丙烯酰胺對雌性Wistar大鼠學(xué)習(xí)記憶和長時程增強(qiáng)的影響及其可能機(jī)制

張 蔓，孟 濤，趙文錦，李 斌

（中國疾病預(yù)防控制中心職業(yè)衛(wèi)生與中毒控制所，北京 100050）

丙烯酰胺對雌性Wistar大鼠學(xué)習(xí)記憶和長時程增強(qiáng)的影響及其可能機(jī)制

張 蔓，孟 濤，趙文錦，李 斌

（中國疾病預(yù)防控制中心職業(yè)衛(wèi)生與中毒控制所，北京 100050）

目的研究重復(fù)sc給予丙烯酰胺（AM）28 d后對學(xué)習(xí)記憶的影響及其可能的作用機(jī)制，以及單次sc給予AM后對大鼠海馬高頻刺激后群峰電位（PS）幅度改變的影響。方法雌性Wistar大鼠分別sc給予AM 10，20和40 mg·kg-1（給藥當(dāng)天計為第1天），連續(xù)給予28 d。每周記錄1次體質(zhì)量。于第22～第27天進(jìn)行Morris水迷宮實驗，評價AM對大鼠空間定位能力的影響；分別于第29和第30天進(jìn)行跳臺實驗，觀察5 min內(nèi)大鼠跳下平臺的次數(shù)以及首次跳下平臺的時間。取AM 40 mg·kg-1組大鼠海馬組織，Western蛋白印跡法檢測N-甲基-D-天冬氨酸受體（NR）2A及2B與Ⅱ型鈣調(diào)蛋白激酶（CaMKⅡ）的表達(dá)與磷酸化水平。另取Wistar雌性大鼠，單次sc給予AM 40 mg·kg-1，進(jìn)行長時程增強(qiáng)（LTP）實驗，觀察高頻刺激后PS的改變。結(jié)果與正常對照組相比，給予AM后，大鼠體質(zhì)量增長減緩（P＜0.01）。AM 20及40 mg·kg-1組大鼠找到平臺的時間顯著延長，但是對大鼠穿越平臺的次數(shù)無顯著影響。與實驗首日（第29天）相比，經(jīng)過電擊強(qiáng)化學(xué)習(xí)記憶，正常對照組大鼠為躲避電擊，次日（第30天）5 min內(nèi)跳下平臺的次數(shù)顯著減少（P＜0.01），且首次跳下平臺的時間明顯延長（P＜0.01），而AM 10，20和40 mg·kg-1組5 min內(nèi)的錯誤次數(shù)以及首次跳下平臺的時間無顯著改變。Western蛋白印跡結(jié)果顯示，與正常對照組相比，AM 40 mg·kg-1組大鼠海馬組織中NR2A及NR2B的表達(dá)與磷酸化水平顯著增加，且CaMKⅡ磷酸化水平顯著升高（P＜0.01）。LTP結(jié)果顯示，與正常對照組相比，單次sc給予AM 40 mg·kg-1顯著降低Wistar雌性大鼠海馬的PS幅度（P＜0.01），損傷了大鼠海馬部位的突觸可塑性。結(jié)論AM可能通過改變谷氨酸的含量，增加NR的表達(dá)與活性，導(dǎo)致鈣超載，引發(fā)神經(jīng)細(xì)胞死亡，從而使LTP的PS幅度下降，影響海馬神經(jīng)突觸的可塑性，最終影響中樞的學(xué)習(xí)記憶功能。

丙烯酰胺；跳臺實驗；Morris水迷宮；長時程增強(qiáng)

