藤黃酸的心臟毒性及其基于細胞表型的多指標量化表征

祝 婕，王 萌，朱 彥

（1.天津中醫(yī)藥大學天津市現代中藥重點實驗室，省部共建國家重點實驗室培育基地，天津 300193；2.天津國際生物醫(yī)藥聯合研究院中藥新藥研發(fā)中心，天津 300457）

藤黃酸的心臟毒性及其基于細胞表型的多指標量化表征

祝 婕1，2，王 萌1，2，朱 彥1，2

（1.天津中醫(yī)藥大學天津市現代中藥重點實驗室，省部共建國家重點實驗室培育基地，天津 300193；2.天津國際生物醫(yī)藥聯合研究院中藥新藥研發(fā)中心，天津 300457）

目的建立基于細胞表型心臟毒性多指標同步量化表征方法，評價廣譜抗癌藥藤黃酸的心臟毒性。方法采用H9c2心肌細胞系，以多柔比星（Dox）和胺碘酮（Ami）為陽性藥對照，1‰DMSO為溶劑對照組，次烏頭堿為陰性對照組，應用高內涵分析多通道活細胞成像，收集細胞形態(tài)變化以及各指標探針的熒光強度，考察1×10-14～1×10-8mol·L-1濃度范圍藥物對心肌細胞存活率、細胞核、線粒體形態(tài)和功能及胞內鈣離子含量的影響，以藥物半數有效量（EC50）判斷藥物對心肌細胞影響程度，以Z′值判斷所建方法的精密度和假陽性率。結果Dox降低細胞數，導致細胞核脹大，線粒體質量增加，EC50分別為0.72，0.014和1.21 μmol·L-1，且在濃度為10 μmol·L-1時導致胞內鈣穩(wěn)態(tài)失衡。Ami導致心肌細胞數下降，細胞核縮小及線粒體質量減少，EC50值分別為14.83，6.72和4.54 μmol·L-1，高通量篩選Z′值平均為0.5。次烏頭堿對心肌細胞的細胞核和胞內鈣離子含量無影響，但改變了線粒體的紋理，紋理分析值降低。藤黃酸對心肌細胞有嚴重的殺傷作用，使細胞存活率下降，細胞核減小以及胞內鈣離子濃度降低，EC50分別為0.24，1.16和0.41 μmol·L-1。藤黃酸使線粒體質量降低，線粒體紋理數值降低以及線粒體面積增加，EC50分別為1.21，0.99和0.44 μmol·L-1。結論使用高內涵分析多通道活細胞成像技術所評價的陽性藥EC50效量和現有報道接近；多指標同步量化對藤黃酸的心臟毒性進行了較為全面的分析，并對其毒性作用機制做出初步的判斷。

心臟毒性；藤黃酸；H9c2細胞；高內涵篩選

目前，抗癌藥物引起引起的心臟毒性成為重點關注問題，蒽環(huán)類藥物如多柔比星（doxorubicin，Dox）和柔紅霉素等對心肌的主要毒性反應的細胞表征為誘導細胞死亡，線粒體DNA損傷，線粒體功能失常以及胞內鈣穩(wěn)態(tài)失衡。蒽環(huán)類藥物在臨床使用中因出現嚴重心臟毒性反應而被撤市或限制使用［1-2］。BCR-ABL酪氨酸激酶小分子抑制劑（small molecule tyrosine kinase inhibitors，小分子TKI）如伊馬替尼、達沙替尼和尼洛替尼等通過激活內質網的壓力反應誘導心肌細胞凋亡［3］。另一類產生心臟毒性的藥物為治療心臟疾病的藥物，如第三類治療心律失常藥鹽酸胺碘酮（amiodarone，Ami），已被美國FDA列入心臟毒性的名單中。因此，藥物的臨床前心臟毒性安全性評價及預測不僅減少不必要的經濟和資源的浪費，而且也可為安全用藥提供實驗數據支持。

