毛蕊異黃酮增強順鉑對胃癌細(xì)胞增殖的抑制作用

周立霞，吳月明，李娜，楊祎，秦雪云

（錦州醫(yī)科大學(xué)附屬第三醫(yī)院腫瘤科，遼寧錦州121000）

毛蕊異黃酮增強順鉑對胃癌細(xì)胞增殖的抑制作用

周立霞，吳月明，李娜，楊祎，秦雪云

（錦州醫(yī)科大學(xué)附屬第三醫(yī)院腫瘤科，遼寧錦州121000）

目的觀察毛蕊異黃酮對順鉑抑制胃癌細(xì)胞增殖的增強作用。方法將BGC823細(xì)胞分為4組，分別用生理鹽水、順鉑、毛蕊異黃酮和2種藥物聯(lián)合處理，檢測不同時間點、不同處理因素下的細(xì)胞增殖情況。進(jìn)一步檢測影響細(xì)胞增殖的相關(guān)蛋白，確定毛蕊異黃酮聯(lián)合順鉑抑制胃癌細(xì)胞增殖的方式。結(jié)果對細(xì)胞作用24 h后，20 μg/mL順鉑，10 μg/mL毛蕊異黃酮，以及2種藥物聯(lián)合處理組對BGC823細(xì)胞的增殖抑制率分別為56.44%±2.08%，9.52%±2.77%和74.44%±0.82%。藥物聯(lián)合使用后對細(xì)胞的抑制率明顯高于單個藥物處理組，各組數(shù)據(jù)間差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。并且無論是在蛋白水平還是RNA水平上，毛蕊異黃酮均可以顯著增強順鉑對Cyclin D1，CDK4和CDK6蛋白的抑制作用。結(jié)論毛蕊異黃酮可以顯著提高順鉑對BGC823細(xì)胞增殖的抑制率，2種藥物聯(lián)合使用可以降低順鉑單獨使用所導(dǎo)致的毒副作用。

毛蕊異黃酮；順鉑；BGC823；胃癌；增殖

胃癌是我國最為常見的惡性腫瘤之一，嚴(yán)重威脅著人們的健康［1］。雖然近幾十年來，胃癌的發(fā)病率和死亡率一直在穩(wěn)步下降，但是它仍然是腫瘤致死的第二大原因［2］。目前手術(shù)治療仍然是胃癌最有效的治療方法［3］，術(shù)后的放化療也能在一定程度上提高患者的生存時間，但是現(xiàn)有的化療藥物通常會引發(fā)骨髓抑制反應(yīng)等嚴(yán)重的不良反應(yīng)［4］，患者的生存質(zhì)量往往不高，因此，亟待尋找新的藥物與化療藥物聯(lián)合使用，以期待降低化療藥物的毒副作用。

毛蕊異黃酮是大豆異黃酮的主要成分，是一種應(yīng)用廣泛的天然活性化合物，具有抗氧化和抗炎活性［5］。最近的研究［6］表明，毛蕊異黃酮可以通過抑制AKT通路來抑制乳腺癌細(xì)胞的生長。順鉑是一種化療藥物，廣泛應(yīng)用于臨床多種腫瘤的術(shù)后化療中。在胃癌細(xì)胞中，順鉑可以通過作用于AKT和P53等通路影響胃癌的生長與侵襲轉(zhuǎn)移能力。然而，應(yīng)用順鉑時往往會引發(fā)嚴(yán)重的胃腸道反應(yīng)等多種不良反應(yīng)，而且其化療效果對不同人群差異較大，個體耐受性較高［7?10］。為此，想通過研究觀察聯(lián)合使用2種藥物是否能夠在一定程度上更好的治療胃癌。

本研究以BGC823細(xì)胞作為研究對象，觀察毛蕊異黃酮與順鉑聯(lián)合作用對細(xì)胞增殖的抑制作用，進(jìn)一步檢測2種藥物發(fā)揮抑制細(xì)胞增殖作用的方式，以期待毛蕊異黃酮能夠與順鉑聯(lián)合使用來改善胃癌患者化療藥物的使用劑量，減少化療的不良反應(yīng)。

1 材料與方法

1.1 材料

人胃癌BGC823細(xì)胞系，DMEM培養(yǎng)基（Invitro?gen公司，美國），胎牛血清（天津灝洋公司），毛蕊異黃酮（Selleck公司，美國），順鉑注射液（云南生物谷藥業(yè)股份有限公司），四甲基偶氮唑藍(lán)（MTT），Cyclin D1、CDK4、CDK6和GAPDH（Santa公司，美國），SYBR Green（Promega公司，美國）。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)：將BGC823細(xì)胞培養(yǎng)于含體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中，置于CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2.2 藥物處理濃度：順鉑為臨床常用的化療藥物，根據(jù)伯格公式C=20×D（C單位為μg/mL，D為臨床劑量單位mg·kg-1·d-1）和體表面積計算公式S= 1.15+（m-30）×0.1×5-1（其中m＞30 kg）計算出MTT所需藥物濃度。毛蕊異黃酮取10 μg/mL、20 μg/mL和40 μg/mL 3個濃度。