丙烯酰胺（acrylamide，AM）是一種水溶性不飽和酰胺，有著眾多商業(yè)應(yīng)用價值，廣泛應(yīng)用于化妝品、紙張、紡織品的生產(chǎn)過程，礦石開采，或作為土壤改良劑和絮凝劑應(yīng)用于廢水處理過程。AM水溶性強(qiáng)，可經(jīng)皮膚黏膜、呼吸道及消化道吸收，在工作場所中，皮膚暴露是最常見的中毒途徑。AM單體從20世紀(jì)50年代開始用于工業(yè)生產(chǎn)中，但很快發(fā)現(xiàn)其具有蓄積性神經(jīng)毒性，主要伴隨有共濟(jì)失調(diào)、肌無力、認(rèn)知損傷和（或）四肢麻痹等癥狀，學(xué)者們開始將其作為職業(yè)接觸中毒物質(zhì)進(jìn)行研究［1］。研究表明，AM中毒患者的學(xué)習(xí)記憶能力發(fā)生障礙［2-3］，而學(xué)習(xí)和記憶屬于大腦的高級活動之一，鑒于此，AM所致學(xué)習(xí)記憶的損傷尤其引起公共衛(wèi)生領(lǐng)域的關(guān)注。1973年，Bliss等［4］在麻醉兔海馬的穿通纖維與海馬齒狀回通路中首次觀察并描述了長時程增強(qiáng)（long-term potentiation，LTP）現(xiàn)象，并在清醒兔上得到了同樣的結(jié)果。學(xué)習(xí)記憶功能的障礙，會導(dǎo)致LTP的抑制，記錄LTP是研究學(xué)習(xí)記憶的有效手段之一。迄今為止，多數(shù)研究者著重觀察AM的神經(jīng)毒性，而對海馬LTP損傷及機(jī)制研究較少，尚無報道。課題組前期Zhang等［5］研究發(fā)現(xiàn)，雌性大鼠較雄性大鼠對AM的敏感性更高，為此后續(xù)課題組以雌性Wistar大鼠作為研究對象，建立AM神經(jīng)毒性模型。另外，現(xiàn)有研究大多都采用ig或ip途徑進(jìn)行AM暴露染毒，為更好地模擬工人的實際暴露方式，本研究采用sc暴露方式觀察AM對大鼠學(xué)習(xí)記憶能力以及LTP的影響，探討AM影響學(xué)習(xí)記憶及LTP的可能機(jī)制，進(jìn)一步闡述AM的神經(jīng)毒性機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試劑和儀器

AM（Amersco Lot#：0341），蒸餾水（屈臣氏）。用蒸餾水配制濃度為10，20及40 g·L-1的AM，經(jīng)資料查詢確定大鼠AM的經(jīng)皮染毒的半數(shù)致死量（LD50）為400 mg·kg-1，以此為依據(jù)，分別取LD50的1/10，1/20和1/40做為染毒劑量。烏拉坦（Sigma-Aldrich，Lot#U2500），30%H2O2溶液（北京化工廠，Lot#A1029005）。一抗：兔抗N-甲基-D-天冬氨酸受體（NR）2A單抗（abcam，ab133265），兔抗NR2A（pY1325）多抗（abcam，ab106590），兔抗NR2B多抗（abcam，ab65783），兔抗 NR2B（pY1472）多抗（abcam，ab3856），兔抗Ⅱ型鈣調(diào)蛋白激酶（calmodulin-dependent protein kinaseⅡ，CaMKⅡ）單抗（abcam，ab134041）以及兔抗CaMKⅡ（pT286）單抗（abcam，ab124880），兔抗甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）多抗（abcam，ab9485）。二抗：山羊抗兔IgG H&L（abcam，ab175781）。跳臺實驗儀器與長時程增強(qiáng)記錄儀由中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院藥物研究所王曉良老師提供，Morris水迷宮實驗儀器（北京碩林苑科技有限公司），VideoMot2視頻軌跡跟蹤分析系統(tǒng)（德國TSE公司）。