藤黃（gamboge）為藤黃科植物藤黃（Garcinia hanburyiHook.F.）分泌的干燥樹脂，其中藤黃酸是其主要有效成分［4］。藤黃酸已被開發(fā)為一種廣譜抗腫瘤藥，對多種腫瘤有顯著療效，如對人肝癌細胞株的增殖有明顯的抑制作用，還可明顯抑制胃腺癌細胞株的增殖［3］。藤黃酸可通過誘導細胞凋亡、阻滯細胞周期進程、抑制癌細胞轉移和抑制血管生成等多方面機制達到抗癌效果［5］?，F有安全性評價研究表明，藤黃酸具有腎毒性和肝毒性［6］。藤黃酸為具潛力的抗癌藥物，其心臟毒性的評價也是必要的。因此，本實驗旨在建立量化多重評價心臟毒性的指標，并基于細胞表型綜合評價藤黃酸對心臟的毒性作用。

心臟毒性可發(fā)展為急性、亞急性和慢性疾病。臨床上急性和亞急性心臟毒性的特點為心室負極化的異常表現、QT間期延長、室上性以及室性心律失常。慢性心臟毒性表現為心臟無癥狀收縮和左心室舒張功能異常［7］。細胞水平的急性心臟毒性則表現為心肌細胞迅速死亡。但是在較溫和的環(huán)境刺激下形成的早期應答反應是胞內鈣穩(wěn)態(tài)的失衡，但這個過程是可逆的。心臟如受長期毒性刺激，則誘發(fā)心肌肥厚，進而導致不可逆的心肌病，最終將使患者心力衰竭。心衰是心肌細胞大量死亡造成的結果，其中包括細胞凋亡和壞死。導致心肌死亡的分子通路有很多，包括細胞因子的活化、線粒體誘導細胞凋亡、胞內Ca2+超載及絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）的活化等通路［8］。高內涵提供了一個靈敏精確的方法檢測這些指標在細胞表型的微弱變化。但這些變化卻不被電生理或其他傳統(tǒng)的體外方法所發(fā)現［9］。體內模型雖仍然是最被廣泛認可的檢測方法，但存在低通量，高投入的弊端，并對人體的生理反應的預測能力有限，這導致動物模型在毒理學研究中的應用減少［10-13］，而高內涵細胞影像技術則越來越被重視和應用［14］。例如，利用探針觀察四重熒光標記的細胞核、線粒體膜電位、質膜完整性和胞內鈣離子濃度的變化，可從多參數細胞表型變化驗證已知心肌毒性的藥物有Dox、抗霉素A、Ami、雙氯芬酸、齊多夫定和硝苯地平對CytivaTM心肌細胞的毒性影響，以及不同藥物的不同影響效果［9］。此外，以細胞活力、線粒體完整性及活性氧(reactive oxygen species，ROS)的生成量為指標的高內涵檢測方法等都得到了業(yè)界的認可和應用［14］。因此基于以上方法我們建立了一個以H9c2，一種來源于胚胎期BD1X大鼠心臟組織的亞克隆細胞系為模型，表現出骨骼肌細胞特性［15］。Hoechst33342標記細胞核用于測量細胞數和細胞核面積，MitoTracker Deep Red FM標記線粒體表示線粒體質量，Fluo4 AM用來表示胞內鈣離子含量等。Z’值代表評價方法本身的可信度，陽性對照組提供最大響應信號，陰性對照組給出最小響應信號，通過兩者的平均值和標準差值決定了評價方法檢測信號的動態(tài)范圍，Z’值≥0.5表示信號范圍較大，評價方法可靠［16］。本研究采用高內涵綜合量化方法來評價藤黃酸對心肌細胞的毒性作用。

1 材料與方法

1.1 藥物、試劑和儀器

H9c2心肌細胞，中國科學院典型培養(yǎng)物保藏委員會上海細胞庫；DMEM高糖培養(yǎng)基和胰蛋白酶（含EDTA），美國Gibco公司；胎牛血清和青鏈霉素，美國HyClone公司；Dox和Ami，美國Sigma公司；次烏頭堿和藤黃酸，天津中醫(yī)藥中藥重點實驗室；DMSO，中國北京索萊寶科技有限公司；熒光探針Hoechst 33342和MitoTracker Deep Red FM，美國Invitrogen公司，Rhod2 AM探針和Fluo-4 AM熒光探針，日本同仁公司。細胞培養(yǎng)瓶，96孔透底黑板和1.5 mL EP管，美國Corning公司。IL-161HI?CO2恒溫培養(yǎng)箱，中國施都凱儀器設備有限公司；Operetta高內涵篩選系統(tǒng)；美國PerkinElmer儀器有限公司。

