黃芩苷改善Aβ25-35誘導的小鼠學習和記憶障礙及可能機制

肖 彎，曹曉璐，2，張 容，高成志，杜 晶，殷婷子，張 穎，洪 星，胡霞敏，2，任 波

（武漢科技大學1.醫(yī)學院藥學系，2.心腦血管藥物研究基地，3.醫(yī)學院基礎醫(yī)學部，湖北武漢 430065）

黃芩苷改善Aβ25-35誘導的小鼠學習和記憶障礙及可能機制

肖 彎1，曹曉璐1，2，張 容1，高成志1，杜 晶1，殷婷子1，張 穎1，洪 星1，胡霞敏1，2，任 波3

（武漢科技大學1.醫(yī)學院藥學系，2.心腦血管藥物研究基地，3.醫(yī)學院基礎醫(yī)學部，湖北武漢 430065）

目的觀察黃芩苷對Aβ25-35誘導的模型小鼠學習記憶能力的改善作用及對小鼠海馬區(qū)自噬和自噬相關基因的影響，探討黃芩苷治療阿爾茨海默?。ˋD）的可能機制。方法C57BL/6小鼠側(cè)腦室注射3 μL濃度為3 mmol·L-1的凝聚態(tài)Aβ25-35制備AD模型，ip給予黃芩苷25，50和100 mg·kg-1，連續(xù)給藥15 d。通過曠場實驗觀察小鼠的運動總距離和中央格停留時間，水迷宮定位航行實驗觀察其潛伏期，空間搜索實驗觀察原象限停留時間。透射電鏡觀察海馬區(qū)自噬小體的生成，Western蛋白印跡法測定中微管結合蛋白1輕鏈3分子（LC3）和Beclin1的表達。結果腦室注射Aβ25-35可引起小鼠曠場實驗運動總距離減少，從（3984±321）cm減少到（2790±306）cm，中央格停留時間由（3.6±1.2）s延長到（8.8±2.9）s，也可使水迷宮實驗到達平臺總時間由（22.0±1.9）s增加到（38.8±2.2）s；同時觀察到海馬區(qū)早期或晚期自噬泡形成。Western蛋白印跡結果顯示，LC3和Beclin1蛋白表達升高（P＜0.05）。黃芩苷50和100 mg·kg-1連續(xù)給藥15 d能延長曠場實驗運動總距離，分別為3705±337和（3968±448）cm；中央格停留時間分別縮短為5.6±1.8和（3.9±1.5）s；水迷宮實驗到達平臺總時間縮短為28.6±1.9和（22.9±1.7）s。透射電鏡可見海馬區(qū)線粒體腫脹，空泡狀雙層膜結構或者自噬泡形成；LC3和Beclin1蛋白表達明顯升高（P＜0.01）。結論黃芩苷對AD小鼠的學習記憶損傷有一定的改善作用，作用機制可能與其升高AD小鼠海馬區(qū)自噬水平有關。

