超聲輔助提高長(zhǎng)春花毛狀根誘導(dǎo)效率及轉(zhuǎn)基因毛狀根構(gòu)建

賈姍姍 王燕燕 于 放

(大連工業(yè)大學(xué)生物工程學(xué)院，大連 116034)

長(zhǎng)春花(Catharanthusroseus)為夾竹桃科(Apocynaceae)長(zhǎng)春花屬(Catharanthus)多年生草本植物，是一種重要的藥用植物，長(zhǎng)春花體內(nèi)含有長(zhǎng)春堿(Vinblastine)等70多種萜類吲哚生物堿(Terpenoid Indole Alkaloids，TIAs)，這些生物堿具有廣泛的生理活性和重要的藥用價(jià)值，是國(guó)際上應(yīng)用最多的抗癌植物藥源之一[1]。但是，這些次生代謝產(chǎn)物在長(zhǎng)春花中含量很低，化學(xué)結(jié)構(gòu)復(fù)雜，很難化學(xué)合成且合成成本很高。目前獲得這些珍貴次生化合物的主要途徑仍是從長(zhǎng)春花中提取，但其含量有限，加之環(huán)境及地理等因素的影響很難大量獲得，不能滿足醫(yī)藥市場(chǎng)需要。隨著細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)的建立，研究者們?cè)诩?xì)胞株間產(chǎn)量的差異、培養(yǎng)條件的優(yōu)化等方面做了大量工作[2]，但仍存在一些諸如細(xì)胞株的穩(wěn)定性、離體培養(yǎng)生物堿合成能力的變化等問(wèn)題，致使產(chǎn)量及產(chǎn)率不甚理想。研究表明，雙子葉植物及少量單子葉植物易受發(fā)根農(nóng)桿菌(Agrobacteriumrhizogenes)的感染，之后產(chǎn)生轉(zhuǎn)化的不定根，稱其為毛狀根(Hairy root)[3]。這種根起源于單個(gè)細(xì)胞，代謝及遺傳特性皆穩(wěn)定，且生長(zhǎng)迅速，次生代謝品種多，適于發(fā)酵培養(yǎng)，毛狀根的這些特性有利于次生代謝物生產(chǎn)的優(yōu)化。轉(zhuǎn)基因毛狀根的培養(yǎng)是20世紀(jì)80年代后期發(fā)展起來(lái)的一項(xiàng)基因工程和細(xì)胞工程相結(jié)合的技術(shù)，在植物次生代謝物方面具有廣闊的應(yīng)用前景[3]。由于發(fā)根農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化植物產(chǎn)生的毛狀根來(lái)源于同一個(gè)植物細(xì)胞，因此毛狀根的每一個(gè)細(xì)胞都是轉(zhuǎn)化的。影響毛狀根誘導(dǎo)效率的因素有很多，目前研究者主要集中于發(fā)根農(nóng)桿菌種類、外植體部位、侵染時(shí)間等條件優(yōu)化，但對(duì)于誘導(dǎo)效率的提高作用有限，因此，提高毛狀根誘導(dǎo)效率并獲得最優(yōu)的誘導(dǎo)方案?jìng)涫荜P(guān)注[4]。研究發(fā)現(xiàn)超聲輔助能夠有效的提高植物轉(zhuǎn)化效率，包括提高魚(yú)腥草中GUS基因的瞬時(shí)表達(dá)率[5]、大豆未成熟胚外源基因的轉(zhuǎn)化率[6]、苦豆子的子葉和下胚軸外植體轉(zhuǎn)化率[7]、金釵石斛轉(zhuǎn)化率[8]以及長(zhǎng)春花遺傳轉(zhuǎn)化率[9]等等，但應(yīng)用其誘導(dǎo)毛狀根等方面報(bào)道較少。

本文在幾種常見(jiàn)影響毛狀根轉(zhuǎn)化效率因素篩選基礎(chǔ)上，主要研究超聲輔助對(duì)長(zhǎng)春花毛狀根誘導(dǎo)效率的影響，最終確定一種最優(yōu)的誘導(dǎo)方案。并進(jìn)一步利用發(fā)根農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化含有GUS基因質(zhì)粒，成功構(gòu)建轉(zhuǎn)基因毛狀根，為以后代謝調(diào)控途徑相關(guān)基因的功能研究以及長(zhǎng)春花中次生代謝產(chǎn)物合成的調(diào)控奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 材料