1.2 細胞培養(yǎng)和傳代

H9c2細胞用含10%胎牛血清、青霉素100 kU·L-1、鏈霉素100 mg·L-1以及pH 7.2的DMEM高糖培養(yǎng)基培養(yǎng)，置于37℃，5%CO2恒溫培養(yǎng)箱中。隔天棄去原培養(yǎng)基，加入2mL胰蛋白酶-EDTA消化傳代。

1.3 樣品配置

將Dox、Ami、次烏頭堿和藤黃酸用DMSO溶解并配成10mmol·L-1的母液，樣品母液置于1.5 mL EP管中，-20℃中密封保存。細胞給藥時用DMEM高糖培養(yǎng)基逐級稀釋，4種藥物的濃度均稀釋成0.014，0.041，0.12，0.37，1.1，3.3和10 μmol·L-1。

1.4 高內涵多指標心臟毒性檢測方法的優(yōu)化

收集對數生長期細胞，以每孔5000個細胞密度加入96孔黑色透明底的培養(yǎng)板中，每孔100 μL，37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。換入各濃度的Dox、Ami、次烏頭堿和藤黃酸100 μL每孔培養(yǎng)24 h后，熒光探針標記細胞器：①將熒光探針Hoechst33342母液稀釋1千倍到DMEM基礎培養(yǎng)基中；再將MitoTracker Deep Red FM母液稀釋1萬倍到含有Hoechst 33342的培基中作為“雞尾酒”染色劑；②棄去培養(yǎng)板中的培基，換成“雞尾酒”染色劑，每孔100 μL，在孵箱中避光培養(yǎng)20 min；③將Fluo-4 AM或者Rhod-2 AM母液稀釋1000倍到基礎培基中；④棄去培養(yǎng)板中的染色劑，換入含有Rhod-2 AM的培基，每孔50μL，避光孵育30 min；⑤將培養(yǎng)板避光取出，準備進行活細胞成像。

1.5 活細胞成像

使用High Content Screening高內涵系統(tǒng)對細胞進行全自動成像。成像條件設置如下：20倍物鏡第一通道（選取激發(fā)光360～400 nm/發(fā)射光410～480 nm）Hoechst33342標記細胞核；第二通道（選取激發(fā)光620～640 nm/發(fā)射光650～760 nm）MitoTracker Deep Red FM標記線粒體；第三通道（選取激發(fā)光460～490 nm/發(fā)射光500～550 nm）Fluo-4 AM或（選取激發(fā)光520～550 nm/發(fā)射光560～630 nm）Rhod-2 AM標記胞內鈣，每孔7個視野同時拍照。利用Columbus圖像處理及二次處理軟件對細胞表型結果進行分析。①通過標記細胞核，計數每孔細胞數；②對細胞核形態(tài)進行分析，檢測細胞核面積的變化；③通過計算鈣離子的探針的熒光強度測定細胞內鈣離子含量；④MitoTrack?er Deep Red染色線粒體，根據探針熒光強度的變化表征線粒體呼吸強度，統(tǒng)計為線粒體質量；⑤檢測細胞內線粒體形態(tài)的變化如線粒體面積；⑥通過紋理分析方法如SER Ridge，觀察線粒體的形狀。綜合以上不同細胞器，6種指標評價藥物對心肌細胞的毒性作用。

1.6 數據處理及二次分析

高內涵篩選系統(tǒng)結合了自動熒光顯微鏡成像功能，可以對單次實驗進行高通量多指標分析。Columbus高效有序的圖像數據管理和分析系統(tǒng)對數據進行二次分析和管理，以及數據軟件graph pad綜合分析得到劑量-效應曲線。實驗結果數據用表示，采用SPSS17.0數據統(tǒng)計軟件，對數據進行正態(tài)性檢驗，多組間比較采用單因素方差分析，分析方法為LSD。