黃芩苷；阿爾茨海默?。蛔允?；β-淀粉樣肽；學習障礙；記憶障礙

自噬是真核生物降解自身受損的細胞器和回收蛋白質(zhì)等大分子物質(zhì)的過程，參與真核生物的細胞退化，且在真核生物疾病的發(fā)生發(fā)展中起關鍵作用［1-2］。直到近十年來一系列自噬相關基因（Atg）和它們的編碼蛋白（ATG）的發(fā)現(xiàn)，自噬的分子機制逐漸為人所知。阿爾茨海默?。ˋlzheimer disease，AD）的研究和藥物開發(fā)已經(jīng)成為醫(yī)學界關注的老年問題，目前傾向于認為多種機制參與了AD特征性病理結構的形成過程，如Aβ毒性和tau蛋白異常修飾等，其分別是導致老年斑和神經(jīng)原纖維纏結的主要原因，而Aβ是能直接誘導腦內(nèi)炎性反應的刺激物［3］。研究發(fā)現(xiàn)，在神經(jīng)退行性疾病中，蛋白酶體對突變的polyQ，tau和α突觸核蛋白等蛋白質(zhì)失去作用，不能將這些突變的蛋白質(zhì)清除，導致這些蛋白質(zhì)的大量聚集［4-5］。AD大腦中，淀粉樣前體蛋白、病理性β淀粉樣肽、早老蛋白1在腫脹的神經(jīng)突的自噬泡內(nèi)高聚集，提示自噬參與AD病程［6-8］，但是上調(diào)的自噬水平并不足以有效清除毒性蛋白［9］。因此，提高腦內(nèi)自噬水平，清除聚集的蛋白質(zhì)是治療神經(jīng)退行性疾病的關鍵。黃芩苷是從黃芩根中提取分離出來的一種黃酮類化合物，具有顯著的生物活性，被廣泛應用于炎癥、流感和其他疾病的治療。最近的研究表明，黃芩苷能防止缺血再灌注引起的神經(jīng)細胞死亡，增強神經(jīng)系統(tǒng)功能［10］。有研究顯示，黃芩苷能夠透過血腦屏障分布腦內(nèi)，尤其在海馬、紋狀體、皮質(zhì)和丘腦部分［11］。為此，本研究通過觀察黃芩苷對Aβ25-35誘導的小鼠的學習記憶能力的影響，探討黃芩苷治療AD的可能機制，為黃芩苷用于AD臨床提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑和儀器

Aβ25-35，1 mg（美國Sigma公司），規(guī)格1 mg的Aβ25-35加314.5 μL的無菌生理鹽水中制成3 mmol·L-1的溶液，密封置于37℃經(jīng)7 d形成凝聚態(tài)，-20℃保存?zhèn)溆?。；黃芩苷由武漢煙草集團有限公司提供（純度96%）；鼠抗人Beclin1多克隆抗體購自美國Santa Cruz公司（產(chǎn)品編號：SC-48341）；兔抗小鼠微管結合蛋白1輕鏈分子3（microtubule-associated protein 1 light chain 3，LC3）多克隆抗體（產(chǎn)品編號：#3868）購自美國Cell Signaling公司。

ZH-藍星C/s型腦立體定位儀，安徽正華生物儀器設備有限公司。微量注射器，5μL，瑞士Hamilton公司。Morris水迷宮實驗系統(tǒng)（XR-XM101），上海欣軟信息科技公司。Xmaze曠場實驗分析系統(tǒng)，上海欣軟信息科技公司。LKB2V型超薄切片機，日立H2600型透射電鏡由武漢大學醫(yī)學院電鏡實驗室提供。

1.2 動物及AD模型構建

72只2月齡雄性C57小鼠，體質(zhì)量20～25 g，購自湖北省疾病預防控制中心，動物許可證號：SCXK（鄂）2015-0018。小鼠適應性飼養(yǎng)7 d后，水迷宮實驗篩選合格的小鼠，小鼠從任意2個象限入水，在2 min內(nèi)無法找到隱藏的平臺視為不合格。手術前1 d禁食、禁水12 h。稱重標記小鼠后，每鼠ip給予10%水合氯醛3.5 mL·kg-1麻醉，將麻醉后動物俯臥位固定于腦立體定位儀上。75%乙醇消毒術野，減壓開頭頂正中皮膚，鈍性分離各層至顱骨，找到前囟、對耳線。采用微量注射器行腦室注射（前鹵后0.22 mm，旁開1.0 mm，深度2.5 mm）［11］，給藥3 μL，速度0.5 μL·min-1，留針5 min，假手術組給予同等體積的生理鹽水。注射后分層縫合頭頂部的肌肉和皮膚，常規(guī)消毒、縫合傷口。

1.3 分組及給藥

1.2項處理的小鼠分為假手術組、模型組和黃芩苷25，50和100 mg·kg-1，每組12只。腦室注射3 μL濃度為3 mmol·L-1的凝聚態(tài)Aβ25-35后1 h，ip注射給予黃芩苷連續(xù)15 d，假手術組和模型組給予同等體積的生理鹽水。