長(zhǎng)春花種子、長(zhǎng)春花盆栽苗以及長(zhǎng)春花無(wú)菌苗均為本實(shí)驗(yàn)室提供；發(fā)根農(nóng)桿菌ATCCA15834與C58C1菌種均為實(shí)驗(yàn)室保藏。

1.1.2 試劑

1/2 MS培養(yǎng)基、MS培養(yǎng)基、1/2 B5培養(yǎng)基、B5培養(yǎng)基、LB培養(yǎng)基均購(gòu)自于海博生物公司；Infiltration buffer：MgCl210 mmol·L-1，20 mmol·L-1MES，200 μmol·L-1Acetosyringone(乙酰丁香酮)；利福平(Rif)與慶大霉素(Gen)購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司；次氯酸鈉、酒精等其他試劑均為分析級(jí)別。

1.2 方法

1.2.1 長(zhǎng)春花無(wú)菌苗的培養(yǎng)

對(duì)長(zhǎng)春花種子進(jìn)行外植體消毒處理，長(zhǎng)春花種子首先用流水沖洗2 h左右，然后浸入75%酒精中15 s，用無(wú)菌水沖洗3次，再用次氯酸鈉浸泡8～10 min，接著用無(wú)菌水沖洗3次，將滅菌后的種子置于1/2 MS固體培養(yǎng)基上平板上，待種子萌發(fā)后轉(zhuǎn)移到MS固體培養(yǎng)基的三角瓶中繼續(xù)萌發(fā)生長(zhǎng)，在光強(qiáng)為3 000 lx，光照16 h，25℃條件下培養(yǎng)，幼苗的下胚軸、幼苗子葉、莖、葉片可用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 毛狀根誘導(dǎo)條件優(yōu)化

首先對(duì)實(shí)驗(yàn)室保藏的農(nóng)桿菌進(jìn)行涂板活化，并進(jìn)行侵染，參照[9]。分別采用兩種不同農(nóng)桿菌(ATCC15834與C58C1)、4種不同外植體材料(下胚軸、莖、子葉、葉片)、兩種不同的侵染用懸浮試劑(infiltration buffer，1/2 MS液體培養(yǎng)基)、4種不同的培養(yǎng)基(1/2 MS培養(yǎng)基、MS培養(yǎng)劑、B5培養(yǎng)劑、1/2 B5培養(yǎng)基)誘導(dǎo)毛狀根，2種不同的侵染用懸浮試劑(Infiltration buffer、1/2 MS液體培養(yǎng)基)，每種變量進(jìn)行3次平行實(shí)驗(yàn)，根據(jù)誘導(dǎo)效率確定優(yōu)化后的誘導(dǎo)方案。然后在得出的最優(yōu)條件下，再利用不同的超聲輔助時(shí)間來(lái)誘導(dǎo)毛狀根，最終確定誘導(dǎo)方案。

1.2.3 農(nóng)桿菌的轉(zhuǎn)化與鑒定

將保藏的發(fā)根農(nóng)桿菌C58C1用LB固體培養(yǎng)基劃線活化，挑取單克隆進(jìn)行初步擴(kuò)大培養(yǎng)，當(dāng)菌液OD600在0.6～0.8時(shí)取200 μL培養(yǎng)液接種于50 mL液體LB培養(yǎng)基中進(jìn)一步擴(kuò)培，當(dāng)OD600～0.8時(shí)收集菌體，將質(zhì)粒pBI121GD和pBI121分別用凍融法轉(zhuǎn)化至發(fā)根農(nóng)桿菌C58C1中，用引物GUS-F：5′-ATCGTGGTGATTGATGAAACTG-3′和GUS-R：5′-ATCGCTGATGGTATCGGTGT-3′進(jìn)行菌落PCR鑒定陽(yáng)性單克隆。PCR反應(yīng)條件如下：94℃，5 min；94℃，30 s，50℃，30 s，72℃，15 s，35個(gè)循環(huán)；72℃，5 min，4℃保溫，進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行分析。

1.2.4轉(zhuǎn)基因毛狀根的PCR檢測(cè)以及GUS染色檢測(cè)

利用TRNzol法提取轉(zhuǎn)基因毛狀根RNA，對(duì)樣本RNA進(jìn)行DNA消化后將其反轉(zhuǎn)錄為cDNA。以消化后的RNA為模板，以GUS-F/R為引物進(jìn)行PCR，檢測(cè)是否有DNA污染；隨后以反轉(zhuǎn)錄的cDNA為模板，并以GUS-F/R為引物進(jìn)行PCR檢測(cè)。GUS基因引物、PCR反應(yīng)體系及程序同1.2.3。