2 結果

2.1 胺碘酮、多柔比星、次烏頭堿和藤黃酸對細胞核的影響

2.1.1 細胞存活

抗心律失常藥Ami對心肌細胞產生毒性作用，活細胞數隨濃度的增加呈下降的趨勢，Ami約在10 μmol·L-1的濃度下對細胞有明顯的殺傷作用，其EC50值為14.83 μmol·L-1（圖1 B）；Dox對細胞有較高的致死率，使活細胞數下降，EC50值為0.72 μmol·L-1，DNA損傷使得細胞核熒光染料Hoechst 33342的熒光強度降低（圖1 C）；陰性對照次烏頭堿并未對H9c2心肌細胞活力造成影響（圖1 D）；藤黃酸的毒性作用則較強，抑制細胞存活的半數有效濃度為0.24 μmol·L-1（圖1 E）。

2.1.2 細胞核面積

細胞核面積指標結果顯示，與溶劑對照組相比，Ami則使細胞核皺縮，其EC50值為6.72 μmol·L-1（圖2A）；Dox使細胞核脹大，細胞核面積在濃度1 μmol·L-1時有顯著性增加（P＜0.01），其EC50為 0.014 μmol·L-1（圖2 B）；次烏頭堿并未對細胞核造成影響（圖2 C）；而藤黃酸對細胞核有明顯的皺縮作用，使細胞核面積減小，與Ami處理組相似，EC50值為1.16 μmol·L-1（圖2 D）。

Fig.1 Effect of amiodarone（Ami，B），doxorubicin（Dox，C），hypaconitine（D）and gambogic acid（E）on nuclei of H9c2 cells by high content analysis imaging system labeling with Hoechst33342（blue）.The cells were treated with from 0.014 to 10 μmol·L-1compounds for 24 h respectively.n=3.＊P＜0.05，＊＊P＜0.01，compared with control group.

2.2 胺碘酮、多柔比星、次烏頭堿和藤黃酸對胞內鈣離子的影響

鈣離子染料的熒光值與正常組的熒光值做比對結果發(fā)現，與正常組相比，Ami 10 μmol·L-1對導致鈣離子含量下降（圖3 A）；Dox對胞內鈣離子含量稍微有影響，在10 μmol·L-1時有顯著性差異（P＜0.01）（圖3 B）；次烏頭堿對胞內鈣離子無影響（圖3 C）；藤黃酸使胞內鈣離子含量降低，EC50值為0.41 μmol·L-1（圖3 D）。

Fig.3 Effect of Ami（A），Dox（B），hypaconitine（C）and gambogic acid（D）on cellular calcium mobilization of H9c2 cell lines.H9c2 cells were exposed to compounds for 24 h at a concentration from 0.014 to 10 μmol·L-1.n=3.＊P＜0.05，＊＊P＜0.01，compared with control group.

2.3 胺碘酮、多柔比星、次烏頭堿和藤黃酸對線粒體的影響

2.3.1 線粒體質量

圖4 B顯示，H9c2細胞受到Ami刺激后，原有的顆粒狀線粒體聚集成滴狀；線粒體的質量降低，EC50值為4.54 μmol·L-1；Dox誘導線粒體失常，使線粒體形狀明顯由橢圓形變成了線形，線粒體質量稍有增加，其EC50值為1.21 μmol·L-1（圖4 C）；次烏頭堿對細胞的線粒體未造成損傷（圖4 D）；藤黃酸作用細胞后，線粒體質量減小，其EC50值為1.21 μmol·L-1（圖4E）。

Fig.4 Effect of Ami（A），Dox（B），hypaconitine（C）and gambogic acid（D）on the mitochondria of H9c2 cell lines by high content analysis imaging system labeling with MitoTracker Deep Red（red）.The cells were exposed to compunds at a concentration from 0.014 to 10 μmol·L-1for 24 h，respectively.n=3.＊＊P＜0.01，com?pared with control group.

2.3.2 次烏頭堿和藤黃酸對線粒體面積的影響

為了更好的說明藥物作用后線粒體的變化，增加檢測了次烏頭堿和藤黃酸作用心肌細胞后線粒體面積和線粒體紋理的變化。與正常組相比，藤黃酸不僅使線粒體質量減小且線粒體面積有增加趨勢，其EC50值為0.44 μmol·L-1（圖5 B）次烏頭堿對細胞無任何作用（圖5 A）。

Fig.5 Effect of hypaconitine（A）and gambogic acid（B）on mitochondria area of H9c2 cell lines.H9c2 cells were exposed to compounds for 24 h at a concentration from 0.014 to 10 μmol·L-1.n=3.＊＊P＜0.01，compared with control group.