1.2 動物和分組

健康8周齡雌性Wistar大鼠，清潔級，體質(zhì)量180～220 g，共70只，由北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司提供，使用許可證號：SCXK（京）2012-0001，飼養(yǎng)于中國疾病預(yù)防控制中心實驗動物室，許可證號：SXYK（京）2009-0032。動物飼養(yǎng)環(huán)境室溫恒定（20～23℃），相對濕度40%～70%，通風(fēng)良好，自由飲水，攝食。大鼠飼料由北京科奧協(xié)力飼料有限公司提供，許可證號為SCXK（京）2009-0012。實驗動物以及實驗條件符合國家科學(xué)技術(shù)委員會的《實驗動物管理條例》。將60只大鼠隨機(jī)分為4組，分別為正常對照組，AM 10，20和40 mg·kg-1組。大鼠背部剃毛刀剪毛，暴露出一2 cm×2 cm的皮膚，在該處染毒，染毒體積為1 mL·kg-1，為統(tǒng)一染毒體積，AM 10， 20和40 mg·kg-1組分別給予濃度為0.14，0.28和0.56 mol·L-1的AM，正常對照組給予蒸餾水。如AM 20 mg·kg-1組體質(zhì)量為200 g大鼠，用移液槍經(jīng)背部皮膚給予200 μL，濃度為2.85 mol·L-1的AM溶液，并用槍頭側(cè)面涂抹至吸收。連續(xù)給予28 d，每周稱量體質(zhì)量，于染毒第22至第27天進(jìn)行Morris水迷宮實驗，并于染毒第29天和第30天進(jìn)行跳臺實驗。實驗結(jié)束后，從正常對照組及AM 40 mg·kg-1組隨機(jī)選取5只大鼠，提取海馬組織總蛋白，進(jìn)行Western蛋白印跡分析。

1.3 Morris水迷宮實驗

1.3.1 定位航行實驗

從第22天開始本實驗，每只大鼠每天訓(xùn)練2次（分別從兩個非平臺象限交叉點入池），每次1 min，連續(xù)訓(xùn)練5 d，記錄大鼠找到平臺的時間（逃避潛伏期），經(jīng)60 s未找到平臺者，將其引領(lǐng)至平臺，放置30 s，引導(dǎo)其學(xué)習(xí)。每次潛伏期作為學(xué)習(xí)成績，進(jìn)行統(tǒng)計分析。

（7）加強(qiáng)撫育措施，提高園林植物抗逆性。由于綠化工作一般都是在基礎(chǔ)建設(shè)完成后進(jìn)行，質(zhì)量良好的土壤在建設(shè)過程中被回填和運走，綠化的土壤是貧瘠土壤，并已被建筑垃圾污染，因此，在建筑設(shè)計時，必須將清除建筑污染規(guī)劃進(jìn)去。在建筑完成后，建筑垃圾由施工隊清除運走，禁止將其埋在地下或堆在綠地上，同時禁止在綠地排放污水、垃圾等。在栽植前充分考慮土壤肥力，貧瘠土壤種植綠肥，提高土壤肥力后再用于綠化；選擇樹種時最大限度地滿足適地適樹的要求，可通過除草、灌水、施肥、修剪、控水、控肥、掛設(shè)鳥箱、引進(jìn)有益的昆蟲和微生物等措施，提高林木生長勢，增加林木抗逆性。

1.3.2 空間探索實驗

定位航行實驗結(jié)束后（第27天），將平臺撤去，大鼠于相同位置入池，自由游泳60 s，記錄每只大鼠在60 s內(nèi)穿越平臺所在位置的次數(shù)作為衡量其空間學(xué)習(xí)記憶能力的指標(biāo)。

1.4 跳臺實驗

實驗裝置為一40 cm×20 cm×30 cm的被動回避條件反射箱，用不透明黑色塑料分隔成兩間，箱底有銅柵，間距為0.5 cm，可通30～36 V交流電。每一間左上角置一高4 cm，直徑4 cm的橡皮圓臺作為動物回避電擊的安全區(qū)。參照文獻(xiàn)［6］，實驗開始前，先將大鼠放置在橡皮圓臺上，適應(yīng)周圍環(huán)境3 min，然后通電，開始實驗，記錄大鼠首次跳下平臺的時間（逃避潛伏期）以及5 min內(nèi)跳下平臺的次數(shù)（錯誤次數(shù)）。大鼠受到電擊后，應(yīng)跳上平臺躲避電擊，在實驗首日，大多數(shù)動物可能再次跳下平臺，在受到電擊后又迅速返回平臺。在24 h后，直接通電進(jìn)行實驗，再次記錄潛伏期和錯誤次數(shù)。5 min內(nèi)未跳下平臺的，其潛伏期按5 min計。