將轉(zhuǎn)化成功的毛狀根進(jìn)行GUS染色分析。將毛狀根完全浸沒(méi)在事先預(yù)冷的90%丙酮溶液中，室溫放置20 min。再用預(yù)冷的去離子水沖洗，將丙酮溶液完全沖洗干凈，再將毛狀根浸沒(méi)于GUS染色劑(磷酸鈉0.05 mol·L-1pH7.2,曲拉通-100 0.2%,亞鐵氰化鉀0.005 mol·L-1,鐵氰化鉀0.005 mol·L-1,X-Gluc 0.002 mol·L-1)，并在37℃下過(guò)夜。隨后將GUS染色處理的毛狀根別置于濃度為25%、50%和70%的乙醇中脫色30 min，最后用95%的乙醇洗脫。

1.2.5 數(shù)據(jù)的處理與分析

本論文中每組實(shí)驗(yàn)有3組平行數(shù)據(jù)，采用多重比較字母標(biāo)記法標(biāo)記長(zhǎng)春花毛狀根誘導(dǎo)率，a表示其中誘導(dǎo)率最高的條件，以結(jié)果a為標(biāo)準(zhǔn)，差異不顯著的仍標(biāo)記為a,差異顯著的標(biāo)記為b，再以結(jié)果b為標(biāo)準(zhǔn)，進(jìn)行數(shù)據(jù)的比較分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 毛狀根誘導(dǎo)條件初步優(yōu)化

為了研究不同的條件對(duì)毛狀根誘導(dǎo)效果的影響，從而選擇最優(yōu)的毛狀根誘導(dǎo)方案，我們對(duì)侵染過(guò)程中的各種因素如發(fā)根農(nóng)桿菌的菌株、不同的外植體部位、不同的培養(yǎng)基、不同的預(yù)培養(yǎng)時(shí)間、不同的侵染方法，采用控制變量的方法進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。結(jié)果如表1顯示，在以長(zhǎng)春花的盆栽苗葉片為外植體材料，經(jīng)外植體消毒后預(yù)培養(yǎng)兩天后，用infiltration buffer作為侵染用懸浮液侵染，誘導(dǎo)的繼代培養(yǎng)基均采用1/2 MS培養(yǎng)基條件下[5]，發(fā)根農(nóng)桿菌C58C1的誘導(dǎo)率比ATCC15834的誘導(dǎo)率高，可能是因?yàn)镃58C1中的Ri質(zhì)粒T-DNA整合到長(zhǎng)春花植物基因組過(guò)程中整合效率高；而以C58C1為侵染用菌株，采用植物的不同部位為外植體材料，其他條件不變的情況下，發(fā)現(xiàn)不同外植體部位對(duì)于毛狀根的誘導(dǎo)效率有較為明顯的影響，其中長(zhǎng)春花無(wú)菌苗葉片部位的誘導(dǎo)率最高：28.4%；在其他條件不變的情況下，采用不同的培養(yǎng)基進(jìn)行誘導(dǎo)繼代時(shí)，其中1/2 MS誘導(dǎo)培養(yǎng)基的誘導(dǎo)效率最高，為26.6%，產(chǎn)生這樣的結(jié)果原因可能是其他培養(yǎng)基無(wú)機(jī)鹽濃度過(guò)高，從而使毛狀根的誘導(dǎo)效率下降。

表1 不同條件對(duì)毛狀根誘導(dǎo)效果的影響Table 1 Effect of different conditions on hairy root induction

