勻漿法提取沙棗果總黃酮工藝研究

張圓圓 孟永斌 徐 蕾 賈 楠 孟慶煥 項(xiàng)鳳影 路 祺

(東北林業(yè)大學(xué)森林植物生態(tài)學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，哈爾濱 150040)

沙棗又稱七里香、香柳等(ElaeagnusangustifoliaL.)為胡頹子科(Elaeagnaceae)胡頹子屬(Elaeagnus)落葉喬木或小喬木。在國(guó)內(nèi)集中分布于西北部的各個(gè)省區(qū)以及內(nèi)蒙古的西部地區(qū)，大致分布在北緯34°以北。天然的沙棗林密集分布在瑪納斯河、甘肅疏勒河、新疆塔里木河、內(nèi)蒙古的額濟(jì)納河兩岸。沙棗渾身是寶，花可提芳香油或調(diào)香原料，樹液能提沙棗膠，木材細(xì)致堅(jiān)韌，可以做家具、農(nóng)具，沙棗根蘗性比較強(qiáng)，能夠保持水土，抵抗風(fēng)沙，改善土壤，調(diào)節(jié)氣侯等，用于防護(hù)林、用材林和風(fēng)景林等。沙棗果肉含有多糖、黃酮、蛋白質(zhì)和維生素等營(yíng)養(yǎng)成分，可生食或熟食，有些地區(qū)甚至將果肉打粉，然后摻在面粉內(nèi)代替主食，還可以用來(lái)釀酒和醋，或做果醬、糕點(diǎn)等食材[1]。沙棗黃酮可用于治療燒傷、腸炎腹瀉、脾胃虛弱、支氣管炎等，沙棗在新疆作為維吾爾藥(稱“吉嘎旦”)在民間已經(jīng)有悠久歷史[2]。

黃酮類化合物，也稱類黃酮[3]，是以黃酮(2-苯基色原酮)為母核而衍生的一類黃色色素。在植物體內(nèi)，有兩種存在形式，大多數(shù)與糖結(jié)合成苷類或碳糖基的結(jié)合態(tài)存在。由于其分子結(jié)構(gòu)中含未共用的孤對(duì)電子，又表現(xiàn)出堿性，所以可以和無(wú)機(jī)酸生成鹽，但是不穩(wěn)定，遇水之后迅速分解[4]。黃酮類化合物的主要生理活性有[5～8]：(1)心血管系統(tǒng)活性；(2)抗菌及抗病毒活性；(3)抗腫瘤活性；(4)抗氧化自由基活性；(5)抗炎、鎮(zhèn)痛活性；(6)保肝活性；(7)其他功能，除上述功能外，黃酮類物質(zhì)還對(duì)平滑肌的解痙，支氣管的松弛、機(jī)體免疫力提高等有一定作用。

勻漿提取是指組織通過(guò)加入萃取溶劑進(jìn)行組織勻漿或磨漿，以提取組織中有效成分的一種提取方法。此方法不但縮短了提取時(shí)間，而且提取效率高、操作步驟簡(jiǎn)便。近年來(lái)廣泛應(yīng)用于中草藥有效成分的提取和食品加工等領(lǐng)域，效果良好[9]，如勻漿法提取虎杖中虎杖苷和白藜蘆醇[10]、勻漿法提取石斛中多糖[11]、勻漿提取刺五加主要酚苷及苷元[12]、勻漿提取銀杏葉原花青素工藝等[13]。本研采用勻漿法提取沙棗果總黃酮，通過(guò)單因素實(shí)驗(yàn)和正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)化沙棗果總黃酮提取工藝條件，通過(guò)本研究將為沙棗果的開發(fā)利用提供理論依據(jù)，也為沙棗果保健品的開發(fā)提供數(shù)據(jù)支持。

1 實(shí)驗(yàn)材料與儀器

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

沙棗果由阿拉善盟悅禾科技生態(tài)有限責(zé)任公司提供；氫氧化鈉、亞硝酸鈉、無(wú)水乙醇、硝酸鋁均為分析純，購(gòu)于科密歐化學(xué)試劑廠；蘆丁(標(biāo)準(zhǔn)品)購(gòu)于Sigma公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)儀器