1.5 Western蛋白印跡法檢測LTP信號通路相關(guān)蛋白的表達(dá)

海馬組織用生理鹽水洗滌后加入約500 μL預(yù)冷的組織裂解液，冰浴中勻漿，冰上裂解30 min，于4℃12 834×g離心3 min，取上清，使用Bradford法進(jìn)行定量，其余上清用來Western蛋白印跡檢測。配制10%的分離膠以及5%的濃縮膠，取20 μg總蛋白進(jìn)行電泳。轉(zhuǎn)膜后，使用脫脂牛奶進(jìn)行封閉。一抗4℃孵育過夜，二抗室溫孵育2 h，使用ECL發(fā)光試劑盒顯色，并使用LAS3000 Image Reader進(jìn)行讀取并拍照，所得條帶使用Quantity One軟件進(jìn)行分析，以目的蛋白與GAPDH內(nèi)參蛋白的積分吸光度比值表示蛋白的表達(dá)量。

1.6 群峰電位（population spike，PS）幅度的測定

另取10只Wistar雌性大鼠隨機(jī)分為2組，正常對照組以及AM 40 mg·kg-1組，單次sc染毒。大鼠ip給予烏拉坦（1.2 g·kg-1）麻醉后，將頭部水平固定于腦立體定位儀上，暴露其顱骨，去除骨膜后用3% H2O2溶液涂抹顱骨表面使其骨縫清晰。以前囟點、矢狀縫為基準(zhǔn)，用9號不銹鋼采血針頭于刺激、記錄電極、及參考電極上方分別鉆孔備用。用立體定位儀確定前囟坐標(biāo)，然后根據(jù)前囟坐標(biāo)確定海馬齒狀回（dentate gyrus，DG，前囟后3.8 mm，中縫旁開2.0 mm）及同側(cè)海馬穿通纖維通路（perforant path，PP，前囟后7.5 mm，中縫旁開4.2 mm）坐標(biāo)，將刺激電極下插到顱骨表面下3.0～3.5 mm，記錄電極下插到顱骨表面下2.8～3.5 mm。銀絲作為參比電極固定于顱骨或組織。以0.033 Hz頻率記錄基礎(chǔ)PS至少30 min后，施加高頻刺激（high-frequen?cy stimulation，HFS），具體參數(shù)為每串10個100 Hz的脈沖，共10串，串間隔300 ms。給予HFS刺激后，采用HFS前的記錄條件記錄PS波，發(fā)現(xiàn)可引起PS幅度的顯著升高（大于HFS前30%以上），并可維持＞60 min即誘發(fā)LTP成功。

1.7 統(tǒng)計學(xué)分析

使用GraphPad Prism 6.01軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計分析，實驗數(shù)據(jù)用表示。LTP實驗結(jié)果用two-way ANOVA進(jìn)行統(tǒng)計分析，跳臺實驗日間結(jié)果使用配對t檢驗進(jìn)行統(tǒng)計分析，跳臺實驗日內(nèi)結(jié)果及其他數(shù)據(jù)使用獨立樣本T檢驗進(jìn)行統(tǒng)計分析；P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 AM對雌性Wistar大鼠在Morris水迷宮中找到平臺時間的影響

在給予AM的第22～26天進(jìn)行定位航行實驗，從學(xué)習(xí)第2天起，隨著學(xué)習(xí)次數(shù)的增加，大鼠找到平臺所用時間（即潛伏期）逐漸縮短，這表明通過學(xué)習(xí)，大鼠可通過空間定位能力找到平臺所在位置。在學(xué)習(xí)的前4天，正常對照組與AM組找到平臺所用時間無顯著差異，但在學(xué)習(xí)的第5天，正常對照組大鼠找到平臺所用的時間明顯縮短（P＜0.01），而AM組大鼠找到平臺所花費的時間與學(xué)習(xí)前4 d相比無顯著差異（圖1）。AM 20和40 mg·kg-1組大鼠找到平臺所用時間明顯長于正常對照組大鼠（P＜0.05，P＜0.01），說明AM造成Wistar雌性大鼠在Morris水迷宮中的空間學(xué)習(xí)記憶能力損傷。

Fig.1Effect of acrylamide（AM）on escape latency of female Wistar rats in Morris water maze on 22nd-26thday.The rats were sc exposed to water or AM，5 d per week，4 weeks.n=12-15.＊P＜0.05，＊＊P＜0.01，compared with nor?mal control group.

