銀杏二萜內(nèi)酯葡胺注射液通過激活Akt/Nrf2通路抑制缺糖缺氧誘導的SH-SY5Y細胞的氧化應激損傷

金治全，許治良，劉 秋，周 軍，曹 亮，丁 崗，王振中，蕭 偉

（江蘇康緣藥業(yè)股份有限公司，中藥制藥過程新技術(shù)國家重點實驗室江蘇省企業(yè)院士工作站，江蘇 連云港 222001）

銀杏二萜內(nèi)酯葡胺注射液通過激活Akt/Nrf2通路抑制缺糖缺氧誘導的SH-SY5Y細胞的氧化應激損傷

金治全，許治良，劉 秋，周 軍，曹 亮，丁 崗，王振中，蕭 偉

（江蘇康緣藥業(yè)股份有限公司，中藥制藥過程新技術(shù)國家重點實驗室江蘇省企業(yè)院士工作站，江蘇 連云港 222001）

目的探討銀杏二萜內(nèi)酯葡胺注射液（DGMI）抑制缺糖缺氧（OGD）誘導人源性神經(jīng)母細胞瘤細胞（SH-SY5Y）的氧化應激損傷及其機制。方法SH-SY5Y細胞隨機分為正常細胞對照組，OGD模型組，OGD 4 h+DGMI 25 mg·L-1組，OGD 4 h+銀杏葉提取物注射液（EGBLI）25 mg·L-1組，OGD 4 h+銀杏內(nèi)酯注射液（LGBI）25 mg·L-1組。藥物作用6 h后，CCK-8法檢測細胞存活，水溶性四唑鹽1（WST-1）顯色法法檢測SOD活性，熒光探針法（DCFH-DA）檢測ROS生成，Western蛋白印跡法檢測細胞內(nèi)血紅素加氧酶（HO-1）、醌氧化還原酶（Nqo1）、蛋白激酶B（Akt）、磷酸化Akt（p-Akt）、細胞內(nèi)核因子E2相關(guān)因子2（Nrf2）、磷酸化Nrf2（p-Nrf2）的表達；OGD 4 h+DGMI 25 mg·L-1組加入PI3K抑制劑LY294002（終濃度為0，12.5，25和50 μmol·L-1），檢測1 h后Akt，p-Akt，Nrf2和p-Nrf2的蛋白表達。結(jié)果與正常細胞對照組相比，OGD模型組SH-SY5Y細胞存活和SOD活性降低（P＜0.01），ROS含量升高（P＜0.01），降低p-Akt，Nrf2，p-Nrf2，HO-1和Nqo1的表達（P＜0.01）；與OGD模型組相比，OGD 4 h+藥物組作用6 h，細胞存活率和SOD活性顯著提高（P＜0.01），ROS含量降低（P＜0.05，P＜0.01），p-Akt，Nrf2，p-Nrf2，HO-1和Nqo1蛋白表達水平提高（P＜0.01），且DGMI 25 mg·L-1效果優(yōu)于EGBLI 25 mg·L-1和LGBI 25 mg·L-1（P＜0.05，P＜0.01）；相較DGMI組，DGMI和LY294002作用1 h后p-Akt和p-Nrf2的表達被顯著抑制（P＜0.01），抑制效果呈濃度依賴性。結(jié)論DGMI 25 mg·L-1對OGD誘導的SH-SY5Y細胞具有抗氧化保護作用，其機制可能與激活Akt/Nrf2通路有關(guān)。

銀杏二萜內(nèi)酯葡胺注射液；氧化應激；蛋白激酶B；細胞內(nèi)核因子E2相關(guān)因子2

腦血管病已成為我國居民死亡和成人殘疾的主要原因之一，嚴重危害人類健康，其中又以缺血性腦血管卒中最為常見。來自世界衛(wèi)生組織的數(shù)據(jù)表明（HTTP：//www.who.int/cardiovascular_diseases/ resources/atlas/en/），每年全世界有1500萬人患卒中，有500萬人因而死亡，500萬人終身殘廢，給家庭和社會帶來沉重負擔。目前，最主要的治療是溶栓以使血運重建，矛盾的是這會引起更嚴重的缺血再灌注損傷。腦缺血急性期后，腦損傷因缺血再灌注損傷可繼發(fā)性加重，這是由多種因素參與的復雜病理過程，主要包括細胞炎癥反應、能量代謝異常、氧化應激、興奮性氨基酸終濃度及Ca2+穩(wěn)態(tài)失調(diào)等多個環(huán)節(jié)［1］。