1.4 Morris水迷宮實驗［13-14］

水迷宮裝置為一圓形水池，直徑120 cm，水深30 cm，加入白色食用色素使水不透明，水溫維持在19～21℃。池壁標記Ⅰ，Ⅱ，Ⅲ和Ⅳ4個入水點，在第Ⅲ象限中央水下1～2 cm處放置平臺。腦室注射后第10天水迷宮檢測小鼠學習記憶能力，一共持續(xù)5 d，包括①定位航行實驗：實驗時將小鼠頭朝池壁依次從4個入水點放入水池中，同時啟動監(jiān)測裝置，跟蹤并記錄動物游泳軌跡。給予小鼠60 s時間尋找平臺，若小鼠入水后60 s未找到平臺，則將其牽引至平臺并停留10 s。每只小鼠完成4個象限測試為1次訓練，每天訓練2次，連續(xù)5 d；②空間搜索實驗：第5天訓練結束后撤去平臺，將小鼠從距離原平臺位置最遠的象限（第Ⅰ象限）放入水中，記錄并分析小鼠在原平臺所在象限的時間。

1.5 曠場實驗測定動距離、跨格次數(shù)以及中央格數(shù)停留時間

由于河道下方土層情況不明，鋼板樁施工過程中，可能遇到存在石塊、雜物、建筑垃圾及護岸混凝土殘塊等的土層而導致鋼板樁沉樁受阻，無法順利打至設計高程。

腦室注射后第15天曠場實驗觀察小鼠的空間認知能力。將曠場劃分為25個大小相同的方格，設定四周16個方格為外周區(qū)域，其余9個方格為中心區(qū)域，實驗環(huán)境由2臺15 W紅色白熾燈提供照明。操作者將小鼠小心放人曠場正中格，用攝像系統(tǒng)記錄動物5 min的行為變化，包括運動距離、跨格次數(shù)以及中央格數(shù)停留時間。實驗共進行2次，每只小鼠實驗結束后清除糞便，用70%乙醇噴灑曠場底部并用潔凈紗布抹干，以免前只小鼠的殘留氣味造成對本次實驗的影響。

1.6 透射電鏡觀察海馬區(qū)自噬小體［15］

行為學實驗結束后，小鼠10%水合氯醛麻醉后，2%戊二醛左心室灌注固定，分離海馬CA1區(qū)，4%多聚甲醛后固定2 h，環(huán)氧樹脂包埋，使用振動切片機切成超薄切片（90 nm）。透射電子顯微鏡觀察并攝片。

1.7 Western蛋白印跡檢測海馬區(qū)Beclin1蛋白和LC3蛋白表達

行為學實驗結束后活殺小鼠，取新鮮腦組織，用蛋白裂解液提取總蛋白，常規(guī)電泳，轉(zhuǎn)膜，封閉后分別加入Beclin1一抗（1∶5000）和LC3一抗（1∶1000），4℃過夜，TBST洗滌，加入辣根過氧化物酶標記二抗，37℃1 h，化學發(fā)光顯色。用Quantity One（version 4.6）分析軟件測定各條帶的積分吸光度值，目標蛋白與內(nèi)標蛋白積分吸光度值比值表示蛋白相對表達量。

1.8 統(tǒng)計學分析

2 結果

表1結果顯示，與假手術組比較，模型組運動總距離減少，中央格停留時間延長（P＜0.05）；與模型組比較，黃芩苷25 mg·kg-1組小鼠運動總距離和中央格停留時間無顯著差異，黃芩苷50和100 mg·kg-1組小鼠運動距離增加，中央格停留時間減少(P＜0.01)。

Tab.1 Effect of baicalin on total distance and time spent in center in open-field test of mice

2.2 黃芩苷對Aβ25-35誘導小鼠學習記憶能力的影響

定位航行實驗（表2）結果顯示，訓練第1天到第3天，模型組動物的平均潛伏期與其他組無明顯差別；而且隨著訓練次數(shù)的增加，到達平臺的潛伏期不斷縮短。訓練第4天至第5天，模型組小鼠的上臺潛伏期和游泳距離明顯高于假手術組和黃芩苷50和100 mg·kg-1組（P＜0.05）。

空間搜索實驗（表3）結果顯示，實驗第5天撤除平臺，模型小鼠在平臺所在象限（第Ⅲ象限）中游泳的時間明顯低于假手術組（P＜0.05），與模型組比較，黃芩苷25 mg·kg-1組在平臺所在象限游泳時間無明顯改變，黃芩苷50和100 mg·kg-1組小鼠在平臺象限停留的時間明顯延長（P＜0.05）。

Tab.2 Effect of baicalin on latency to reach platform in navigation test of mice

Fig.1 Effect of baicalin on autophagic vacuoles in hippocampus of mice by electron microscopy.See Tab.1 for the treatment.Arrows show autophagosomes and late-autophagic compartments in hippocampus.