2.2 AM對雌性Wistar大鼠在Morris水迷宮中穿越平臺所在區(qū)域次數(shù)的影響

在學(xué)習(xí)第6天（即染毒第27天）撤去象限內(nèi)的平臺，并觀察大鼠穿越原平臺所在區(qū)域的次數(shù)。AM 10，20及40 mg·kg-1組穿越平臺所在區(qū)域的次數(shù)比少于正常對照組，但結(jié)果無統(tǒng)計學(xué)差異（表1）。

Tab.1 Effect of AM on crossing frequency of female Wistar rats in Morris water maze on 27thday

2.3 AM對雌性Wistar大鼠在跳臺實驗中首次跳下平臺潛伏期的影響

由圖2可見，實驗首日，各組大鼠均頻繁跳下平臺，并在跳下后遭受電擊重新返回安全平臺，AM染毒組與正常對照組大鼠首次跳下平臺的時間（即潛伏期）較短，但無統(tǒng)計學(xué)差異；大鼠5 min內(nèi)跳下平臺的次數(shù)也無統(tǒng)計學(xué)差異。在經(jīng)過第1天的訓(xùn)練后，正常對照組大鼠學(xué)習(xí)并記憶了安全平臺的存在。因此，實驗次日，正常對照組大鼠首次跳下平臺的潛伏期明顯延長〔（34±17）svs（236±29）s〕，（P＜0.01）。但與正常對照組相比，AM 40 mg·kg-1組大鼠實驗次日的潛伏期與實驗首日相近，基本完全不能記憶實驗首日的電擊刺激，而AM 10和20 mg·kg-1組大鼠的潛伏期也延長（無統(tǒng)計學(xué)差異），也未能很好地記憶實驗首日被電擊的現(xiàn)實。

Fig.2 Effect of AM on escape latent period of female Wistar rats in step down test on 29th-30thday.See Fig.1 for the treatment.n=13-14.＊＊P＜0.01，compared with normal control group（1stday）by unpaired t test；##P＜0.01，compared with normal control group（2ndday）by independent t test.

2.4 AM對Wistar雌性大鼠5 min內(nèi)跳下平臺錯誤次數(shù)的影響

由圖3可見，正常對照組大鼠實驗次日跳下平臺錯誤次數(shù)較實驗首日明顯減少（2.4±0.3vs0.4± 0.1）（P＜0.01），說明其具有正常的學(xué)習(xí)記憶能力。AM 10，20和40 mg·kg-1組大鼠實驗次日的錯誤次數(shù)與實驗首日相近。

Fig.3 Effect of AM on error times of female Wistar rats in step down test on 29-30thday.See Fig.1 for the treat?ment.n=13-14.＊＊P＜0.01，compared with normal control group（1stday）by unpaired t test；##P＜0.01，compared with nor?mal control group（2ndday）by independent t test.

Fig.4 Effect of AM on expressions and phosphorylations of N-methyl-D-aspartate receptor（NR）and calmon?dulin-dependent protein kinaseⅡ（CaMKⅡ）proteins in hippocampus of female Wistar rats.See Fig.1 for the treatment.B was the semi-quantitative result of A.n=5.＊＊P＜0.01，compared with normal control group.

2.5 AM對雌性Wistar大鼠海馬LTP信號通路相關(guān)蛋白的表達(dá)及磷酸化水平的影響

圖4結(jié)果所示，與正常對照組相比，sc給予AM 40 mg·kg-128 d后，海馬組織內(nèi)的NR2A和NR2B的蛋白表達(dá)顯著增加（P＜0.01），并且其磷酸化水平亦明顯上調(diào)（P＜0.01），說明AM暴露可使大鼠海馬的NR2A及NR2B蛋白的表達(dá)及活性增加。其蛋白表達(dá)水平的比值（NR2A/2B）以及磷酸化NR2A與NR2B（p-NR2A/2B）的比值，雖較正常對照組有上升趨勢，但無顯著性差異。此外，CaMKⅡ的磷酸化水平（p-CaMK）以及磷酸化與總蛋白水平（p-Ca/CaMK）也明顯上調(diào)（P＜0.01），但其蛋白表達(dá)水平無顯著改變。

