D 雙能X射線骨密度儀進行掃描，測定股骨骨密度。

1.6股骨組織中ALP、CEBP、OPG、RANKL mRNA的qRT-PCR檢測將股骨敲碎并加入Trizol試劑進行研磨，提取總RNA，經(jīng)紫外分光光度計測定RNA純度和濃度。利用Prime ScriptTMRT reagent Kit將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，qRT-PCR法檢測股骨組織中ALP、CEBP、OPG、RANKL mRNA 的表達情況，以β-actin為內(nèi)參基因。擴增體系包括：SYBR Premix Ex TaqTMⅡ12.5 μL，上、下游引物各1 μL，cDNA 2 μL，添加無酶水補足25 μL。擴增條件：95 ℃ 3 min，95 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，58 ℃ 30 s，40個循環(huán)。使用2-ΔΔCt法計算mRNA的相對表達量。引物由上海生工生物工程有限公司合成，具體序列見表1。

表1 引物序列

1.7股骨組織病理形態(tài)學(xué)觀察取出固定的股骨組織，置體積分數(shù)10%EDTA溶液15 d左右進行脫鈣，隔天換液1次，直至骨組織變軟。梯度乙醇脫水，將已固定好的骨組織塊置于融化的石蠟中浸蠟與包埋，3～5 μm厚 切片。HE染色，光學(xué)顯微鏡下觀察骨組織形態(tài)學(xué)改變。

1.8股骨組織OCN蛋白表達的檢測采用免疫組化SP法。將制備好的股骨石蠟切片脫蠟脫水后，檸檬酸鈉抗原修復(fù)3 min，PBS 沖洗后加入體積分數(shù)3% H2O2溶液處理10 min，阻斷內(nèi)源性過氧化物酶，加入山羊血清封閉液，于濕盒中室溫封閉10 min。然后加入兔抗OCN(按照1∶100稀釋)，4 ℃下孵育過夜。次日PBS 沖洗后，加入鏈霉素菌抗生物素蛋白-過氧化酶，室溫孵育10 min，PBS 沖洗，DAB 顯色2 min。蘇木精復(fù)染，分化后自來水下沖洗，晾干后中性樹膠封片，光學(xué)顯微鏡下觀察并進行圖像采集與分析。

1.9股骨組織中p-CREB、t-CREB、CRTC1蛋白表達的Western blot檢測將股骨敲碎研磨至粉末狀，加入含蛋白酶抑制劑(PMSF)的 RIPA裂解液進行裂解，提取細胞總蛋白，BCA法測定蛋白濃度。取25 μg蛋白樣品上樣進行SDS-PAGE凝膠電泳，將分離蛋白轉(zhuǎn)至硝酸纖維素膜上，50 g/L脫脂奶粉室溫封閉2 h，TBST洗膜，加入兔抗p-CREB (按照1∶1 000稀釋)、兔抗t-CREB (按照1∶1 000稀釋)、兔抗CRTC1(按照1∶100稀釋) 以及鼠抗β-actin (按照1∶1 000稀釋)一抗，4 ℃下孵育過夜，次日TBST洗膜，加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔IgG二抗(按照1∶5 000稀釋)，常溫孵育2 h，TBST再次洗膜，滴加ECL液顯色，凝膠成像系統(tǒng)中曝光拍照，Image J軟件分析各蛋白條帶的灰度值。

1.10統(tǒng)計學(xué)處理采用SPSS 17.0進行分析，4組各指標(biāo)比較均采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用SNK-q檢驗，檢驗水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1各組大鼠血清鈣、磷水平及24尿鈣和24h 尿量比較與正常對照組比較，糖尿病模型組、OMT低劑量組和OMT高劑量組大鼠24 h 尿鈣和尿量顯著升高(表2)。

表2 各組大鼠血清鈣、磷水平及24 h 尿量、尿鈣比較(n=10)

2.2各組大鼠血清CTX-Ⅰ、OC、BSAP水平比較與正常對照組比較，糖尿病模型組、OMT低劑量組和OMT高劑量組大鼠血清中CTX-Ⅰ、OC、BSAP的含量顯著增加；與糖尿病模型組比較，OMT高劑量組與OMT低劑量組血清中CTX-Ⅰ、OC、BSAP的含量顯著下降(表3)。

表3 各組大鼠血清CTX-Ⅰ、OC、BSAP含量比較(n=10) mg/L

2.3各組大鼠骨密度與ALP、CEBP、OPG、RANKL mRNA表達比較與正常對照組比較，糖尿病模型組、OMT低劑量組和OMT高劑量組骨密度降低，ALP、OPG的mRNA表達顯著下調(diào)，CEBP、RANKL 的mRNA表達顯著上調(diào)；與糖尿病模型組比較，OMT低、高劑量組骨密度增加，ALP mRNA的表達顯著上調(diào)，CEBP、RANKL mRNA的表達顯著下調(diào)，與OMT低劑量組比較，OMT高劑量組OPG mRNA表達上調(diào)(表4)。

表4 各組大鼠骨密度與ALP、CEBP、OPG、RANKL mRNA表達水平比較(n=10)

2.4各組大鼠骨組織病理形態(tài)學(xué)正常對照組可見股骨骨小梁數(shù)目多、排列整齊、未見吸收或者斷裂現(xiàn)象，松質(zhì)骨間充滿紅骨髓；糖尿病模型組大鼠骨小梁明顯減少、排列稀疏、變細、有斷裂現(xiàn)象，骨髓腔內(nèi)未見明顯骨髓細胞；OMT低、高劑量組大鼠較糖尿病模型組骨小梁數(shù)量有所增加，排列較規(guī)則，連續(xù)性較好，骨髓腔內(nèi)可見骨髓細胞，且高劑量組改善效果更為明顯，見圖1。