HL-60型烘箱，購(gòu)于上海躍進(jìn)醫(yī)療器械有限公司；RE-52A型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，DK-98-I型水浴鍋，購(gòu)于泰特化工設(shè)備有限公司；勻漿萃取裝置，購(gòu)于飛利浦公司；3K-30型離心機(jī)，購(gòu)于Sigma公司；美國(guó)Nicolet公司的MAGNA-IR560 E.S.P型紅外光譜儀；BS124S電子天平，購(gòu)于北京賽多利斯有限公司。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 樣品準(zhǔn)備和總黃酮的提取

沙棗果凍干后，進(jìn)行果肉與種子分離，得沙棗果肉。

勻漿法基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)條件為：取沙棗果10 g，按比例加入一定濃度的乙醇溶液，室溫下勻漿提取，反應(yīng)結(jié)束后立即3 000 r·min-1離心10 min，倒出上清液檢測(cè)黃酮得率。在其它實(shí)驗(yàn)條件固定情況下，分別探討乙醇濃度、料液比、反應(yīng)時(shí)間、反應(yīng)次數(shù)，4個(gè)因素對(duì)勻漿法沙棗果總黃酮得率的影響，并通過(guò)正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)化沙棗果總黃酮提取工藝條件。

2.2 總黃酮檢測(cè)方法

總黃酮檢測(cè)方法如下：取0.5 mL稀釋一定倍數(shù)后樣品置于比色管中，依次分別加入0.5 mL 5%(w/v)亞硝酸鈉，0.5 mL 10%(w/v)硝酸鋁，4.0 mL 4%氫氧化鈉和4.5 mL 95%乙醇，混勻以后，避光靜止15 min，510 nm波長(zhǎng)下檢定吸光值。以蘆丁為標(biāo)準(zhǔn)品制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，5 mg蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品加5 mL甲醇溶解。配置濃度1、0.5、0.25、0.125、0.062 5 mg·mL-1的標(biāo)準(zhǔn)溶液，空白樣品是以蒸餾水代替樣品。通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算黃酮濃度，從而計(jì)算黃酮得率，公式如下：

(1)

式中：y代表總黃酮得率(%)；c表示樣品濃度(mg·mL-1)；v表示測(cè)定時(shí)提取液總體積(mL)；m表示樣品質(zhì)量(mg)[14～19]。

2.3 紅外光譜分析

將2.0 mg試樣與200 mg溴化鉀(KBr)混勻，經(jīng)瑪瑙研缽研磨后壓片，采用美國(guó)Nicolet公司的MAGNA-IR560 E.S.P型紅外光譜儀(掃描范圍4 000～400 cm-1)進(jìn)行紅外光譜測(cè)定[20]。

2.4 掃描電鏡分析

利用掃描電鏡進(jìn)行微觀形貌觀察，所采用的儀器為MX2600FE型環(huán)境掃描電子顯微鏡。用導(dǎo)電膠將烘干、粉碎過(guò)80目篩的樣品固定在樣品平臺(tái)上，噴金，用掃描電子顯微鏡觀察樣品的表面形態(tài)。

3 結(jié)果與分析

3.1 單因素實(shí)驗(yàn)部分

3.1.1 乙醇濃度對(duì)沙棗果總黃酮提取的影響

勻漿法實(shí)驗(yàn)條件為：在料液比1∶20 g·mL-1、勻漿提取時(shí)間3 min、室溫不變的條件下，分別選取40%、55%、70%、85%、100%，5個(gè)乙醇濃度，探討乙醇濃度對(duì)勻漿法提取沙棗果總黃酮的影響；傳統(tǒng)水浴法實(shí)驗(yàn)條件為：在料液比1∶20 g·mL-1、提取溫度70℃、提取時(shí)間30 min不變的條件下，探討乙醇濃度對(duì)傳統(tǒng)水浴提取沙棗果總黃酮的影響。

當(dāng)乙醇濃度低于55%時(shí)，隨著乙醇濃度的逐漸增加沙棗果總黃酮得率也隨之逐漸增加；當(dāng)乙醇濃度等于55%時(shí)，沙棗果總黃酮得率最高；當(dāng)乙醇濃度高于55%時(shí)，隨著乙醇濃度的增加沙棗果總黃酮得率逐漸降低(圖1)。這是因?yàn)樵谝欢ǖ姆秶鷥?nèi)，隨著乙醇濃度的增加，沙棗果總黃酮類化合物的溶解度逐漸升高；當(dāng)乙醇濃度超一定范圍時(shí)，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)的蛋白凝固，黃酮?jiǎng)t不易溶出，所以選擇55%乙醇作為勻漿法提取沙棗果總黃酮最佳濃度。