研究表明，在各種神經(jīng)疾病中，包括慢性神經(jīng)退行性疾病、急性腦外傷及腦缺血腦損傷等，氧化應激與神經(jīng)死亡關(guān)系密切［2］。神經(jīng)組織富含對氧自由基敏感的不飽和脂肪酸，又相對缺乏抗氧化物質(zhì)。因此，易受氧自由基的傷害，導致神經(jīng)細胞死亡?；钚匝酰╮eactive oxygen species，ROS）產(chǎn)生的氧化應激是造成細胞凋亡的重要環(huán)節(jié)［3］，腦缺血可誘發(fā)氧化應激，ROS過多或清除能力下降，導致氧化系統(tǒng)和抗氧化系統(tǒng)失衡［4］，在腦缺血的病理發(fā)病機制中起非常重要的作用［5-6］。在腦缺血損傷中，產(chǎn)生的ROS可直接損傷細胞的脂質(zhì)體，蛋白質(zhì)及DNA等［7］。氧化應激是缺血缺氧性腦病發(fā)展過程中的重要環(huán)節(jié)，是產(chǎn)生氧化損傷的更深層原因。越來越多的證據(jù)表明，刺激內(nèi)源性抗氧化系統(tǒng)的表達將是治療缺血性腦血管病的重要措施［8］。抑制腦缺血誘導的氧化應激對治療腦缺血具有非常重要的意義。

銀杏二萜內(nèi)酯葡胺注射液（diterpene ginkgolides meglumine injection，DGMI）（康緣藥業(yè)）用于治療腦缺血具有良好療效［9］，該注射液由多個銀杏二萜內(nèi)酯組成（圖1），包括銀杏內(nèi)酯A（ginkgolide A，GA），GB，GC和GK。除了可特異性拮抗PAF受體，抑制血栓形成以外，DGMI還能通過激活蛋白激酶A（protein kinase A，PKA）和磷脂酰肌醇-3激酶/蛋白質(zhì)絲氨酸蘇氨酸激酶信號通路（PI3K/Akt），抑制細胞凋亡，發(fā)揮神經(jīng)元保護作用［10-11］。為了進一步研究DGMI的神經(jīng)保護機制，我們以缺糖缺氧（oxygen-glucose deprivation，OGD）的SH-SY5Y細胞作為腦缺血的細胞模型，研究DGMI抑制氧化應激保護神經(jīng)元的分子機制。

Fig.1 Chemical structures of ginkgolides and their content ratios in DGMI.GA：ginkgolide A；GB：ginkgolide B；GC：ginkgolide C；GK：ginkgolide K

1 材料與方法

1.1 細胞、藥品、試劑和儀器

人神經(jīng)母細胞瘤細胞SH-SY5Y購自中國科學院上海細胞庫。

DGMI，江蘇康緣藥業(yè)股份有限公司，批號：141201；銀杏葉提取物注射液（extract of ginkgo biloba leaves injection，EGBLI），批號：H6138，臺灣濟生化學制藥廠股份有限公司；銀杏內(nèi)酯注射液（lactones ginkgo biloba injection，LGBI）批號：08130607，成都百?？萍贾扑幱邢薰?；CCK-8試劑盒，貝博生物；DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清，美國Gibco公司；HRP標記HO-1-兔單克隆IgG抗體、Nqo1-兔單克隆IgG抗體、Nrf2兔單克隆IgG抗體、p-Nrf2（Ser40）兔單克隆IgG抗體和β肌動蛋白兔單克隆IgG抗體，英國Abcam公司；HRP標記羊抗兔IgE抗體，美國Santa cruz公司；HRP標記Akt-兔單克隆IgG抗體和p-Akt（Thr308）-兔單克隆IgG抗體，美國CST公司；PI3K抑制劑LY294002、2‘7’-二氯雙乙酸鹽熒光探針（2，7-dichlorofluorescin diacetate，DCFH-DA）和超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）檢測試劑盒，美國Sigma公司；磷酸化抑制劑PhosStop EASYpack，瑞士Roche公司。

Thermo scientific 3100二氧化碳培養(yǎng)箱（美國Thermo公司）；Flex station 3微孔板檢測系統(tǒng)（美國MD公司）；ChemiDoc XRS系統(tǒng)（美國Bio-Rad公司）；C150三氣培養(yǎng)箱（德國Binder公司）。

1.2 缺糖缺氧細胞模型的建立

取對數(shù)生長期SH-SY5Y細胞，于5%CO2，37℃培養(yǎng)24 h后，去上清，用無糖DMEM清洗兩次，含無細胞空白孔每孔加入相應100 μL無糖DMEM后，置于含5%CO2和95%N2的三氣培養(yǎng)箱內(nèi)于37℃，OGD培養(yǎng)0.5～8 h，CCK-8檢測450 nm吸光度值（A450nm），計算細胞存活率，細胞存活率%=［（實驗組A450nm-空白孔A450nm）/（正常細胞對照組A450nm-空白孔A450nm）］×100%。選擇細胞存活率＜60%的OGD時間作為模型組，復氧給不同濃度DGMI（0.19，0.39，0.78，1.56，3.12，6.25，12.5，25和50 mg·L-1），0.5～8 h后檢測細胞存活率，選擇細胞存活率＞80%的DGMI作用時間作為給藥組。

