趙源征,楊卓瀅,何遠宏,孫若楠,苑和平
鄭州大學第五附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科 鄭州 450052
腦卒中是我國最常見的腦血管病之一,分為缺血性卒中和出血性卒中。缺血性卒中即腦梗死最為常見?;颊叨嘤懈杏X、運動功能障礙,認知功能障礙和這些障礙給生活帶來極大不便。腦梗死目前的有效治療仍是超早期的溶栓治療以及后續(xù)的對癥藥物治療和康復治療,條件十分有限且治療效果欠佳[1-2]。尼可地爾(2-煙酰胺乙基-硝酸鹽酯)是一種ATP敏感型鉀離子通道(ATP-sensitive potassium channel,KATP)開放劑,同時具有類硝酸酯活性,臨床上主要用于心臟疾病的治療。近來有研究[3-4]發(fā)現(xiàn)尼可地爾在血管性癡呆,亨廷頓病等腦部疾病中發(fā)揮保護作用。本研究通過建立大鼠腦梗死模型,探討尼可地爾對神經(jīng)元再生的作用和機制,為腦梗死的臨床藥物研究提供相關(guān)的理論基礎(chǔ)。
1.1主要試劑與儀器尼可地爾(北京四環(huán)科寶制藥有限公司),5-溴脫氧尿嘧啶核苷(BrdU,美國Sigma公司),大鼠用大腦中動脈閉塞(MCAO)線栓(北京西濃科技有限公司),SDS-PAGE凝膠制備試劑盒(北京康為試劑生物科技有限公司),小鼠抗大鼠BrdU(抗體美國CST公司),兔抗大鼠NeuN抗體、驢抗小鼠二抗、山羊抗兔二抗(美國Abcam公司),辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔二抗、PCR所用引物的設(shè)計(上海生工生物工程有限公司)。冰凍切片機(德國萊卡儀器有限公司),Western blot電泳及轉(zhuǎn)印槽(美國BIO-RAD儀器有限公司),PCR儀(德國Eppendorf有限公司),熒光顯微鏡(德國ZEISS光學儀器有限公司)。
1.2大鼠MCAO模型[5]的建立及分組處理90只SPF級雄性SD大鼠,體重200~240 g,分為3組:假手術(shù)組、腦梗死組和尼可地爾組,每組30只。大鼠經(jīng)體積分數(shù)10%水合氯醛(3.5 mL/kg)腹腔注射麻醉后,取仰臥位固定,頸部備皮、消毒,沿正中線剪開皮膚,小心剝離組織,露出右側(cè)頸內(nèi)動脈、頸外動脈和頸總動脈,結(jié)扎頸外動脈,活結(jié)結(jié)扎頸總動脈和頸內(nèi)動脈,在動脈間剪一小口,將線栓小心送入,直至大腦中動脈起始段,長度約為(20.0±2.0)mm,停止線栓送入,1.5 h后拔出線栓尾端約10 mm,假手術(shù)組線栓送入大腦中動脈起始段后立馬拔出,其余步驟同另外兩組。手術(shù)期間使用恒溫加熱墊,使大鼠體溫保持在37 ℃左右。Zea-Longa法評分1~3分為造模成功。尼可地爾為粉末狀,溶于生理鹽水中,術(shù)后24 h按7.5 mg/(kg·d)的劑量給尼可地爾組大鼠灌胃,其余組給予同等劑量的生理鹽水[6],直至實驗前1天。腦梗死組和尼可地爾組自術(shù)后24 h開始腹腔注射BrdU,劑量為50 mg/kg,連續(xù)注射13 d[7]。
1.3神經(jīng)功能缺損評分術(shù)后第1、3、7、14天,腦梗死組和尼可地爾組每組取10只大鼠。按照Zea-Longa標準[8]對兩組大鼠的神經(jīng)功能進行評分。0分:正常,無神經(jīng)功能缺損;1分:左側(cè)(癱瘓側(cè))前爪不能完全伸展,輕度神經(jīng)功能缺損;2分:行走時大鼠向左側(cè)(癱瘓側(cè))轉(zhuǎn)圈,中度神經(jīng)功能缺損;3分:行走時大鼠身體向左側(cè)(癱瘓側(cè))傾倒,重度神經(jīng)功能缺損;4分:不能自發(fā)行走,有意識喪失。
1.4腦含水量測定術(shù)后第3天,各組取6只大鼠麻醉,快速取腦,剝離梗死側(cè)大腦半球,立即稱重,以獲得濕重。隨后在100 ℃的干燥箱內(nèi)烘干24 h,再次稱重,獲得干重。腦含水量=(濕重-干重)/濕重×100%[9]。