2.6 AM對雌性Wistar大鼠海馬齒狀回PS的影響

如圖5所示，HFS后，正常對照組PS幅度上升至（189±9）%，可成功誘發(fā)LTP；而AM 40 mg·kg-1組PS幅度僅上升至（149±5）%，顯著低于正常對照組，（P＜0.01）。表明單次sc給予AM 40 mg·kg-1對HFS誘導(dǎo)海馬PP-DG通路的LTP有抑制作用。

Fig.5 Effect of AM on population spike（PS）induced by high-frequency stimulation（HFS） in dentate gyrus of hippocampus in female Wistar rats.，n=3（in normal control group），and n=5（in AM 40 mg·kg-1group）.＊＊P＜0.01，compared with normal control group.

3 討論

研究表明，AM亞慢性染毒后可引起大鼠運動功能和學(xué)習(xí)記憶能力的降低，主要表現(xiàn)為負(fù)重游泳時間縮短、水迷宮實驗潛伏期延長以及游泳路程增加等［7］。Zheng等［8］研究表明，雄性Wistar大鼠ip給予AM 20及40 mg·kg-1，每周3次，連續(xù)給8周后，發(fā)現(xiàn)大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力明顯降低。另有研究表明，AM亞急性ig染毒可造成神經(jīng)功能損傷及小腦結(jié)構(gòu)病變［9］。與這些報道一致，本研究經(jīng)sc暴露AM 40 mg·kg-1導(dǎo)致Wistar雌性大鼠在Morris水迷宮中潛伏期明顯延長，以及跳臺實驗中錯誤次數(shù)顯著增加，提示AM可損傷大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力。此外，課題組前期研究結(jié)果表明，AM可能是通過抑制突觸素蛋白Ⅰ的表達(dá)，從而損傷大鼠突觸的可塑性［10］，而海馬LTP是學(xué)習(xí)與記憶有關(guān)的突觸可塑性的重要實驗?zāi)Ｐ?，是海馬對信息進(jìn)行編碼記憶的神經(jīng)生物學(xué)基礎(chǔ)。在體LTP實驗結(jié)果表明，單次sc給予AM 40 mg·kg-1可顯著抑制LTP的PS幅度，影響突觸可塑性，從而影響學(xué)習(xí)記憶，這一結(jié)果與同期行為學(xué)結(jié)果相印證。

已知與LTP產(chǎn)生十分相關(guān)的離子通道NR，是被眾多科研人員所認(rèn)同的觸發(fā)LTP的主要因子。本研究結(jié)果表明，AM使學(xué)習(xí)記憶能力受損，但sc給予AM 40 mg·kg-128 d后，不僅NR2A及NR2B的蛋白表達(dá)及磷酸化水平升高，CaMKⅡ的磷酸化水平也顯著高于正常對照組。研究表明，正常情況下，興奮性氨基酸谷氨酸的釋放，可激活NR，而NR的激活可進(jìn)一步引起鈣離子內(nèi)流，從而使CaMKⅡ活化，增加LTP的PS幅度，有助于學(xué)習(xí)記憶［11］。然而，谷氨酸持續(xù)大量釋放或含量明顯降低，均可直接或代償性地激活NR，進(jìn)而觸發(fā)CaMKⅡ的持續(xù)和過度活化，引發(fā)鈣超載，導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞的線粒體腫脹，并發(fā)生細(xì)胞凋亡，從而抑制LTP，使學(xué)習(xí)記憶能力下降［12-13］。盡管本研究未直接檢測AM暴露后海馬區(qū)谷氨酸的含量，但課題組前期結(jié)果表明，ip給予AM 30 mg·kg-1染毒21 d和AM 50 mg·kg-1染毒11 d后，可顯著降低大鼠大腦皮質(zhì)及小腦內(nèi)谷氨酸的含量［14］，另有報道稱，亞急性ig暴露AM 15和30 mg·kg-1顯著降低大鼠大腦皮質(zhì)和小腦勻漿內(nèi)谷氨酸的含量［7］。并且體外實驗也表明，AM可濃度依賴性地降低谷氨酸的釋放與攝?。?5］。由此推斷，本研究中AM導(dǎo)致的NR及CaMKⅡ的蛋白及磷酸化水平的顯著增加，可能和谷氨酸水平改變有關(guān)。但AM導(dǎo)致腦內(nèi)谷氨酸濃度的變化需要再次驗證，其影響谷氨酸水平的分子機(jī)制仍需進(jìn)一步研究。