1.3 細胞分組

將SH-SY5Y細胞分為正常細胞對照組，OGD模型組，OGD 4 h+DGMI 25 mg·L-1，OGD 4 h+ EGBLI 25 mg·L-1和OGD 4 h+LGBI 25 mg·L-1給藥組，OGD 4 h+EGBLI 25 mg·L-1+LY294002（12.5，25和50 μmol·L-1）抑制組，其中OGD 4 h+ EGBLI 25 mg·L-1和OGD 4 h+LGBI 25 mg·L-1組為陽性對照組。

1.4 熒光探針檢測ROS水平

取對數(shù)生長期SH-SY5Y細胞，密度為2×105L-1，于黑色透明的96孔板每孔接種200 μL，培養(yǎng)過夜。1.3各組細胞置于含5%CO237℃培養(yǎng)6 h，然后加入終濃度為10 nmol·L-1的DCFH-DA，37℃孵育20 min，用HBSS（mmol·L-1：NaCl 137.93，KCl 5.33，NaHCO34.17，KH2PO40.411，Na2HPO40.338）清洗3次，再加入100 μL HBSS，酶標儀檢測，激發(fā)波長488 nm，發(fā)射波長525 nm，用DCFH-DA的熒光強度比值（F525nm：F488nm）表示ROS水平。

1.5 WST-1法檢測SOD活性

取對數(shù)生長期SH-SY5Y細胞，密度2×105L-1，于24孔板每孔接種1 mL。1.3各組細胞培養(yǎng)6 h，HBSS洗滌2次，加入含0.1%Triton X-100的HBSS 200 μL，超聲裂解細胞，使用試劑盒中空白1、空白2、空白3以及相關(guān)檢測試劑檢測各孔450 nm吸光度值（A450nm），SOD活性以黃嘌呤氧化酶（xanthine oxidase，XO）的抑制率表示，XO抑制率（%）=〔（空白1A450nm-空白3A450nm）-（樣品A450nm-空白2A450nm）〕/（空白1A450nm-空白3A450nm）×100%。

1.6 Western蛋白印跡檢測蛋白表達

BCA法測定蛋白濃度，調(diào)整蛋白濃度后取50 μg總蛋白，經(jīng)SDS-PAGE后，電轉(zhuǎn)蛋白至PVDF膜，用TBST配置的5%BSA封閉2 h，按1∶1000比例加入各蛋白一抗，4℃孵育過夜，TBST洗滌3次后加入HRP標記的二抗（1∶2000），室溫孵育2 h后洗滌3次，ECL法顯影，ChemiDoc XRS系統(tǒng)拍攝照片。Quantity One軟件對蛋白印跡進行積分吸光度（integrated absorbance，IA）分析，蛋白表達水平用IA目標蛋白／IAβ肌動蛋白比值表示。Akt和Nrf2的調(diào)控作用與其磷酸化相關(guān)，蛋白的磷酸化可在較短時間內(nèi)完成，而表達則需要相對較長時間，因此檢測了1 h和6 h的磷酸化水平，而抗氧化蛋白HO-1和Nqo1的抗氧化能力與表達水平相關(guān)，因此只檢測了6 h的表達。

1.6.1 SH-SY5Y細胞抗氧化相關(guān)蛋白HO-1和Nqo1表達的檢測

取對數(shù)生長期的SH-SY5Y細胞，調(diào)整細胞濃度至5×107L-1，10 mL接種于75 cm2培養(yǎng)皿，置37℃和5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜。按1.3分組給藥，6 h后提取蛋白，檢測抗氧化蛋白HO-1和Nqo1的表達。

1.6.2 SH-SY5Y細胞Akt和Nrf2磷酸化水平的檢測

細胞OGD作用4 h后，按1.3分組，各給藥組復氧1 h和6 h后提取蛋白，檢測Akt，p-Akt，Nrf2和p-Nrf2的表達及磷酸化水平。

1.6.3 PI3K抑制劑LY294002對PI3K/Akt信號通路相關(guān)蛋白影響的檢測

細胞OGD作用4 h后，DGMI給藥組同時加LY294002 0，12.5，25和50 μmol·L-1，1 h后，提取蛋白，檢測Akt，p-Akt，Nrf2和p-Nrf2的表達，以驗證DGMI是否通過此通路抑制氧化應激損傷。

1.7 統(tǒng)計學分析

使用SPSS 16.0統(tǒng)計軟件進行分析，實驗數(shù)據(jù)均以x±s表示，兩組間比較采用t檢驗，多組間比較采用ANOVA檢驗，相關(guān)性分析采用Pearson相關(guān)性分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 DGMI對OGD誘導的SH-SY5Y細胞存活的影響