1.5TUNEL法[10]檢測大鼠腦梗死周圍區(qū)細胞凋亡術(shù)后第3天,每組取6只大鼠,用PBS、體積分數(shù)4%多聚甲醛灌注心臟,至大鼠全身僵硬,快速取腦,放于體積分數(shù)4%多聚甲醛固定后,再置體積分數(shù)30%蔗糖中直至沉底。OCT包埋,20 μm厚冰凍切片。取腦片,室溫下放置于PBS中漂洗3次(10 min/次),37 ℃濕盒中避光孵育,置于TUNEL混合液中1 h,再次置于PBS中漂洗,滴加DAPI,封片,顯微鏡(×400)下觀察梗死周圍區(qū)細胞凋亡情況。每張切片選擇3個視野,Image J軟件計算陽性細胞數(shù),取均值。
1.6腦組織BrdU/NeuN免疫熒光雙染檢測術(shù)后第14天,每組取6只大鼠,快速取腦,制作20 μm厚的冰凍切片。取腦片置于PBS中漂洗3次(5 min/次),37 ℃下置于2 mol/L鹽酸溶液15 min,于0.1 mol/l硼酸溶液漂洗3次(10 min/次)[11]。PBS漂洗,PBST溶液處理30 min,體積分數(shù)1%BSA封閉30 min。加小鼠抗大鼠BrdU一抗(按照1∶1 000稀釋),4 ℃冰箱過夜。PBS漂洗,驢抗小鼠二抗(按照1∶500稀釋)室溫孵育2 h。PBS漂洗,體積分數(shù)1%BSA封閉30 min,再加兔抗大鼠NeuN(按照1∶300稀釋),4 ℃冰箱過夜,PBS漂洗,山羊抗兔二抗(按照1∶500稀釋)室溫孵育2 h,PBS漂洗,滴加DAPI,封片。熒光顯微鏡下觀察染色情況。每個切片選擇梗死周圍區(qū)域的3個不重疊的區(qū)域,Image J軟件計算陽性細胞數(shù),取均值。
1.7大鼠腦梗死周圍區(qū)NeuN的mRNA的RT-PCR檢測術(shù)后第14天,3組各取6只大鼠(來自1.3實驗后),深度麻醉后,快速取腦,剝離梗死周圍區(qū)組織,采用Trizol試劑盒提取總RNA,反轉(zhuǎn)錄合成cDNA后,進行PCR擴增反應,引物序列如下:NeuN上游5’-CCCTCCCTCAGCAGACAC-3’,下游5’-TCAGCAGCCGCATAGACTCTACC-3’;GAPDH上游5’-GACATGCCGGGAGAAAC-3’,下游 5’-AGC CCAGGATACCCTTTAGT-3’。反應條件:95 ℃預變性5 min;95 ℃變性30 s, 61 ℃退火30 s, 75 ℃延伸1 min,共35個循環(huán);72 ℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物用20 g/L瓊脂糖凝膠進行分離。凝膠使用Alpha Innotech成像儀(BIO-RAD)進行分析。以目的基因條帶與內(nèi)參條帶灰度值的比值作為目的基因的相對表達水平。實驗重復3次。
1.8大鼠腦梗死周圍區(qū)NeuN蛋白的Western blot檢測術(shù)后第14天,3組各取6只大鼠(4只來自1.3實驗后,2只為另取),麻醉后,快速取腦,剝離出梗死周圍區(qū)組織,與RIPA裂解液充分混勻,置于勻漿機上充分勻漿后,4 ℃、14 000 r/min離心[12]。吸取上清液,加入5×SDS上樣緩沖液煮沸后離心,再次吸取上清液,置-80 ℃冰箱備用。蛋白樣品用80 g/L SDS-PAGE凝膠電泳,將蛋白小心轉(zhuǎn)移至PVDF膜上,50 g/L脫脂牛奶封閉1 h,TBST漂洗3次(10 min/次),4 ℃冰箱孵育兔抗大鼠NeuN一抗(按照1∶5 000稀釋)過夜,TBST漂洗3次(10 min/次),加入辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔二抗(按照1∶2 000稀釋)后室溫孵育1 h,TBST漂洗后,加入ECL發(fā)光液,置于光密度成像系統(tǒng)中觀察蛋白條帶情況并拍照,以GAPDH作內(nèi)參。以目的蛋白條帶與內(nèi)參條帶灰度值的比值作為目的蛋白的相對表達水平。實驗重復3次。
1.9統(tǒng)計學處理采用SPSS 22.0進行數(shù)據(jù)分析,兩組大鼠神經(jīng)功能缺損評分的比較采用重復測量數(shù)據(jù)的方差分析;3組大鼠腦含水量,梗死周圍區(qū)凋亡細胞數(shù)、BrdU/NeuN陽性細胞數(shù)、NeuN mRNA和蛋白表達的比較采用單因素方差分析和SNK-q檢驗。檢驗水準α=0.05。
2.1兩組大鼠神經(jīng)功能缺損評分結(jié)果見表1。
表1 兩組大鼠不同時間點Zea-Longa評分(n=10)
與腦梗死組相比,尼可地爾組在第3、7、14天的評分明顯降低。且隨著時間的推移,兩組腦梗死大鼠神經(jīng)功能缺損評分均有下降的趨勢。