1.2.3 MTT實驗：BGC823細(xì)胞以1×105/mL濃度接種于96孔培養(yǎng)板，12 h后添加不同濃度的藥物。每個濃度藥物處理后分別取0 h、12 h、24 h、36 h和48 h，使用MTT測量細(xì)胞增殖曲線。以DMSO處理作為對照。于0 h、12 h、24 h、36 h和48 h分別加入5 mg/mL MTT 10 μL，培養(yǎng)4 h后棄上清，每孔中加入DMSO 200 μL，溶解后后在490 nm處記錄吸光值。抑制率計算公式：抑制率=1-（劑量組平均OD值/對照組平均OD值）×100%。

1.2.4 Western blotting：藥物處理24 h后收集細(xì)胞，裂解提取蛋白。取等量蛋白進(jìn)行SDS?PAGE電泳、100 V轉(zhuǎn)膜1 h后，室溫封閉1 h。一抗（Cyclin D1、CDK4、CDK6和GAPDH）1∶200孵育過夜，二抗室溫孵育1 h。ECL發(fā)光儀發(fā)光。

1.2.5 實時PCR檢測：使用TRIZOL法提取RNA并反轉(zhuǎn)錄成cDNA，參照SYBR Green說明書進(jìn)行實時PCR反應(yīng)。所用引物為Cyclin D1，F(xiàn)：5’?CCGAG GAGCTGCTGCAAATGGAG?3’；R：5’?CGTGCGGGG TCATTGCGGC?3’；CDK4，F(xiàn)：5’?CAGAGCTCTTAGC CGAGCGT?3’；R：5’?GGCACCGACACCAATTTCA G?3’；CDK6，F(xiàn)：5’?GTCTGATTACCTGCTCCGC?3’；R：5’?CCTCGAAGCGAAGTCCTC?3’；GAPDH，F(xiàn)：5’?CATCCCTTCTCCCCACACAC?3’；R：5’?AGTCCC AGGGCTTTGATTTG?3’。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 藥物對BGC823細(xì)胞增殖的影響

2.1.1 順鉑處理組：采用不同濃度的順鉑處理BGC823細(xì)胞，取0 h、12 h、24 h、36 h和48 h分別檢測細(xì)胞增殖狀態(tài)，順鉑可顯著抑制BGC823細(xì)胞增殖，各組結(jié)果之間差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。見圖1、2，表1。

2.1.2 毛蕊異黃酮處理組：不同濃度的毛蕊異黃酮加入BGC823細(xì)胞中，0 h、12 h、24 h、36 h和48 h后，毛蕊異黃酮可抑制BGC823細(xì)胞的增殖，組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），其對細(xì)胞的增殖抑制作用隨著劑量和時間增加。見圖3、4，表2。

圖1 順鉑作用24 h的BGC823細(xì)胞光鏡圖片×100Fig.1Light microscope image of BGC823 cells treated by cisplatin for 24 h×100

2.1.3 毛蕊異黃酮聯(lián)合順鉑處理組：采用20 μg/mL順鉑與10 μg/mL毛蕊異黃酮聯(lián)合作用BGC823細(xì)胞，藥物聯(lián)用后對細(xì)胞增殖的抑制能起到協(xié)同作用，組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。見圖5、6，表3。

圖2 順鉑作用下BGC823細(xì)胞的增殖情況（n=3）Fig.2The proliferation of cells treated by cisplatin（n=3）

2.2 不同處理因素對BGC823細(xì)胞周期相關(guān)蛋白的影響

不同因素處理后，Cyclin D1、CDK4以及CDK6在蛋白水平和mRNA水平均受到不同程度的抑制。2種藥物聯(lián)合使用后對蛋白的抑制作用明顯增強。見圖7、8。

3 討論

胃癌是世界范圍內(nèi)最常見的癌癥死亡原因之一。雖然這種疾病的發(fā)病率和死亡率在過去的幾十年里有顯著的下降趨勢，但仍然是人類健康的一大殺手［11?12］。根治性切除術(shù)是胃癌最常見的手術(shù)方法，但是很多患者會出現(xiàn)復(fù)發(fā)的現(xiàn)象，對于這些患者，全身化療是主要的治療方法［13］。順鉑作為應(yīng)用最廣泛、最有效的抗癌藥物之一，可以通過抑制DNA的復(fù)制過程來抑制腫瘤［14］。順鉑通過抑制腫瘤細(xì)胞的增殖、促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡來抑制腫瘤細(xì)胞的生長，與此同時它還可以抑制腫瘤細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移。臨床研究［15?17］表明，順鉑具有較強腎毒性、神經(jīng)毒性，容易引起較劇烈的胃腸道反應(yīng)及過敏反應(yīng)。患者應(yīng)用順鉑治療后生存質(zhì)量往往不高。有報道［5］指出，毛蕊異黃酮具有一定的抗腫瘤作用。毛蕊異黃酮可以顯著抑制卵巢癌細(xì)胞的生長，也可以通過抑制AKT信號通路抑制乳腺癌的發(fā)生發(fā)展［18］。在骨肉瘤細(xì)胞中加入毛蕊異黃酮后，細(xì)胞的增殖與侵襲轉(zhuǎn)移顯著受到抑制［19?21］。但是目前未見毛蕊異黃酮作用于胃癌細(xì)胞的研究報道。