綜上所述，AM可能通過改變腦內(nèi)谷氨酸的濃度，增加NR的表達(dá)與活性，同時持續(xù)活化CaMKⅡ，導(dǎo)致鈣超載，致使LTP的PS幅度下降，最終導(dǎo)致學(xué)習(xí)記憶能力的損害。

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Effect and mechanism of acrylamide on learning and memory and long-term potential in female Wistar rats

ZHANG Man,MENG Tao,ZHAO Wen-jin,LI Bin

(National Institute of Occuptional Health and Poison Control,Chinese Center for Disease Prevention and Control,Beijing 100050,China)

OBJECTIVETo investigate the accumulated effect and the mechanism of repeated sc administration of acrylamide(AM)on learning and memory after 28 d,and the effect of AM on the amplitude of population spike(PS)potential after a single sc administration of AM.METHODSFemale Wistar rats were sc adminstered with AM 10,20 and 40 mg·kg-1once a day for 28 d,and weighted every week.The ability of study and memory was evaluated,The morris water maze was used from 22ndto 28thday,followed by step down test on the 29thand 30thday.The escape latent period and the number of errors in those two days were recorded.Rats from normal control group and AM 40 mg·kg-1group were taken to have theirN-methyl-D-aspartate receptor(NR)and calmodulin-dependent protein kinaseⅡ (CaMKⅡ)protein levels detected by Western blotting.Additionally,some other female Wistar rats were sc administered with a single dose of AM 40 mg·kg-1,before the changes in PS potential amplitude induced by high frequency stimulation were recorded by long-term potential(LTP).RESULTSCompared with normal control group,the relative body mass gain was significantly decreased in AM exposure groups(P＜0.01).Additionally,the escape latency period was significantly increased in AM 20 and 40 mg·kg-1groups compared with normal control group,while the crossing frequency was not significantly different betmeen these four groups.Compared with the first day of step down test,the number of errors was significantly decreased(P＜0.01)and the escape latency period was significantly extended(P＜0.01)in normal control group on the 2ndday.However,the number of errors and the escape latency period did not significantly change in the AM groups between the two days.The results of Western blotting showed that the protein expressions and phosphorylation of NR2A and NR2B,as well as the phosphorylation of CaMKⅡin AM 40 mg·kg-1group were significantly increased compared with normal control group.LTP result showed that AM 40 mg·kg-1significantly inhibited the amplitude of PS potential after a single percutaneous administration.CONCLUSIONAM can inhibit the PS amplitude by inhibiting the release of glutamate,increasing the expressions and activities of NR,and inhibiting PS potential, thus affecting the hippocampal synaptic plasticity,and the function of learning and memory.

acrylamide;step down test;Morris water maze;long-term potential

LI Bin,E-mail:binli6511@hotmail.com,Tel:(010)83132391

R114

A

1000-3002-（2017）01-0087-07

10.3867/j.issn.1000-3002.2017.01.011

2016-07-07接受日期：2016-10-12）

（本文編輯：喬 虹）

國家自然科學(xué)基金項目（81273110）；中國疾病預(yù)防控制中心職業(yè)衛(wèi)生與中毒控制所青年科技基金資助項目（2014YS03）

張 蔓，女，醫(yī)學(xué)博士，助理研究員，主要從事化學(xué)品毒性及機(jī)制研究。

李 斌，E-mail：binli6511@hotmail.com，Tel：（010）83132391

Foundation item:The project supported by National Natural Science Foundation of China(81273110);and Youth Science Foundation of National Institute of Occupational Health and Poison Control of China CDC(2014YS03)