CCK-8結(jié)果（圖2A）顯示，OGD作用4 h時，SH-SY5Y細胞存活率降低至56.05%，選取OGD 4 h作為模型組。OGD 4 h后給不同濃度DGMI作用6 h后，隨給藥濃度的增加，細胞存活率呈濃度依賴性上升（r=0.98，P＜0.01）（圖2B），DGMI 25 mg·L-1組細胞存活率達到87.23%，較模型組相比顯著升高（P＜0.01）。圖2C顯示，DGMI 25 mg·L-1給藥6 h組細胞存活率提升至81.20%，較模型組相比SH-SY5Y細胞存活率顯著升高（P＜0.01），提示DGMI能抑制OGD誘導的SH-SY5Y細胞損傷，在后續(xù)實驗中，本研究采用OGD 4 h作為模型組，DGMI 25 mg·L-1作用6 h進行抗氧化應激研究，檢測ROS和SOD以及上游調(diào)控蛋白Akt，Nrf2的表達和磷酸化水平。選擇1 h做相關(guān)通路驗證，檢測Akt及p-Akt，Nrf2和p-Nrf2的表達。

Fig.2 Effect of diterpene ginkgolides meglumine injection（DGMI）on cell viability of oxygen-glucose deprivation（OGD）-damaged SH-SY5Y cells.A：cell viabilities of SH-SY5Y cells after OGD treatment for 0.5-8 h；B：cell viabilities of SH-SY5Y cells treated by OGD for 4 h and followed by different concentrations of DGMI for 6 h；C：cell viabillities of SH-SY5Y cells treated by DGMI 25 mg·L-1for different lengths of time.x±s，n=3.＊P＜0.05，＊＊P＜0.01，compared with model group.

2.2 DGMI對OGD誘導的SH-SY5Y細胞內(nèi)ROS水平和SOD活性的影響

ROS水平檢測結(jié)果顯示（圖3A～B），相較正常細胞對照組，模型組ROS水平顯著升高（P＜0.01）；與模型組相比，給藥作用6 h，隨著DGMI濃度的升高，ROS呈濃度依賴性降低（r=-0.83，P＜0.01）（圖3A）。各給藥組ROS水平顯著降低（P＜0.01），提示DGMI，EGBLI和LGBI都能抑制SH-SY5Y細胞內(nèi)OGD誘導的氧化應激；較EGBLI和LGBI組相比，DGMI組ROS水平降的更低（P＜0.01）。

SOD活性檢測結(jié)果（圖3C）顯示，與正常細胞對照組相比，模型組SH-SY5Y細胞內(nèi)SOD活性顯著降低（P＜0.01）；給藥作用6 h后，各給藥組SHSY5Y細胞的SOD活性顯著升高（P＜0.05，P＜0.01），給藥組間無顯著差異。

Fig.3 Effect of DGMI on ROS level and superoxide dis?mutase（SOD）activityinOGD-damaged SH-SY5Y cells.A：ROS Levels in OGD-damaged SH-SY5Y cells treated with different concentrations of DGMI for 6 h;B and C：ROS levels and SOD activity in OGD-damaged SH-SY5Y cells treated with 25 mg·L-1DGMI，EGBLI and LGBI for 6 h，respectively.s，n=3.＊＊P＜0.01，compared with normal control group；#P＜0.05，##P＜0.01，compared with model group；△△P＜0.01，compared with DGMI group.

2.3 DGMI作用6 h對OGD誘導的SH-SY5Y細胞內(nèi)Akt和Nrf2表達和活性的影響

圖4結(jié)果表明，與正常細胞對照組相比，OGD使SH-SY5Y細胞中的p-Akt，Nrf2和p-Nrf2表達顯著降低（P＜0.01）。與模型組相比，OGD作用4 h，給藥作用6 h，DGMI，EGBLI和LGBI都可顯著提升p-Akt，Nrf2和p-Nrf2的表達（P＜0.05，P＜0.01），細胞內(nèi)總Akt的表達沒有顯著變化，p-Nrf2/Nrf2沒有變化，說明DGMI，EGBLI和LGBI還可通過提高Nrf2表達以提高其活性，其中DGMI組Nrf2和p-Nrf2表達顯著高于EGBLI和LGBI（P＜0.01）。

Fig.4 Effect of DGMI on expression of p-Akt，total Akt，total Nrf2 and p-Nrf2 in OGD-damaged SH-SY5Y cells detected by Western blotting.See Fig.3 for cell treatment.B and C were the semi-quantitative result of A.，n=3.＊＊P＜0.01，compared with normal control group；#P＜0.05，##P＜0.01，compared with model group；△△P＜0.01,compared with DGMI group.

