基于抗炎和氧化應激角度研究黃連解毒湯對動脈粥樣硬化大鼠作用機制＊

余蘭彬，陳 雨，徐國良，楊 樂，胡家麗，段江南，姜 麗＊＊

（1.江西中醫(yī)藥大學江西省中醫(yī)病因生物學重點實驗室 南昌 330004；2.江西省上饒市人民醫(yī)院彩超科 上饒 334000）

動脈粥樣硬化（atherosclerosis，AS）是導致缺血性心臟病和中風的主要因素，可導致嚴重的心腦血管事件[1]，也是人類發(fā)病率最高、危害最大的疾病之一，且隨著我國經濟水平的提高和人口老齡化的快速增長，發(fā)病率持續(xù)上升。研究表明[2-4]，血中低密度脂蛋白（LDL）或氧化低密度脂蛋白（Ox-LDL）增高、自由基（通常是由吸煙引起的）、高血糖及傳染性病原體（如肺炎衣原體、牙齦卟啉菌和皰疹病毒等）都被認為與AS的發(fā)病相關。

Ross教授[5]提出的炎癥損傷反應和氧化應激與AS的發(fā)病關系密切，在AS發(fā)生和發(fā)展中發(fā)揮了重要作用。氧化應激可加速低密度脂蛋白（LDL）在動脈內膜的沉積，使LDL成為氧化型LDL(ox-LDL），誘導單核細胞黏附、遷移進入動脈內膜，轉化成巨噬細胞。故氧化應激可通過多方面參與AS的發(fā)生與發(fā)展[6]。因此，抗炎和抗氧化方面的用藥成為這類疾病治療的新方向，為預防和治療AS及其相關性疾病的發(fā)生發(fā)展提供了新的思路與途徑。

本實驗從調節(jié)Ox-LDL、MCP-1、VCAM-1等炎癥指標及抗氧化作用入手，探討了黃連解毒湯干預治療AS的可能作用機制。

1 材料

1.1 動物

清潔級雄性SD大鼠，（體重200±20 g，合格證號SCXK(京)2006-0009，購自斯萊克景達實驗動物有限公司（湖南長沙）。飼養(yǎng)環(huán)境為排氣通風籠具內（EVC），保持室溫(22±2)℃，相對濕度（50±10）%。晝夜自然明暗交替，自由飲水，根據(jù)各組給予普通飼料和高脂飼料。

1.2 儀器

旋轉蒸發(fā)儀（瑞士Buchi公司）；全自動酶標檢測儀（北京中諾遠東科技有限公司）；HH-W600三用恒溫水箱（金壇市萬華實驗儀器廠）；KQ-300VDE型雙頻數(shù)控超聲清洗器（昆山市超聲儀器廠）；病理切片機（德國Leica RM 2016輪轉式切片機）、切片刀（日本羽毛R35一次性刀片）、組織攤烤片機（武漢俊杰JK-6生物組織攤烤片機）、載玻片及蓋玻片（江蘇世泰實驗器材有限公司）、顯微鏡（尼康E100型生物顯微鏡）、數(shù)碼單反相機（佳能550D）。

1.3 試藥與試劑

黃連（批號150507）、黃芩（批號150814）、黃柏（批號150130）、梔子（批號141210），上述藥材均購自江西江中中藥飲片有限公司；洛伐他丁（批號150501，購自江蘇大洋制藥有限公司）；高脂飼料和普通飼料（許可證號：SCXK（湘）2011-0003，購自北京科奧協(xié)力飼料有限公司）；維生素D3注射液（批號130140，購自上海通用藥業(yè)股份有限公司）；丙二醇檢測試劑盒、超氧化物氣化酶檢測試劑盒（許可證號：贛食藥監(jiān)械生產許20110023號，南京建成生物科技有限公司）、Ox-LDL、MCP-1及VCAM-1試劑盒（均購于武漢伊艾博科技有限公司）、包埋石蠟（國藥集團，批號69019361）、蘇木素（Sigma，批號H9627）、伊紅Y(水溶性)（國藥集團，批號71014544）、鹽酸（國藥集團，批號10011018）、二甲苯（國藥集團，批號10023418）、中性樹膠（國藥集團，批號10004160）。

2 方法

2.1 黃連解毒湯水煎劑的制備

參照文獻[7]，黃連、黃芩、黃柏、梔子按照原方配比3∶2∶2∶3，加6倍蒸餾水浸泡60 min。將浸泡后藥材用大火煮沸后改為文火煎煮30 min，過濾藥液，藥渣再加4倍水用文火煎煮20 min。將兩次藥液合并，用旋轉蒸發(fā)儀將藥液濃縮至0.5 g/生藥mL，得黃連解毒湯水煎劑，冷卻后分裝于4°C冰箱保存。