Tab.3 Effect of baicalin on time spent in target quad?rant in space exploration test of mice

2.3 黃芩苷對Aβ25-35誘導的小鼠海馬自噬水平的影響

透射電鏡觀察發(fā)現(xiàn)（圖1），模型組海馬組織出現(xiàn)雙層膜環(huán)繞線粒體形成的自噬體，黃芩苷50和100 mg·kg-1處理后，海馬CA1區(qū)內(nèi)線粒體腫脹變性，其周圍有空泡狀雙層膜結構，同時發(fā)現(xiàn)有雙層膜環(huán)繞形成的自噬泡，里面包含可見的線粒體輪廓和其他未被完全分解的細胞器碎片。提示黃芩苷激活AD小鼠腦內(nèi)的自噬水平。

2.4 黃芩苷對Aβ25-35誘導的小鼠海馬LC3和Beclin1蛋白的影響

Western蛋白印跡（圖2）檢測結果顯示，與假手術組相比，模型組LC3Ⅰ向LC3Ⅱ轉(zhuǎn)化增多（P＜0.05），Beclin1表達升高（P＜0.01）；與模型組相比，黃芩苷25 mg·kg-1處理對LC3Ⅱ/LC3Ⅰ的比值和Beclin1的表達無顯著影響，給予黃芩苷50和100 mg·kg-1處理后，LC3Ⅱ/LC3Ⅰ的比值逐漸升高（P＜0.01），Beclin1表達顯著上升（P＜0.05）。

Fig.2 Effect of baicalin on protein expression of micro?tubule associated protein 1 light chain 3（LC3）Ⅱ/LC3Ⅰ（A）and Beclin1（B）.See Tab.1 for the treatment.A2 and B2 were the semiquantitative results of A1 and B1.IA：integrated absorbance.x±s，n=6.＊P＜0.05，＊＊P＜0.01，compared with sham group；#P＜0.05，##P＜0.01，compared with model group.

3 討論

本研究發(fā)現(xiàn)，黃芩苷能改善小鼠學習及認知能力。實驗采用腦室注射Aβ25-35外源性給予毒性蛋白誘導自噬進一步觀察該作用是否與自噬被激活有關。Chen等［9］在淀粉前體蛋白/早老蛋白1模式小鼠上也觀察到自噬小體高于正常水平，而這種模式小鼠腦內(nèi)有明顯的Aβ沉積，這種病理性Aβ沉積誘導的自噬不足以有效清除毒性蛋白。黃芩苷治療后，小鼠海馬區(qū)自噬體數(shù)目明顯增多，提示黃芩苷誘導了AD小鼠海馬區(qū)自噬水平進一步升高，結合行為學結果分析，這一升高能夠有效清除沉積的淀粉肽，改善AD小鼠的學習記憶功能。LC3和Beclin1均作為自噬相關基因，參與了自噬體的形成［16］。其中，LC3是能靶向定位于自噬體膜，參與自噬的形成。當自體吞噬發(fā)生時，Ⅰ型LC3經(jīng)泛素樣加工修飾過程與自噬膜表面的磷脂酰乙醇胺結合，形成Ⅱ型LC3，Ⅱ型LC3蛋白結合并始終位于胞內(nèi)自噬體的膜上，其含量與自噬泡數(shù)量成正比［17］。Beclin1是酵母ATG6/vps30的同源物，與3-肌醇磷酸3激酶形成復合體參與自噬體形成。Beclin1作為自噬的重要正性調(diào)控元件，在淀粉樣前體蛋白的調(diào)控中發(fā)揮作用，其缺失導致AD模型小鼠淀粉肽沉積增多，加重AD的發(fā)生發(fā)展［18］。本研究發(fā)現(xiàn)，黃芩苷處理可升高自噬緊密相關的LC3和Beclin1蛋白表達，提示黃芩苷可能通過自噬的激活清除毒性蛋白，發(fā)揮神經(jīng)保護作用。

［1］Klionsky DJ，Emr SD.Autophagy as a regulated pathway of cellular degradation［J］.Science，2000，290（5497）：1717-1721.