2.4 DGMI對OGD誘導的SH-SY5Y細胞抗氧化蛋白HO-1和Nqo1表達的影響

Western蛋白印跡檢測結(jié)果顯示（圖5），與正常細胞對照組相比，OGD作用4 h后，HO-1及Nqo1的表達顯著降低（P＜0.01）；給藥作用6 h后，各給藥組HO-1及Nqo1表達顯著高于模型組（P＜0.01）；同時，DGMI組HO-1表達顯著高于EGBLI（P＜0.01），與LGBI組差異無統(tǒng)計學意義。DGMI組Nqo1表達顯著高于EGBLI組和LGBI組（P＜0.05，P＜0.01）。結(jié)果表明，DGMI的抗氧作用與提高HO-1和Nqo1等抗氧化蛋白質(zhì)的表達有關(guān)。

Fig.5 Effect of DGMI 25 mg·L-1on protein expression of HO-1 and Nqo1 in OGD-damaged SH-SY5Y cells by Western blotting.See Fig.3 for cell treatment.B：semi-quantita?tive result of A.n=3.＊＊P＜0.01，compared with normal con?trol group；#P＜0.05，##P＜0.01，compared with model group；△P＜0.05,△△P＜0.01，compared with DGMI group.

2.5 DGMI作用1 h對OGD誘導的SH-SY5Y細胞內(nèi)Akt和Nrf2磷酸化的影響

Fig.6 Effect of DGMI on expression of Nrf2，p-Nrf2，total Nrf2，p-Akt and total Akt in OGD-damaged SH-SY5Y cells by Western blotting.Cells treated by OGD for 4 h of followed by DGMI 25 mg·L-1for 1 h.B was the semi-quantitative result of A.n=3.＊＊P＜0.01，compared with normal control group；#P＜0.05，##P＜0.01，compared with model group；△△P＜0.01, compared with DGMI.

Western蛋白印跡檢測結(jié)果顯示（圖6），OGD使SH-SY5Y細胞中Akt及Nrf2的磷酸化水平降低（P＜0.01）；OGD作用4 h，復氧給藥1 h，較模型組，DGMI，EGBLI和LGBI均能促進OGD的SH-SY5Y細胞中Akt和Nrf2的磷酸化（P＜0.01）；同時，DGMI組p-Nrf2和p-Akt表達顯著高于EGBLI（P＜0.01），與LGBI組相比，差異無統(tǒng)計學意義。

2.6 不同濃度LY294002阻斷DGMI對Akt和Nrf2磷酸化的影響

圖7結(jié)果顯示，隨著LY294002濃度的增加，p-Akt及p-Nrf2的表達濃度依賴性降低。DGMI激活Nrf2有能被PI3K抑制劑濃度依賴性阻斷。提示DGMI能通過激活Akt/Nrf2信號通路，提高Nrf2活性，提高抗氧化應激蛋白質(zhì)生成，抑制氧化應激的損害。

Fig.7 Effect of LY294002 on expression of p-Akt，total Akt，total Nrf2 and p-Nrf2 in OGD-damaged SH-SY5Y cells by Western blotting.Cells treated by OGD for 4 h fol?lowed by DGMI 25 mg·L-1and different concentrations of LY294002 for 1 h.B was the semi-quantitative result of A.n=3.＊＊P＜0.01，compared with normal control group；##P＜0.01，compared with model group.

3 討論

本研究結(jié)果表明，OGD誘導神經(jīng)細胞的氧化應激，使ROS水平升高，DGMI能濃度依賴性降低OGD誘導的SH-SY5Y細胞中ROS水平，具有保護SH-SY5Y細胞抵抗氧化應激損傷的作用。

本研究結(jié)果顯示，DGMI、EGBLI和LGBI都能提高OGD的SH-SY5Y細胞中的抗氧化蛋白質(zhì)的活性和蛋白質(zhì)水平。OGD使SH-SY5Y細胞內(nèi)SOD的活性下降，HO-1和Nqo1等蛋白質(zhì)水平降低，DGMI，EGBLI和LGBI能抑制OGD的誘導的SH-SY5Y細胞中SOD的活性下降，提升HO-1和Nqo1等蛋白的表達；能抑制OGD誘導的SH-SY5Y細胞中抗氧化蛋白表達水平的降低，進而降低OGD誘導的ROS的升高。相比EGBLI和LGBI，DGMI降低OGD誘導的ROS效果更好。

抗氧化蛋白HO-1和Nqo1的表達受Nrf2的調(diào)節(jié)［13］，本研究結(jié)果表明，DGMI，EGBLI和LGBI能抑制OGD的SH-SY5Y細胞中抗氧化蛋白質(zhì)水平和活性，與激活Nrf2/ARE信號有關(guān)。其中，DGMI效果更佳。在OGD的SH-SY5Y細胞中，Nrf2（S40）的磷酸化水平下降，活性降低。這些藥物能上調(diào)OGD的SH-SY5Y細胞中Nrf2（S40）的磷酸化水平。表明這些藥物的抗氧化作用與激活Nrf2上調(diào)抗氧化蛋白表達。Nrf2是核轉(zhuǎn)錄因子，在生理條件下，與胞漿蛋白伴侶分子（Kelch-like ECH-associated protein 1，Keap1）偶聯(lián)，并與肌動蛋白細胞骨架結(jié)合被錨定于細胞質(zhì)，通過泛素-蛋白酶體途徑可促進Nrf2降解［15］。另一部分Nrf2以磷酸化的活性狀態(tài)存在于細胞核中，介導基因的基本轉(zhuǎn)錄。氧化應激情況下Nrf2從胞漿轉(zhuǎn)移至胞核與ARE結(jié)合，啟動抗氧化基因表達，參與調(diào)節(jié)細胞的氧化應激反應［14］，調(diào)控的一大批下游分子具有抗氧化應激、調(diào)節(jié)炎癥損傷、抗細胞凋亡和緩解鈣離子超載等多重功能［8］。