圖1 乙醇濃度對(duì)沙棗果總黃酮得率的影響Fig.1 Effect of ethanol concentration on Elaeagnus angustifolia fruit flavonoids extraction

在圖1中也可以看出，傳統(tǒng)的水浴提取方法在乙醇濃度相同的情況下，總黃酮的得率均遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于其勻漿法。因此在乙醇濃度相同的情況下，勻漿法更適合提取總黃酮。

3.1.2 料液比對(duì)沙棗果總黃酮提取的影響

勻漿法實(shí)驗(yàn)條件為：在55%乙醇濃度、勻漿提取時(shí)間3 min、室溫不變條件下，探討料液比對(duì)勻漿提取沙棗果總黃酮的影響，分別選取以下幾個(gè)料液比，1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50 g·mL-1；傳統(tǒng)水浴法實(shí)驗(yàn)條件為：在70%乙醇濃度、提取溫度70℃、提取時(shí)間30 min不變的條件下，探討料液比對(duì)傳統(tǒng)水浴提取沙棗果總黃酮的影響。

由圖2可知，當(dāng)料液比小于1∶30 g·mL-1時(shí)，隨著料液比的逐漸增加沙棗果總黃酮得率也跟著逐漸增加；當(dāng)料液比等于1∶30 g·mL-1時(shí)，沙棗果總黃酮得率最高；當(dāng)料液比大于1∶30 g·mL-1時(shí)，隨著料液比的增加沙棗果總黃酮得率逐漸趨于穩(wěn)定。這是因?yàn)樵谝欢ǖ姆秶鷥?nèi)，隨著料液比的不斷增加，反應(yīng)溶劑所占比例逐漸增加，使得沙棗果粉與提取溶劑的接觸率大大增加，導(dǎo)致沙棗果總黃酮類化合物的溶解量逐漸增加；而當(dāng)料液比超出一定范圍時(shí)，沙棗果中黃酮類化合物提取較為充分，而繼續(xù)增加料液比，沙棗果總黃酮類化合物的得率趨于穩(wěn)定。所以選擇1∶30 g·mL-1作為勻漿提取沙棗果總黃酮最佳料液比。

圖2 料液比對(duì)沙棗果總黃酮得率的影響Fig.2 Effect of the ratio of material to liquid on E.angustifolia fruit flavonoids extraction

雖然在傳統(tǒng)的水浴提取方法，總黃酮的得率隨著料液比的增大而增加，但是其增加幅度遠(yuǎn)低于同樣條件下勻漿法提取的總黃酮得率。因此在料液比相同的情況下選擇勻漿法提取總黃酮更為經(jīng)濟(jì)實(shí)用。

3.1.3 勻漿提取時(shí)間對(duì)沙棗果總黃酮提取的影響

勻漿法實(shí)驗(yàn)條件為：在料液比1∶30 g·mL-1、提取溫度室溫、55%乙醇不變的情況下，分別選取以下幾個(gè)提取時(shí)間1、3、5、7、9 min，來(lái)探討提取時(shí)間對(duì)沙棗果總黃酮得率的影響；傳統(tǒng)水浴法實(shí)驗(yàn)條件為：在料液比1∶30 g·mL-1、70%乙醇濃度、提取溫度70℃不變的條件下，探討提取時(shí)間對(duì)傳統(tǒng)水浴提取沙棗果總黃酮的影響。

圖3 勻漿提取時(shí)間對(duì)沙棗果總黃酮得率的影響Fig.3 Effect of time on E.angustifolia fruit flavonoids extraction