［2］Mizushima N，Levine B，Cuervo AM，Klionsky DJ. Autophagy fights disease through cellular selfdigestion［J］.Nature，2008，451（7182）：1069-1075.

［3］Kirkitadze MD，Kowalska A.Molecularmecha?nisms initiating amyloid beta-fibril formation in Alzheimer′s disease［J］.Acta Biochim Pol，2005，52（2）：417-423.

［4］Martinez-Vicente M.Autophagy in neurodegenera?tive diseases：From pathogenic dysfunction to therapeutic modulation［J］.Semin Cell Dev Biol，2015，40：115-126.

［5］Hu Z，Yang B，Mo X，Xiao H.Mechanism and regulation of autophagy and its role in neuronal diseases［J］.Mol Neurobiol，2015，52（3）：1190-1209.

［6］Komatsu M，Waguri S，Chiba T，Murata S，Iwata JA，Ueno T，et al.Loss of autophagy in the centralnervous system causes neurodegeneration in mice［J］.Nature，2006，441（795）：880-884.

［7］Pickford F，Masliah E，Britschgi M，Lucin K，Narasimhan R，Jaeger PA，et al.The autophagyrelated protein beclin 1 shows reduced expression in early Alzheimer disease and regulates amyloid beta accumulation in mice［J］.J Clin Invest，2008，118（6）：2190-2199.

［8］Salminen A，Kaarniranta K，Kauppinen A，Ojala J，Haapasalo A，Soininen H，et al.Impaired autophagy and APP processing in Alzheimer′s disease：The potential role of Beclin 1 interactome［J］.Prog Neurobiol，2013，106-107：33-54.

［9］Chen X，Kondo K，Motoki K，Homma H，Okazawa H. Fasting activates macroautophagy in neurons of Alzheimer′s disease mouse model but is insuffi?cient to degrade amyloid-beta［J］.Sci Rep，2015，5：12115.

［10］Cheng F，Lu Y，Zhong X，Song W，Wang X，Sun X，et al.Baicalin's therapeutic time window of neuro?protection during transient focal cerebral ischemia and its antioxidative effects in vitro and in vivo［J］. EvidBasedComplementAlternatMed，2013，2013：120261.

［11］Zhang L，Xing D，Wang W，Wang R，Du L.Kinetic difference of baicalin in rat blood and cerebral nuclei after intravenous administration of Scutellariae Radix extract［J］.J Ethnopharmacol，2006，103（1）：120-125.

［12］Lu P，Mamiya T，Lu L，Mouri A，Ikejima T，Kim HC，et al. Xanthoceraside attenuates amyloid β peptide25-35-induced learning and memory impairmentsinmice［J］.Psychopharmacology（Berl），2012，219（1）：181-190.

［13］Yang R，Chen L，Wang H，Xu B，Tomimoto H，Chen L.Anti-amnesic effectofneurosteroid PREGS in Aβ25-35-injected mice through σ1 receptorand α7nAChR-mediated neuroprotection［J］.Neu?ropharmacology，2012，63（6）：1042-1050.

［14］Mckee AC，Carreras I，Hossain L，Ryu H，Klein WL，Oddo S，et al.Ibuprofen reduces Abeta，hyper?phosphorylated tau and memory deficits in Alzheimer mice［J］.Brain Res，2008，1207：225-236.

［15］Pyo JO，Yoo SM，Ahn HH，Nah J，Hong SH，Kam TI，et al.Overexpression of Atg5 in mice activates autophagy and extends lifespan［J］.Nat Commun，2013，4：2300.

［16］Klionsky DJ，Cuervo AM，Seglen PO.Methods for monitoring autophagy from yeast to human［J］. Autophagy，2007，3（3）：181-206.