在中樞系統(tǒng)中，Nrf2/ARE在細胞內(nèi)抗氧化反應中起著中樞調(diào)節(jié)作用，抗氧化蛋白質(zhì)水平和活性與Nrf2的活化有關(guān)。文獻表明，Nrf2通過激活下游的HO-1，谷胱甘肽（glutathione，GSH）及Nqo1保護機體免受氧化活性物質(zhì)的侵害［16］。永久性腦缺血的小鼠腦內(nèi)，Nrf2與Keap1的解離增加，促進Nrf2核轉(zhuǎn)移，HO-1的表達也隨之增加。而在Nrf2基因敲除的小鼠中，這種保護作用消失［17］。醌氧化還原酶Nqo1也已被證實為Nrf2下游的重要的抗氧化酶［18］。因此，抗氧蛋白質(zhì)的表達與Nrf2的活性有關(guān)。Nrf2通過磷酸化激活后，進入細胞核并結(jié)合ARE，啟動HO-1和Nqo1等表達［19］。

本研究表明，OGD能降低SH-SY5Y細胞中Akt（T308）的磷酸化水平。DGMI能使OGD的SHSY5Y細胞中Akt（T308）的磷酸化水平升高。表明DGMI能激活Akt信號通路。而Nrf2的轉(zhuǎn)錄活性受Akt的調(diào)節(jié)［12］，PI3K/Akt信號通路可調(diào)節(jié)Nrf2-ARE的活性，Akt磷酸化Nrf2（S40），增強Nrf2的活性［20］，從而促進細胞的內(nèi)源性抗氧化作用［21］。Akt有Thr308和Ser473磷酸化位點，其中T308位點的磷酸化可近百倍的增強Akt活性，S473約為5倍［22］，Akt的活性主要通過T308磷酸化水平來體現(xiàn)，我們檢測了OGD的SH-SY5Y細胞在DGMI與不同濃度的PI3K抑制劑LY294002同時DGMI作用1 h之后的Akt，p-Akt，Nrf2和p-Nrf2的表達，PI3K抑制劑能濃度依賴性的阻斷DGMI通過Akt對Nrf2的激活作用，調(diào)節(jié)Nrf2的活性。證明DGMI對Nrf2的活性的調(diào)節(jié)通過Akt/Nrf2信號通路。

我們的研究還表明，長時間的給藥還能提高Nrf2的表達。文獻報道Akt能調(diào)節(jié)Nrf2的表達［23］。因此，OGD作用4 h后給藥6 h，DGMI組Nrf2和p-Nrf2表達顯著高于EGBLI和LGBI可能與提高Akt活性有關(guān)。

綜上所述，DGMI可通過激活PI3K，增強其下游的Akt/Nrf2信號，促進OGD的SH-SY5Y細胞中抗氧化應激蛋白質(zhì)產(chǎn)生，發(fā)揮抗氧化應激作用。激活PI3K/Akt/Nrf2信號通路可能是DGMI抗氧化保護神經(jīng)細胞的機制之一。EGBLI中的銀杏二萜內(nèi)酯含量很低，黃酮類物質(zhì)較高。而LGBI中的白果內(nèi)酯含量高，銀杏二萜內(nèi)酯含量較低。DGMI全部是銀杏二萜內(nèi)酯。EGBLI和LGBI的抗氧化活性不如DGMI，可能與其中銀杏二萜內(nèi)酯含量較低有關(guān)。

生物體內(nèi)抗氧化系統(tǒng)是一個復雜的分子網(wǎng)路，涉及到的信號通路不僅僅有PI3K/Akt/Nrf2這一條；Nrf2的上游調(diào)控分子也不止Akt一個，還有其他的上游調(diào)控分子如ERK1/2和MAPK等；PI3K/Akt通路下游亦不止Nrf2一個分子，除了Nrf2這個重要分子是否還有其他的分子參與DGMI抗氧化過程有待進一步研究。

［1］Wang GS，Geng DQ.Recent studies on mecha nisms of cerebral ischemia/reperfusion injury［J］. Med Recapitulate（醫(yī)學綜述），2011，17（24）：3753-3756.

［2］Reiter RJ.Oxidative processes and antioxidative defense mechanisms in the aging brain［J］. FASEB J，1995，9（7）：526-533.