A、B、C、D：分別為正常對照組、糖尿病模型組、OMT低劑量組和OMT高劑量組

2.5各組大鼠OCN蛋白表達比較與正常對照組比較，糖尿病模型組大鼠股骨中OCN蛋白表達顯著降低；OMT低、高劑量組中OCN蛋白表達較糖尿病模型組顯著升高，見圖2與表5。

A、B、C、D：分別為正常對照組、糖尿病模型組、OMT低劑量組和OMT高劑量組

2.6各組大鼠股骨中CREB/CRTC1信號通路相關(guān)蛋白表達的比較與正常對照組比較，糖尿病模型組大鼠中p-CREB和CRTC1蛋白表達水平顯著上調(diào)；與糖尿病模型組比較，OMT高劑量組p-CREB、CRTC1蛋白表達水平顯著下調(diào)，見圖3與表5。

1～4分別為：正常對照組、糖尿病模型組、OMT低劑量組和OMT高劑量組

表5 各組大鼠股骨中OCN、p-CREB、t-CREB、CRTC1蛋白表達水平比較(n=10)

3 討論

糖尿病發(fā)病率逐年增加，現(xiàn)已嚴(yán)重威脅到人類健康[2]。糖尿病發(fā)生后，會引起一系列并發(fā)癥如肝損傷、腎損傷、視網(wǎng)膜疾病及心血管系統(tǒng)損傷等的發(fā)生。此外，糖尿病通過影響骨代謝導(dǎo)致骨質(zhì)疏松的發(fā)生，其并發(fā)癥如骨質(zhì)疏松癥性疼痛和骨折也嚴(yán)重危害患者的生活質(zhì)量，并給患者帶來沉重的經(jīng)濟負擔(dān)[4,12]。建立糖尿病動物模型是深入研究糖尿病及其并發(fā)癥的基礎(chǔ)，注射STZ是目前常用于該模型構(gòu)建的方法[13]。高血糖是糖尿病的主要特征[14]，本研究中糖尿病模型組和OMT低、高劑量組大鼠血糖均大于16.9 mmol/L，說明模型構(gòu)建成功。

本研究結(jié)果顯示糖尿病大鼠血清鈣、磷指標(biāo)無明顯改變，24 h 尿量與24 h 尿鈣增加，說明鈣丟失增多。而OMT干預(yù)對24 h 尿量與24 h 尿鈣水平均無顯著影響，提示糖尿病大鼠的 24 h 尿鈣水平可能是受多種因素綜合影響的結(jié)果。骨組織處于骨重建的動態(tài)變化之中，其中骨形成和骨吸收是骨代謝中兩個聯(lián)系密切的過程[15]。OC與BSAP是骨形成的特異而敏感的標(biāo)志物，CTX-Ⅰ是骨吸收特異標(biāo)志物[13,16]。本研究結(jié)果顯示OMT低、高劑量組大鼠血清中CTX-Ⅰ、OC、BSAP含量明顯降低。同時，糖尿病大鼠骨密度下降，骨小梁明顯減少，且變細、斷裂，提示其出現(xiàn)了一定程度的骨質(zhì)疏松，而OMT干預(yù)使股骨組織病理形態(tài)得以改善，骨密度也有所增加。

ALP作為細胞表面的一種糖蛋白，與骨骼的鈣化作用密切相關(guān)[17]，CEBP 為脂肪細胞分化過程中重要的轉(zhuǎn)錄因子[18]。OPG與RANKL分別是腫瘤壞死因子受體家族成員與腫瘤壞死因子配體超家族成員，兩者組成 OPG/RANKL通路參與調(diào)節(jié)破骨細胞分化過程[19]。本研究結(jié)果顯示，與糖尿病模型組比較，OMT干預(yù)后ALP、OPG mRNA表達較糖尿病模型組明顯上調(diào)，而CEBP、RANKL mRNA表達下調(diào)，OCN蛋白表達增加。以上結(jié)果說明OMT干預(yù)可促進糖尿病大鼠骨生成，骨吸收被抑制，表明了OMT可能具有減弱糖尿病大鼠破骨細胞功能，降低骨吸收的能力。

目前，糖尿病導(dǎo)致骨質(zhì)疏松的機理尚未完全闡明。CREB可通過與靶標(biāo)cAMP反應(yīng)元件的結(jié)合，從而激活下游相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄。CRTC1可顯著增加CREB的轉(zhuǎn)錄活性[18]。大量研究[20-21]表明，轉(zhuǎn)錄因子CREB在各種炎癥、疼痛性疾病中起著至關(guān)重要的作用，而抑制CREB/CRTC1信號通路可以起到明顯的鎮(zhèn)痛作用。本研究結(jié)果顯示，高劑量OMT干預(yù)的大鼠骨組織中 p-CREB、CRTC1蛋白表達水平較糖尿病模型組下調(diào)，說明OMT可能通過抑制了CREB/CRTC1信號通路改善糖尿病大鼠骨組織病變現(xiàn)象。

本文不僅指出糖尿病存在骨質(zhì)疏松癥的潛在危險，還表明了OMT可以通過抑制CREB/CRTC1信號通路的激活改善糖尿病大鼠中骨形成與骨吸收之間的失衡現(xiàn)象，發(fā)揮對骨組織的保護作用。本研究為加快OMT治療糖尿病及其并發(fā)癥的臨床轉(zhuǎn)化提供了實驗依據(jù)。但OMT的保護作用是否涉及胰島素抵抗相關(guān)通路共同上游靶標(biāo)的調(diào)節(jié)還有待進一步探討。