2.2 大鼠動脈粥樣硬化模型的建立

參照文獻[8,9]稍作修改，除空白對照組給予普通飼料外，模型組及給藥組均給予高脂飼料，共飼養(yǎng)8周。飼料配方為（0.2%丙基硫氧嘧啶、0.5%膽酸鈉、3%膽固醇、5%白糖、10%豬油、81.3%基礎飼料）。高脂飼料組大鼠在第一周的第3天，按60萬lU/Kg體重腹腔注射維生素D3，并于第2、4、6周的第3天，按20萬lU/Kg體重腹腔注射維生素D3。8周后取血及各組織樣本。

2.3 給藥方案

各組大鼠分別為正常對照組（A）、模型對照組（B）、陽性藥洛伐他汀組（C）、黃連解毒湯低、中、高劑量組（D、E、F）。從第3周開始，正常對照組和模型對照組分別灌胃等體積的生理鹽水，每天1次，直至造模結束。陽性對照組按5 mg·kg-1灌胃洛伐他汀，每天1次，直至造模結束；黃連解毒湯低、中、高劑量組等體積分別按1.5、3、6 g生藥/kg體重灌胃黃連解毒湯，每天1次，直至造模結束。

2.4 檢測項目和檢測方法

2.4.1 病理取材和染色

大鼠在末次給藥30 min后，用10%水合氯醛（4.5 mL·kg-1劑量）腹腔注射麻醉，固定于大鼠操作板上，剪開腹腔，用肝素鈉浸潤過的注射器于腹主動脈內取血后，小心剪下各組腹主動脈，切取4 μm厚切片，經脫蠟、浸水、染色和固封等步驟，作常規(guī)HE染色。取大鼠肝臟，勻漿后置-80℃冰箱保存。

2.4.2 指標檢測

大鼠肝勻漿中Ox-LDL、MCP-1、VCAM-1含量測定采用酶聯(lián)免疫法（ELISA法），MDA、SOD含量采用光度法測定，根據(jù)各指標試劑盒提供的試劑與實驗步驟進行操作，均采用全自動酶標檢測儀完成測定。

2.5 數(shù)據(jù)處理

各組炎癥及氧化相關指標數(shù)據(jù)采用Graphpad Prism軟件（version 6.0）進行處理及作圖。數(shù)據(jù)以平均值±標準差（±s）表示，各組數(shù)據(jù)的對比分析采用T檢驗，p≤0.05有統(tǒng)計學意義。

3 結果與分析

3.1 黃連解毒湯對動脈粥樣硬化大鼠腹主動脈病理學的改善作用

由圖1可知，正常組：血管壁結構清晰完整，平滑肌細胞排列整齊緊致，內膜光滑，無增生；模型組：血管結構異常，內膜增厚，表面粗糙，有多數(shù)的隆起，平滑肌細胞排列紊亂疏松，有斑塊的形成；陽性對照組：血管內膜基本無增厚，且較平滑，其平滑肌細胞排列較整齊架構清晰，泡沫細胞少；HJD低劑量組：血管內膜粗糙，褶皺程度與B組相比較輕，管壁增厚，平滑肌細胞有一定程度上的紊亂，較疏松，且有較大的凸起，總體較模型組平滑；HJD中劑量組：血管內壁平滑肌細胞排列較整齊致密，內膜無大幅度的起伏凹凸，內膜增厚較少；HJD高劑量組：平滑肌致密整齊，內膜光滑，局部見少量粗糙，有少量泡沫細胞，血管增厚較少。結果表明，洛伐他丁及HJD各劑量均能夠明顯改善AS的程度。

3.2 黃連解毒湯對動脈粥樣硬化大鼠肝勻漿Ox-LDL、MCP-1、VCAM-1表達的影響

由表1可知，與正常組比較，模型組MCP-1、Ox-LDL和VCAM-1含量均顯著升高；給藥后，陽性對照組和HJD低、中劑量組MCP-1、Ox-LDL和VCAM-1含量顯著下降；高劑量組MCP-1和VCAM-1含量顯著下降。

3.3 黃連解毒湯對動脈粥樣硬化大鼠肝勻漿MDA及SOD表達的影響

與正常對照組比較，造模后，SOD含量顯著下降，MDA含量顯著上升，給藥后，陽性組和HJD高劑量組SOD顯著上升（p＜0.05）；陽性組和HJD各劑量組MDA含量均顯著下降（p＜0.05）。結果見表2。

4 討論

中醫(yī)認為氣滯血瘀，脈失通利，則易于粥樣斑塊的形成[10]。濕熱之邪（無論是外感濕熱或是內傷雜病濕熱）長期蘊結不解亦可化為毒，致氣血運行失暢，瘀血內生，最終都可能導致AS，進而引發(fā)一系列心腦血管疾病如高血壓、冠心病、腦中風等并發(fā)癥。故清熱解毒燥濕法對防治AS尤為關鍵。