［3］Van Soom A，Yuan YQ，Peelman LJ，De Matos DG，Dewulf J，Laevens H，et al.Prevalence of apoptosis and inner cell allocation in bovine embryos cultured under different oxygen tensions with or without cysteine addition［J］.Theriogenology，2002，57（5）：1453-1465.

［4］Maritim AC，Sanders RA，Watkins JB.Diabetes，oxidative stress，and antioxidants：a review［J］.J Biochem Mol Toxicol，2003，17（1）：24-38.

［5］Chen SD，Yang DI，Lin TK，Shaw FZ，Liou CW，Chuang YC.Roles of oxidative stress，apoptosis，PGC-1alpha and mitochondrial biogenesis in cerebral ischemia［J］.Int J Mol Sci，2011，12（10）：7199-7215.

［6］Saito A，Maier CM，Narasimhan P，Nishi T，Song YS，Yu F，et al.Oxidative stress and neuronal death survival signaling in cerebral ischemia［J］. Mol Neurobiol，2005，31（1-3）：105-116.

［7］Meneghini R.Iron homeostasis，oxidative stress，and DNA damage［J］.Free Radic Biol Med，1997，23（5）：783-792.

［8］Zhang Y.Nrf2-Keapl Signaling pathways and cere?bral apoplexy［J］.Stroke Nerve Dis（卒中與神經(jīng)疾病），2014，31（4）：372-374.

［9］Zhao BJ，Wang ZZ，Ling Y，Zhou S，Wu SY，Dong SL，et al.PhaseⅢclinical trial of diterpene ginkgolides meglumine injection for syndrome of stagnant phlegm blocking collaterals in convales?cence of atherosclerotic thrombotic cerebral infarc?tion［J］.Chin Tradit Herb Drugs（中草藥），2013，44（24）：3525-3530.

［10］Liu Q，Xu ZL，Jin ZQ，Zhou J，Bi YA，Wang ZZ，et al.Diterpene ginkgolides meglumine injection attenuates oxygen-glucose deprivation-induced apop?tosis of nerve cells via inhibition of calpain signaling pathway［J］.J China Pharm Univ（中國藥科大學學報），2015，46（6）：707-711.

［11］Liu Q，Xu ZL，Zhou J，Li N，Bi YA，Wang ZZ，et al. Neuroprotective effects of YXETNZ injection on SH-SY5Y cells against injury induced by oxygenglucose deprivation［J］.Chin Pharmacol Bull（中藥藥理學通報），2015，31（7）：994-999.

［12］Martin D，Rojo AI，Salinas M，Diaz R，Gallardo G，Alam，et al.Regulation of heme oxygenase-1 expres?sion through the phosphatidylinositol 3-kinase/Akt pathway and the Nrf2 transcription factor in response to the antioxidant phytochemical carnosol［J］.J Biol Chem，2004，279（10）：8919-8929.

［13］Jeong WS，Jun M，Kong AN.Nrf2：A potential molecular target for cancer chemoprevention by natural compounds［J］.Antioxid Redox Signal，2006，8（1-2）：99-106.

［14］Mann GE，Niehueser-Saran J，Watson A，Gao L， Ishii T，de Winter P，et al.Nrf2 ARE Rgulated anti?oxidant gene in endothelial and smooth muscle cells in oxidative stress：implications for atheroscle?rosis and preeclampsia［J］.Acta Physiol Sin（生理學報），2007，59（2）：117-127.

［15］Giudice A，Montella M.Activation of the Nrf2-ARE signaling pathway：a promising strategy in cancer prevention［J］.Bioessays，2006，28（2）：169-181.

［16］Kang MI，Kobayashi A，Wakabayashi N，Kim SG，Yamamoto M.Scaffolding of Keapl to the actin cytoskeleton controls the function of Nrf2 as key regulator of cytoprotective phase 2 genes［J］.Proc Natl Acad Sci USA，2004，101（7）：2046-2051.

［17］Wang B，Cao WS，Biswal S，Doré S.Carbon monoxide-activated Nrf2 path way leads to protec?tion against permanent focal cerebral ischemia［J］. Stroke，2011，42（9）：2605-2610.

［18］Lin XM，Zhao J，Yu SS.Protective effects of diallyl sulfide on the focal cerebral ischemia-reperfusion in rats model［J］.Stroke Nerve Dis（卒中與神經(jīng)疾病雜志），2011，28（2）：100-103.

［19］Thimmulappa RK，Mai KH，Srisuma S，Kensler TW，Yamamoto M，Biswal S.Identification of Nrf2-regu?lated genesinduced bythe chemopreventive agent sulfora phane by oligonucleotide microarray［J］.Cancer Res，2002，62（18）：5196-5203.

［20］Wang L，Chen Y，Sternberg P，Cai J.Essential roles of the PI3 kinase Akt pathway in regulating Nrf2-dependent antioxidant functions in the RPE［J］.Invest Ophthalmol Vis Sci，2008，49（4）：1671-1678.