表1 順鉑對BGC823細(xì)胞增殖的抑制率（%，n=3）Tab.1The inhibition of proliferation treated by cisplatin（%，n=3）

圖3 毛蕊異黃酮作用24 h的BGC823細(xì)胞光鏡圖片×100Fig.3Light microscope image of BGC823 cells treated by calycosin for 24 h×100

表2 毛蕊異黃酮對BGC823細(xì)胞增殖的抑制率（%，n=3）Tab.2The inhibition of proliferation treated by calycosin（%，n=3）

圖4 毛蕊異黃酮作用下BGC823細(xì)胞的增殖情況（n=3）Fig.4The proliferation of cells treated by Calycosin（n=3）

圖6 不同藥物處理后細(xì)胞的增殖情況（n=3）Fig.6The proliferation of cells treated by different agents（n=3）

圖5 毛蕊異黃酮和順鉑聯(lián)合作用24 h的BGC823細(xì)胞光鏡圖片× 100Fig.5Light microscope image of BGC823 cells treated by caly?cosin and cisplatin for 24 h×100

本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)毛蕊異黃酮與順鉑聯(lián)合應(yīng)用后對BGC823細(xì)胞增殖的抑制作用顯著高于2種藥物單獨使用時。細(xì)胞增殖實驗顯示二者均可以顯著抑制BGC823細(xì)胞的增殖。進(jìn)一步通過Western blotting與實時PCR研究發(fā)現(xiàn)，2種藥物均可以在蛋白水平與RNA水平上抑制細(xì)胞周期相關(guān)蛋白Cyclin D1、CDK4和CDK6的表達(dá)。藥物聯(lián)合使用后，對這3種蛋白的抑制作用明顯增強。這一系列研究結(jié)果均表明，毛蕊異黃酮和順鉑均可以抑制胃癌細(xì)胞BGC823細(xì)胞的增殖。

表3 不同藥物對細(xì)胞增殖的抑制作用（%，n=3）Tab.3The inhibition of proliferation treated by different treatment（%，n=3）

圖7 不同處理因素作用下BGC823細(xì)胞蛋白的變化Fig.7The proteins of BGC823 which treated by different agents

圖8 不同處理因素作用下BGC823細(xì)胞mRNA水平的影響Fig.8The mRNA expression changes of BGC823 treated by different agents

綜上所述，毛蕊異黃酮與順鉑聯(lián)合應(yīng)用后可以起到協(xié)同作用，本研究為臨床上尋找胃癌化療的輔助藥物提供了理論基礎(chǔ)。

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（編輯于溪）

Calycosin Enhance the Inhibitory Effect of Cisplatin on Proliferation of Gastric Cancer Cells

ZHOU Lixia，WU Yueming，LI Na，YANG Yi，QIN Xueyun
（Department of Oncology，The Third Affiliated Hospital of Jinzhou Medical University，Jinzhou 121000，China）

ObjectiveTo observe the effect of calycosin on cisplatin?induced inhibition of human gastric BGC823 cells.MethodsBGC823 cells were treated with different drugs：saline，cisplatin，calycosin and cisplatin combined with calycosin.MTT assays were used to detect the prolif?eration rate of BGC823 cell.Then the protein level and RNA level of cyclin D1，CDK4 and CDK6 were detected by Western blotting and Real?time PCR.ResultsThe proliferation inhibition rates of BGC823 cells treated with 20 μg/mL cisplatin，10 μg/mL meperoflavone，and combina?tion of the 2 drugs were 56.44%±2.08%，9.52%±2.77%and 74.44%±0.82%，respectively.The inhibition rate of the combination of drugs was significantly higher than that of the single drug treatment group（P＜0.05）.In addition，we found that calycosin can significantly enhance the inhi?bition of Cyclin D1，CDK4 and CDK6 by cisplatin in protein level and RNA level.ConclusionCalycosin can significantly increase the inhibitory rate of cisplatin on BGC823 cell proliferation，and the combination of the two drugs can reduce the side effects of cisplatin.

calycosin；cisplatin；BGC823；gastric；proliferation

R735.2

A

0258-4646（2017）01-0050-05

10.12007/j.issn.0258?4646.2017.01.011

周立霞（1981-），女，主治醫(yī)師，博士研究生. E-mail：lyzhoulixia@sina.com

2016-02-22

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