［17］Klionsky DJ，Abdalla FC，Abeliovich H，Abraham RT，Acevedo-Arozena A，Adeli K，et al.Guidelines for the use and interpretation of assays for monitoring autophagy［J］.Autophagy，2012，8（4）：445-544.

［18］Jaeger PA，Pickford F，Sun CH，Lucin KM，Masliah E，Wyss-Coray T.Regulation of amyloid precursor protein processing by the Beclin 1 complex［J］. PLoS One，2010，5（6）：e11102.

Baicalin attenuates Aβ25-35induced learning and memory disorders in mice and its possible mechanism

XIAO Wan1,CAO Xiao-lu1,2,ZHANG Rong1,GAO Cheng-zhi1,DU Jing1,YIN Ting-zi1, ZHANG Ying1,HONG Xing1,HU Xia-min1,2,REN Bo3

(1.Department of Pharmacy,School of Medicine,2.Cardiovascular and Cerebral Vascular Drug Research Base,3.Department of Basic Medicine,School of Medicine,Wuhan University of Science and Technology,Wuhan 430065,China)

OBJECTIVETo observe the effect of baicalin on Aβ25-35induced learning and memory deficits and changes in autophagy-related genes in mice so as to explore the related mechanisms of Alzheimer disease(AD)treatment.METHODSC57 mice were administered with 3 μL Aβ25-353 mmol·L-1by intracerebroventricular injection to establish an AD model.Baicalin was given by intracerebroventricular injection at the dose of 25,50 and 100 mg·kg-1for 15 d,respectively.The total distance and the central grid residence time were measured in the open-field test.The escape latency and the time to reach the platform were monitored in the Morris water maze trial.The autophagic vacuoles in the hippocampus ofthe mice were observed by transmission electron microscopy before the protein expressions of microtu?bule-associated protein 1 light chain 3(LC3)and Beclin1 in brain tissue were analyzed by Western blot?ting assay.RESULTSIntracerebroventricular injection of Aβ25-35could reduce the total distance from (3984±321)cm to(2790±306)cm and extend central grid residence time from(3.6±1.2)s to(8.8±2.9)s in the open-field test.The escape latency of water maze also increased from(22.0±1.9)s to(38.8±2.2)s. Autophagic vacuoles or late autophagic vacuoles and increased Beclin1 and LC3 and protein level were observed in the hippocampus after Aβ25-35injection.Intraperitoneal injection of Baicalin 50 and 100 mg·kg-1for fifteen consecutive days extended the total distance in open-field test to(3705±337)cm and(3968±448)cm,respectively,while the central grid residence time was reduced to(5.6±1.8)s and (3.9±1.5)s,respectively.The total time taken to reach the platform in water maze test was reduced to(28.6± 1.9)s,(22.9±1.7)s.Mitochondrial swelling,vacuolar membrane structure or autophagic vacuoles were visible in the hippocampus.LC3 and Beclin1 protein expression was significantly up-regulated(P＜0.01).CONCLUSIONBaicalin shows protective effect against Aβ25-35induced learning and memory deficits, and this effect may be related to the activation of autophagy in the mouse hippocampus.

baicalin;Alzheimer disease;autophagy;β-amyloid peptide;learning disorder;memory disorder

s:HU Xia-min,E-mail:huxiaming@163.com,Tel:(027)68862810;REN Bo,E-mail:renb08@sina.com, Tel:(027)68893430

R285.5

A

1000-3002-（2017）01-0059-06

10.3867/j.issn.1000-3002.2017.01.007

2015-10-22接受日期：2016-06-08）

（本文編輯：喬 虹）

國家自然科學基金（31171327）

肖 彎，女，碩士研究生，Tel：（027）68893283，E-mail：xiaowanwust@sina.com；胡霞敏，女，博士，教授，主要從事新藥研發(fā)與神經(jīng)藥理學研究。

胡霞敏，E-mail：huxiaming@163.com，Tel：（027）68862810；任 波，E-mail：renbo8@sina.com，Tel：（027）68893430

Foundation item:The project supported by National Natural Science Foundation of China(31171327)