AS病變過程中單核巨噬細胞系統(tǒng)起著重要的作用。體內單核/巨噬細胞系統(tǒng)被激活后會釋放大量的炎癥因子，導致動脈內膜形態(tài)的異常及功能的紊亂，如脂質沉積于內膜下，造成血管組織嚴重受損。因此，單核細胞黏附并趨化遷入血管內膜是AS形成的早期事件[11]。而MCP-1是趨化單核細胞和淋巴細胞遷入血管內膜的主要細胞因子，可誘導單核細胞、血管內皮細胞等表達黏附分子，使各種炎性細胞向病變部位聚集，不斷進入斑塊組織中，誘發(fā)單核細胞和淋巴細胞對炎癥因子的刺激做出應答，促使免疫損傷不斷加重，粥樣斑塊不斷形成。由此，MCP-1被認為是潛在的可反映AS早期改變與預后的生化指標[12,13]。VCAM-1在內皮細胞、上皮細胞及巨噬細胞等細胞上表達，受到炎癥因子等刺激后，其表達水平明顯上升[14]。另有研究表明[15,16]，清熱解毒活血復方不僅能減少非致炎狀態(tài)下血管內皮細胞和中性粒細胞的黏附，還能減少致炎因子所誘導的這兩類細胞黏附作用的增強，從而穩(wěn)定粥樣斑塊，防止破裂，對動脈形態(tài)學和功能學的改變有保護作用。

圖1 HJD對動脈粥樣硬化大鼠腹主動脈病理學改善情況（×200）

表1 HJD對肝勻漿MCP-1、Ox-LDL和VCAM-1含量的影響(±s,n=6)

表1 HJD對肝勻漿MCP-1、Ox-LDL和VCAM-1含量的影響(±s,n=6)

注：與模型組（B組）比較，*p＜0.05，**p＜0.01。

VCAM-1水平118.07±3.49**166.34±14.47 115.51±15.39**136.25±12.7**120.47±14.57**107.26±6.32**組別正常對照組模型對照組陽性對照組HLJDT低劑量組HLJDT中劑量組HLJDT高劑量組MCP-1水平19.54±2.32**40.76±5.66 24.58±3.39**27.63±3.55**26.06±1.89**21.59±2.18**Ox-LDL水平28.72±3.71**36.53±2.59 29.29±4.75*32.07±3.58*31.08±4.65*33.71±5.45

表2 HJD對肝勻漿MDA、SOD含量的影響(±s,n=6)

表2 HJD對肝勻漿MDA、SOD含量的影響(±s,n=6)

注：與模型組（B組）比較，*p＜0.05，**p＜0.01。

肝勻漿MDA水平15.09±1.56**23.47±4.52 16.05±1.94**17.5±1.48*17.94±1.6*15.74±1.08**組別正常對照組模型對照組陽性對照組HLJDT低劑量組HLJDT中劑量組HLJDT高劑量組肝勻漿SOD水平192.11±1.49**186.22±2.18 192.99±2.21**183.2±6.87 191.05±9.13 193.15±5.19*

黃連解毒湯由黃連、黃柏、黃芩和梔子四種藥組成，是清熱燥濕解毒的經典名方。研究表明，本方可下調炎性細胞因子的表達[17]，并通過抵抗肺炎衣原體（Cpn）感染炎癥過度反應而發(fā)揮抑制AS進程的作用[18]。此外，氧化應激及其介導的脂質過氧化反應在AS的發(fā)生發(fā)展中起到重要作用。氧自由基與脂肪酸發(fā)生鏈式反應產生的脂質過氧化產物如MDA，能刺激血管平滑肌細胞的增殖，從而間接地反出細胞損傷的程度[19]。本實驗中，黃連解毒湯組MCP-1，VCAM-1表達明顯降低，提示黃連解毒湯可以抑制AS大鼠炎癥反應，從而干預AS斑塊的形成。有文獻報道[20，21]，其抑制黏附因子的表達可能是其消退AS斑塊的重要機制。陽性藥洛伐他丁及黃連解毒湯組均能通過提高SOD活性，顯著降低MDA和ox-LDL的生成，顯著地降低高脂刺激所致的AS形成過程中氧化應激反應。

黃連解毒湯作為清熱解毒燥濕的良方，能夠提高機體抗氧化能力，減少MDA的對動脈的損傷，防止各處動脈炎性因子和氧化損傷的侵害。本研究基于中醫(yī)清熱解毒燥濕防治AS角度，從抗炎抗氧化等指標入手，初步闡明黃連解毒湯抗AS的作用機制，但其更深入的機制還有待進一步研究。

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