［21］Nakaso K，Yano H，F(xiàn)ukuhara Y，Takeshima T，Wada-Isoe K，Nakashima K.PI3K is a key mole?cule in the Nrf2-mediated regulation of antioxida?tive proteins by hemin in human neuroblastoma cells［J］.FEBS Lett，2003，546（2-3）：181-184.

［22］Hers I，Vincent EE，Tavaré JM.Akt signalling in health and disease［J］.Cell Signal，2011，23（10）：1515-1527.

［23］Umemura K，Itoh T，Hamada N，F(xiàn)ujita Y，Akao Y，Nozawa Y，et al.Preconditioning by sesquiterpene lactone enhances H2O2-induced Nrf2/ARE activation［J］.Biochem Biophys Res Commun，2008，368（4）：948-954.

Diterpene ginkgolides meglumine injection inhibits oxidative stress induced by oxygen-glucose deprivation by activating Akt/Nrf2 pathway in SH-SY5Y cells

JIN Zhi-quan,XU Zhi-liang,LIU Qiu,ZHOU Jun,CAO Liang,DING Gang, WANG Zhen-zhong,XIAO Wei

(Jiangsu Kanion Pharmaceutical Co.,Ltd.State Key Laboratory of New Pharmaceutical Process for Traditional Chinese Medicine,Enterprises Academician Workstations in Jiangsu Province, Lianyungang 222001,China)

OBJECTIVETo investigate the protective effects and mechanism of diterpene ginkgolides meglumine injection(DGMI)against oxidative stress induced by oxygen-glucose deprivation(OGD)in SH-SY5Y cells.METHODSSH-SY5Y cells were divided into five groups:normal control,model control (OGD group)and drug(25 mg·L-1)administration groups including DGMI group,extract of ginkgo biloba leaves injection group(EGBLI)and lactones ginkgo biloba injection group(LGBI).The cells suffered from oxygen-glucose deprivation(OGD)for 4 h,followed by reoxygenation with drugs for 6 h. Then,cell viabilities were detect using CCK-8 assays,reactive oxygen species(ROS)levels using fluorescence probe DCFH-DA and superoxide dismutase(SOD)activities using WST-1 test.Western blotting was used to detected protein levels of hemeoxygenase-1(HO-1),NAD(P)H,quinone oxidore?ductase l(Nqo1),protein kinase B(Akt),phosphorylated Akt(p-Akt),nuclear factor-E2-related factor2 (Nrf2)and phosphorylated Nrf2(p-Nrf2).The cells were induced by OGD for 4 h,followed by reoxygen?ation and DGMI for 1 h,combined with different concentrations of PI3K inhibitor(LY294002)(at the final concentration of 12.5,25 and 50 μmol·L-1)before the protein levels of AKT,p-AKT,Nrf2 and p-Nrf2 were detected by Western blotting.RESULTSSH-SY5Y cells induced by OGD for 4 h resulted in an increase in ROS(P＜0.01),but a decrease in cell viabilities(P＜0.01),SOD activities(P＜0.01),and antioxidant protein levels(Akt,p-Akt,Nrf2,p-Nrf2,HO-1 and Nqo1)(P＜0.01).Compared with OGD group,treatment with reoxygenation and drugs(DGMI,EGBLI and LGBI respectively)for 6 h resulted in a decrease in ROS(P＜0.01),but an increase in cell viabilities,SOD activities and antioxidant protein levels of p-Nrf2, HO-1,Nqo1 and p-Akt(P＜0.05,P＜0.01).DGMI group showed the best efficiently.Moreover,after OGD for 4 h,compared with DGMI group,combining reoxygenation and DGMI with LY294002 for 1 h resulted in a concentration-dependent inhibition of the protein levels of p-AKT and p-Nrf2(P＜0.01).CONCLUSIONDGMI 25 mg·L-1can inhibit oxidative stress in SH-SY5Y cells induced by OGD by increasing the activity and expression of Nrf2 through PI3K/Akt pathway,which may be one of the mechanisms by which DGMI protects neurons from stroke.

diterpene ginkgolides meglumine injection;oxidative stress;protein kinase B;nuclear factor-E2-related factor 2

XIAO Wei,E-mail:kanionlunwen@163.com,Tel:(0518)81152367

R285.5

：A

：1000-3002-（2017）01-0065-08

10.3867/j.issn.1000-3002.2017.01.008

2016-01-06 接受日期：2016-09-05）

（本文編輯：賀云霞）

國家科技重大專項（2013ZX09402203）

金治全，男，碩士，主要從事藥物作用機制研究，E-mail：jin.zq@163.com;蕭 偉，男，博士，高級工程師，主要從事中藥新藥的研究與開發(fā)。

通迅作者：蕭偉，E-mail：kanionlunwen@163.com，Tel：（0518）81152367

Foundation item:The project supported by National Science and Technology Major Proiect of China(2013ZX09402203)