由圖3可知，隨著勻漿時(shí)間的延長(zhǎng)，沙棗果總黃酮得率逐漸增加；當(dāng)勻漿時(shí)間等于5 min時(shí)，沙棗果總黃酮得率最高；當(dāng)勻漿時(shí)間大于5 min時(shí)，隨著勻漿提取的進(jìn)一步延長(zhǎng)，沙棗果總黃酮得率基本趨于穩(wěn)定。這是因?yàn)槌渥愕膭驖{時(shí)間有利于沙棗果總黃酮的溶解與溶出，隨著勻漿提取時(shí)間進(jìn)一步延長(zhǎng)，沙棗果總黃酮得率逐漸增加，但過(guò)長(zhǎng)的勻漿時(shí)間，提取物中雜質(zhì)物質(zhì)不斷溶出，阻礙黃酮類化合物溶出，導(dǎo)致黃酮得率也不會(huì)明顯增加。因此，勻漿法提取沙棗果總黃酮的適宜提取時(shí)間為5 min。

傳統(tǒng)的水浴提取方法黃酮得率先隨著水浴時(shí)間的延長(zhǎng)而增加，后趨于平穩(wěn)，其得率最高為4.43%?？梢悦黠@看出勻漿法提取總黃酮時(shí)，不僅表現(xiàn)在時(shí)間上大大縮短，而且得率也遠(yuǎn)高于傳統(tǒng)水浴提取方法。

3.1.4 勻漿提取次數(shù)對(duì)沙棗果總黃酮提取的影響

勻漿法實(shí)驗(yàn)條件為：在料液比1∶30 g·mL-1、提取溫度室溫、乙醇濃度55%、提取時(shí)間為5 min不變的情況下，來(lái)探討提取次數(shù)對(duì)沙棗果總黃酮提取的影響，分別選取以下幾個(gè)提取次數(shù)，即1、2、3、4、5、6次；傳統(tǒng)水浴法實(shí)驗(yàn)條件為：在料液比1∶30 g·mL-1、70%乙醇濃度、提取溫度70℃、提取時(shí)間30 min不變的條件下，探討提取次數(shù)對(duì)傳統(tǒng)水浴提取沙棗果總黃酮的影響。

由圖4可知，隨著提取次數(shù)的不斷增加，沙棗果總黃酮得率不斷降低，當(dāng)提取次數(shù)超過(guò)3次時(shí)，沙棗果總黃酮總得率隨著提取次數(shù)繼續(xù)增加，基本保持恒定。勻漿法第一次提取沙棗果總黃酮占沙棗果總黃酮的63.48%，第二次提取沙棗果總黃酮占沙棗果總黃酮15.89%，前兩次提取的沙棗果總黃酮占沙棗果總黃酮的80%左右，即勻漿法提取二次后，沙棗果總黃酮已經(jīng)基本提取充分，考慮到后期溶劑回收成本等問(wèn)題，確定勻漿法提取沙棗果總黃酮的適宜提取次數(shù)為2次。

圖4 提取次數(shù)對(duì)沙棗果總黃酮得率的影響Fig.4 Effect of extraction times on E.angustifolia fruit flavonoids extraction

傳統(tǒng)的水浴提取方法與勻漿法相比，勻漿法得率高于水浴法，勻漿法提取總黃酮更完全一些。優(yōu)于傳統(tǒng)水浴法，即不需要太多的提取次數(shù)便可達(dá)到高的提取率。

綜上所述，勻漿法提取沙棗果總黃酮不僅減少了乙醇的用量，縮短了提取時(shí)間，降低料液比，減少了提取次數(shù)，而且提取總黃酮得率也遠(yuǎn)高于傳統(tǒng)水浴提取法。因此，勻漿法是更適合于沙棗果總黃酮的提取方法。

3.2 正交實(shí)驗(yàn)部分

通過(guò)前面單因素實(shí)驗(yàn)確定采用勻漿法提取沙棗果總黃酮，以沙棗果總黃酮得率為勻漿法提取沙棗果總黃酮能評(píng)價(jià)指標(biāo)，對(duì)乙醇濃度、勻漿時(shí)間和料液比進(jìn)行L9(3)4正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，探討并優(yōu)化勻漿法提取工藝條件(表1～2)。

表1 L9(3)4正交實(shí)驗(yàn)因素和水平Table 1 The factors and levels of the orthogonal array design L9(3)4

通過(guò)直觀分析，根據(jù)R值，可知最優(yōu)實(shí)驗(yàn)條件為：A2B3C2，即乙醇濃度55%，勻漿料液比1∶30 g·mL-1，勻漿時(shí)間5 min。從各因素極差值可知，A>B>C，對(duì)勻漿法沙棗果總黃酮得率影響的主次順序?yàn)椋阂掖紳舛?勻漿時(shí)間>勻漿料液比。