2.3.3 次烏頭堿和藤黃酸對線粒體紋理分析的影響

線粒體SER ridge紋理分析結果表明，與正常對照組相比，次烏頭堿作用后，SER Ridge降低（圖6 A），但藤黃酸的作用后SER Ridge降低更顯著（P＜0.01），Z’值平均為0.5，P＜0.05，假陽性率在可控范圍內，評價方法可靠。這6種指標都證明了藤黃酸對心肌細胞H9c2有明顯的損傷作用。

Fig.6 Effect of hypaconitine（A）and gambogic acid（B）on SER ridge of H9c2 cell lines.H9c2 cells were exposed to compounds for 24 h at a concentration from 0.014 to 10 μmol·L-1.，n=3.＊P＜0.05，＊＊P＜0.01，compared with control group.

3 討論

Dox是使用最廣泛的有效抗腫瘤藥物之一，但通過介導Bax蛋白和依賴p38造成細胞內氧化應激，從而引起細胞凋亡［5］又促進細胞壞死［17］，結果顯示Dox降低細胞數。本研究EC50約在0.82 μmol·L-1，與文獻參考值1 μmol·L-1［18］較接近。Ami屬Ⅲ類抗心律失常藥，已有研究指出Ami通過介導胱天蛋白酶2和胱天蛋白酶9的通路誘導大鼠心肌細胞系H9c2細胞凋亡［19］。最明顯的特征是細胞收縮，核固縮，染色質凝結，細胞質致密，細胞器分布更緊湊［20］。Ami處理導致細胞核收縮，線粒體聚集更緊密，EC50值已達4.50 μmol·L-1［8］。烏頭是公認的對心臟有強烈毒性的中藥，其成分中包含3個主要生物堿，分別為烏頭堿、中烏頭堿和次烏頭堿。有研究顯示，這3種單體的毒性遠不及烏頭總毒性［21］，而次烏頭堿已被發(fā)現會造成QT間期延長［22］。本實驗表明，與藤黃酸相比，次烏頭堿的心臟毒性較弱，僅對線粒體的分布和形狀有顯著影響，但未發(fā)現對細胞的致死情況。

藤黃酸作為廣譜抗癌藥，對于小鼠肺癌細胞，藥物濃度為10 mg·kg-1時即有輕度療效，20 mg·kg-1已有較好抑制效果，30 mg·kg-1時可完全抑制肺癌細胞的生長［21］。有實驗發(fā)現，300 nmol·L-1能有效抑制神經膠質瘤細胞的生長［23］，抑制肝癌細胞SMMC7721生長的EC50值為1.2～3.2 μmol·L-1［24-25］。小鼠后腿肌內注射藤黃酸，電鏡觀察發(fā)現不同時間段藥物對線粒體的損傷逐漸加重，24 h心肌細胞線粒體數量增多，48 h心肌細胞線粒體腫脹，基質變空，72 h可見畸形線粒體［26］。大鼠急性毒性試驗和犬長期毒性試驗結果表明，長期給藥會造成其肝、腎器官的明顯毒性以及心臟的部分損傷［27］。但是應用細胞水平的檢測方法卻不多。我們發(fā)現藤黃酸對正常H9c2心肌細胞有明顯殺傷作用，降低細胞數EC50值相對較低（0.24μmol·L-1），對心肌細胞的毒性作用近似于Dox的結果。細胞核明顯皺縮，細胞核面積有顯著性減小，作用效果類似于胺碘酮藤黃酸1 μmol·L-1時，線粒體面積增大，其次線粒體呼吸能力有減弱傾向，＞3.3 μmol·L-1時，線粒體質量降低。胞內鈣離子濃度降低，說明藤黃酸作用心肌細胞，使細胞核、線粒體和胞內鈣離子含量都產生了損傷。高內涵細胞水平評價心臟毒性不僅高通量、多參數，還可預測細胞機制。