2.23組大鼠腦含水量及梗死周圍區(qū)凋亡細胞個數(shù)比較結(jié)果見表2。腦梗死組較假手術(shù)組腦含水量明顯升高;與腦梗死組相比,尼可地爾組腦含水量明顯降低。假手術(shù)組僅見到少數(shù)凋亡細胞,而腦梗死組凋亡細胞數(shù)明顯增加,尼可地爾組較腦梗死組凋亡細胞數(shù)明顯降低。
2.33組大鼠腦組織BrdU/NeuN的免疫熒光雙染結(jié)果見圖1、表2。
表2 3組大鼠腦含水量及凋亡細胞個數(shù)(n=6)
A:假手術(shù)組;B:腦梗死組;C:尼可地爾組;1:BrdU(紅色);2:NeuN(綠色);3:Merged(橙色)
2.43組大鼠腦梗死周圍區(qū)NeuN mRNA和蛋白表達的比較結(jié)果見表3。假手術(shù)組NeuN的mRNA以及蛋白含量較低,腦梗死組NeuN的mRNA以及蛋白含量明顯增加;尼可地爾組NeuN的mRNA以及蛋白含進一步升高。
表3 3組大鼠腦梗死周圍區(qū)NeuN的mRNA和蛋白表達的比較(n=6)
腦梗死為腦部血管狹窄、閉塞或供血不足,使得血管支配區(qū)域腦組織缺血壞死,神經(jīng)功能受到破壞。梗死區(qū)中心部分的細胞缺血壞死,難以逆轉(zhuǎn),梗死中心區(qū)周圍的區(qū)域被稱為缺血半暗帶,其中的細胞大部分處于休眠狀態(tài)或半休眠狀態(tài),僅能維持自身形態(tài)的完整,而無法行使正常功能[13],拯救“缺血半暗帶”是臨床治療腦梗死的關(guān)鍵。本研究把重點區(qū)域固定在缺血半暗帶。
尼可地爾具有激活KATP通道的活性,同時具有類硝酸酯活性[14]。KATP通道是一種ATP敏感型鉀通道,開閉受胞內(nèi)ATP/ADP比值的調(diào)節(jié),其活性可被ATP抑制并被ADP激活。腦缺血時,ATP水平降低,KATP通道激活,引起細胞膜超極化,細胞興奮性降低,因此可以通過負反饋機制來穩(wěn)定膜電位,調(diào)節(jié)神經(jīng)元電活動和能量代謝的平衡[15]。同時,尼可地爾具有的類硝酸酯作用,可以通過釋放一氧化氮,起到擴張血管的作用。既往有研究[16]表明,尼可地爾可以通過增加腦血流量起到神經(jīng)保護作用。
本研究結(jié)果表明尼可地爾組第3、7、14天的神經(jīng)缺損明顯減輕,證明尼可地爾改善了腦梗死后的神經(jīng)功能,促進其恢復。同時,腦含水量反映腦水腫的程度,腦水腫的程度可以反映腦部的炎癥情況,以及血腦屏障的通透性被破壞的程度。本研究結(jié)果顯示術(shù)后第3天(腦軟化期)尼可地爾組腦水腫明顯減輕。尼可地爾可能是通過激活KATP通道,膜電位回到靜息態(tài),細胞興奮性降低,減少了興奮性遞質(zhì)谷氨酸的釋放,抑制了Na+、Ca2+的大量內(nèi)流,進而減輕了腦水腫[14]。
神經(jīng)元是構(gòu)成神經(jīng)系統(tǒng)結(jié)構(gòu)和功能的基本單位,在神經(jīng)系統(tǒng)中占有重要地位。本研究用BrdU標記增殖的細胞,用NeuN標記成熟的神經(jīng)元。BrdU是一種合成的胸腺嘧啶類似物,可替代胸腺嘧啶并在DNA合成的S階段滲透到復制的DNA分子中。如果靶細胞同時被兩種標記物標記,則我們將其視為雙陽性細胞,代表新增殖的神經(jīng)元[17-18]。本研究結(jié)果顯示術(shù)后第14天,尼可地爾組大鼠腦梗死周圍區(qū)呈現(xiàn)更多的雙陽性細胞,表明尼可地爾促進神經(jīng)發(fā)生。這可能和激活KATP通道的活性有關(guān)。既往有研究[19]表明,KATP通道開放劑會促進神經(jīng)再生,具體機制可能是通過減少炎癥化合物的形成。本研究結(jié)果亦顯示尼可地爾的使用可以提高大鼠腦梗死周圍區(qū)NeuN mRNA和蛋白的含量。同時,我們發(fā)現(xiàn)尼可地爾的處理能明顯減少凋亡,這可能是由于激活了KATP通道,然后一方面通過維持離子穩(wěn)態(tài),另一方面通過降低細胞的能量需求,延緩一些有害的分解代謝過程的激活,減少由此帶來的酶系統(tǒng)的激活而引起的不可逆的細胞損傷[20-21]。
綜上所述,尼可地爾可以通過促進神經(jīng)功能恢復、減輕腦水腫、減少細胞凋亡、促進神經(jīng)元再生來達到神經(jīng)保護,進而為腦梗死的臨床治療提供參考。