表2 L9(3)4正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 2 Orthogonal array design L9(3)4 and experimental results

勻漿法提取沙棗果總黃酮的方差分析數(shù)據(jù)見表3。

查表有F0.01(2,2)=99.00；F0.05(2,2)=19.00；F0.1(2,2)=9.00。

當(dāng)F>F0.01，有高度顯著影響；當(dāng)F0.01>F>F0.05，有顯著影響；當(dāng)F0.05>F>F0.1時(shí)，有一定的影響；當(dāng)F

計(jì)算結(jié)果表明，因素A的FA，為F0.05>FA>F0.1；因素B的FB，為FB

表3 勻漿法沙棗果總黃酮得率方差分析Table 3 The variance analysis of E.angustifolia fruit flavonoid yield with homogenization

通過(guò)正交實(shí)驗(yàn)得到勻漿法提取沙棗果總黃酮的優(yōu)化工藝條件：乙醇濃度55%，勻漿料液比1∶30 g·mL-1，勻漿時(shí)間5 min，提取次數(shù)2次，重復(fù)性驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明得率穩(wěn)定，重復(fù)性較好，沙棗果總黃酮總得率為6.57%。綜上所述，勻漿法相較于水浴法，操作更加簡(jiǎn)便、快捷，作用效果更強(qiáng)，得率更高，所以沙棗果的提取選擇勻漿法更佳，本研究對(duì)勻漿法提取的沙棗果總黃酮提取物及剩余物進(jìn)行進(jìn)一步結(jié)構(gòu)表征。

3.3 紅外光譜分析

圖5 沙棗果勻漿提取物紅外光譜圖Fig.5 FTIR of the extraction of E.angustifolia fruit with homogenate method

3.4 掃描電鏡分析

圖6分別是沙棗果原料、沙棗果勻漿提取剩余物的SEM圖片?？梢悦黠@看出沙棗果渣(A)表面相對(duì)光滑沒(méi)有明顯裂痕，表面有淀粉粒存在。經(jīng)過(guò)勻漿處理的沙棗果渣提取剩余物(B)表面有小裂痕和組織縫隙，并且表面的淀粉粒也大量消失，這說(shuō)明勻漿處理對(duì)沙棗果的組織結(jié)構(gòu)影響較大，其原因是勻漿將樣品進(jìn)行機(jī)械粉碎，導(dǎo)致沙棗果的組織結(jié)構(gòu)被破壞，大大增加了乙醇與提取物的接觸面積[21～23]。

圖6 沙棗果原原料(A)、沙棗果勻漿提取剩余物(B)的掃描電鏡圖Fig.6 SEM of E.angustifolia fruit pomace(A) and the extraction residues of E.angustifolia fruit with homogenate method(B)

4 結(jié)論

通過(guò)傳統(tǒng)水浴提取法和勻漿提取法單因素對(duì)比實(shí)驗(yàn)，可以明顯看出勻漿法提取沙棗果總黃酮具有乙醇用量少，提取時(shí)間短，提取次數(shù)少等優(yōu)點(diǎn)，總黃酮得率也遠(yuǎn)高于傳統(tǒng)水浴提取法。通過(guò)L9(3)4正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，優(yōu)化勻漿法提取工藝條件，其最優(yōu)工藝為：乙醇濃度55%，勻漿料液比1∶30 g·mL-1，勻漿時(shí)間5 min，室溫，勻漿提取次數(shù)2次，勻漿提取沙棗果黃酮類化合物的最大得率為6.57%。從實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以看出勻漿法提取沙棗果黃酮得率高，操作更加簡(jiǎn)便、快捷。本研究對(duì)勻漿法提取的沙棗果黃酮提取物及剩余物進(jìn)行結(jié)構(gòu)表征。通過(guò)對(duì)提取物進(jìn)行紅外表征可以看出，勻漿法提取的沙棗果提取物中含有黃酮類化合物的特征峰；通過(guò)對(duì)剩余物進(jìn)行SEM結(jié)構(gòu)表征可以看出，勻漿法對(duì)樣品的機(jī)械作用強(qiáng)烈。