綜上，本研究建立了基于高內涵多指標心臟毒性安全性評價方法，并對藤黃酸的心臟毒性進行了綜合評價及多指標的量化分析。藤黃酸不僅促進線粒體聚集，線粒體形狀異常，線粒體質量下降，還導致胞內鈣離子降低，穩(wěn)態(tài)失衡，促使心肌細胞凋亡。多重影像學參數的同步評價對藤黃酸引起的心肌細胞核及線粒體的功能和形態(tài)進行較為全面的分析，并對其毒性作用機制做出初步的判斷，可為用藥安全性再評價及新藥開發(fā)早期毒性預測提供新的技術支持。

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Quantitative cardiotoxicity assessment of gambogic acid using multiple cellular phenotype analysis

ZHU Jie1,2,WANG Meng1,2,ZHU Yan1,2

(1.Tianjin Key Laboratory of Modern Chinese Medicine,Tianjin University of Traditional Chinese Medicine,Tianjin 300193,China;2.Tianjin International Joint Academy of Biomedicine, Tianjin 300457,China)

OBJECTIVETo evaluate the cardiotoxicity of a widen-spectrum antineoplastic drug, gambogic acid,through quantitative multiple cellular phenotypic characterization.METHODSH9c2 cell line was used as a model with doxorubicin(Dox)and amiodarone(Ami)as positive controls,hypaconi?tine as negative control and 0.1%DMSO as normal control.An optimized protocol was established to identify the morphology and function of cell nuclei.The effect of drugs on cell viability,nuclear area (Hoechst33342),mitochondria mass(MitoTracker Deep Red)and cytoplasmic calcium ion mobilization (Rhod2 AM)was studied.EC50and Z′values were calculated to evaluate the degree of toxicology and to estimate the precision and false-positive rate,respectively.RESULTSDose-response analysis indicated that EC50of Dox on cell viability,nuclear area,mitochondrial mass was 0.72,0.014 and 1.21 μmol·L-1, respectively.On the other hand,EC50of Ami on the parameters of cell viability,nuclear area and mitochon?drial mass was 14.83,6.72 and 4.54 μmol·L-1,respectively with Z′value above 0.5.Hypaconitine decreased the SER ridge of mitochondria.Gambogic acid caused significant mortality of H9c2 cells and induced nuclear shrinkage as Ami did.The EC50values of cell viability and nuclear area were 0.24 and 1.16 μmol·L-1.Meanwhile,gambogic acid disturbed the mitochondrial function as indicated by the increased mitochondrial area(EC50=0.44 μmol·L-1),abnormal SER Ridge(EC50=0.99 μmol·L-1)and decreased mitochondrial mass(EC50=1.21 μmol·L-1).Cellular calcium mobilization was lower than normal(EC50=0.41 μmol·L-1).CONCLUSIONThe EC50values of positive controls calculated from our assessment are similar those reported in literature.A multi-parameter and simultaneous evaluation enables a comprehensive analysis of the morphology of nuclei and mitochondria of cardiomyocytes and a preliminary assessment of the mechanisms of toxicity.

cardiac toxicity;gambogic acid;H9c2 cell line;high-content screening

ZHU Yan,E-mail:yanzhu.harvard@iCloud.com,Tel:15822700439

R285.1

：A

：1000-3002-（2017）01-0073-07

10.3867/j.issn.1000-3002.2017.01.009

2015-12-08接受日期：2016-06-15）

（本文編輯：沈海南喬 虹）

科技部國家國際合作專項（2013DFA31620）；國家科技重大專項（2013ZX09201020）；天津市高等學校創(chuàng)新團隊（TD12-5031）

祝 婕，女，碩士研究生，主要從事中藥藥理研究；王 萌，女，博士，副研究員，主要從事中藥制劑及藥物安全性評價研究；朱 彥，博士，教授，主要從事中藥藥理研究。

朱 彥，E-mail：yanzhu.harvard@iCloud.com，Tel：15822700439

Foundation item:The project supported by International Cooperation Project of MOST of China(2013DFA31620);National Major New Drug Discovery(2013ZX 0920102);and Program for Tianjin Innovative Research Team in University(TD12-5031)