有研究表明不同的預(yù)培養(yǎng)時(shí)間也會(huì)對(duì)毛狀根的轉(zhuǎn)化效率產(chǎn)生一定的影響[10]，因此我們對(duì)不同預(yù)培養(yǎng)時(shí)間對(duì)毛狀根誘導(dǎo)效率也進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)研究，以C58C1為侵染用菌株，以無(wú)菌苗的葉片為外植體材料，1/2 MS培養(yǎng)基為誘導(dǎo)培養(yǎng)基，經(jīng)不同預(yù)培養(yǎng)時(shí)間后，使用infiltration buffer侵染，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：當(dāng)預(yù)培養(yǎng)時(shí)間為2天時(shí)，長(zhǎng)春花毛狀根的誘導(dǎo)效率最高，時(shí)間長(zhǎng)或短都會(huì)使其誘導(dǎo)率下降，推測(cè)可能是由于外植體在侵染前經(jīng)過(guò)一定時(shí)間的預(yù)培養(yǎng)，有助于外植體產(chǎn)生傷口在愈合的過(guò)程中形成并釋放乙酰丁香酮等物質(zhì)，這些物質(zhì)進(jìn)一步作為誘導(dǎo)發(fā)根農(nóng)桿菌識(shí)別的信號(hào)分子，在長(zhǎng)春花毛狀根的誘導(dǎo)過(guò)程中發(fā)揮一定的功能，進(jìn)而提高誘導(dǎo)效率。研究發(fā)現(xiàn)，不同誘導(dǎo)方法對(duì)誘導(dǎo)效率的影響也很大，主要有使用infiltration buffer處理以及直接用液體1/2 MS液體培養(yǎng)直接處理兩種方案[11～15]，本實(shí)驗(yàn)以C58C1為侵染用菌株，以無(wú)菌苗的葉片為外植體材料，1/2 MS培養(yǎng)為誘導(dǎo)培養(yǎng)基，預(yù)培養(yǎng)時(shí)間2天，分別使用infiltration buffer和液體1/2 MS培養(yǎng)基侵染，結(jié)果如表1所示，infiltration buffer侵染效率要比使用1/2 MS液體培養(yǎng)基高出14%左右。由于infiltration buffer中含有適量的乙酰丁香酮，乙酰丁香酮是一種酚類化合物，可誘發(fā)發(fā)根農(nóng)桿菌內(nèi)Ri質(zhì)粒DNA上Vir基因的活化和高效表達(dá)，促進(jìn)農(nóng)桿菌T-DNA向宿主細(xì)胞核轉(zhuǎn)移，從而提高遺傳轉(zhuǎn)化效率[16]。乙酰丁香酮廣泛應(yīng)用于雙子葉植物和單子葉植物的發(fā)根農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化[16]。

2.2 超聲輔助提高毛狀根誘導(dǎo)效率

在上述優(yōu)化條件的基礎(chǔ)上，本實(shí)驗(yàn)引入了變量即超聲輔助，分析在固定超聲功率為40 kHz，不同超聲時(shí)間對(duì)發(fā)根農(nóng)桿菌侵染效果的影響，結(jié)果表明如表2所示，超聲輔助時(shí)間為5 s時(shí)對(duì)毛狀根轉(zhuǎn)化效率提升最為顯著，很大程度上提高了毛狀根的誘導(dǎo)率，尤其與上述優(yōu)化條件相比約提高了10%。

同時(shí)我們發(fā)現(xiàn)超聲時(shí)間過(guò)久會(huì)使植物細(xì)胞死亡，無(wú)法進(jìn)行轉(zhuǎn)化。產(chǎn)生這樣的結(jié)果可能是因?yàn)殚L(zhǎng)春花外植體在受到發(fā)根農(nóng)桿菌侵染的同時(shí)受到超聲的影響，表面形成細(xì)小的創(chuàng)傷口，發(fā)根農(nóng)桿菌T-DNA更容易向宿主細(xì)胞核轉(zhuǎn)移，而超聲時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，創(chuàng)傷口較大反而導(dǎo)致了細(xì)胞的死亡。

表2 超聲輔助對(duì)毛狀根誘導(dǎo)效果的影響Table 2 Effect of ultrasound on hairy root induction(%)

2.3 最優(yōu)誘導(dǎo)方案誘導(dǎo)毛狀根

根據(jù)上述誘導(dǎo)條件的比較，最終我們以C58C1為侵染用菌株，以無(wú)菌苗的葉片為外植體材料，1/2 MS培養(yǎng)基為誘導(dǎo)培養(yǎng)基，預(yù)培養(yǎng)時(shí)間為2 d，使用infiltration buffer為侵染用懸浮液侵染，超聲輔助時(shí)間為5 s，進(jìn)行侵染并且共培養(yǎng)時(shí)間為2 d來(lái)獲得長(zhǎng)春花毛狀根。并且在2 d后繼代到含有300 mg·L-1特美汀的1/2 MS固體培養(yǎng)基上，再經(jīng)不斷繼代除菌后長(zhǎng)勢(shì)良好，隨后換到含有300 mg·L-1特美汀的液體1/2 MS培養(yǎng)基中搖瓶培養(yǎng)。約一周更換一次液體培養(yǎng)基，最終成功獲得乳白色、較為濃密的、無(wú)向地性并且多分枝的毛狀根，與長(zhǎng)春花的正常跟相比較，由發(fā)根農(nóng)桿菌誘導(dǎo)出的毛狀根更密集，分支更多，生長(zhǎng)更加迅速。結(jié)果如圖1所示，其中圖1a為誘導(dǎo)1周后，長(zhǎng)春花葉片傷口處長(zhǎng)出數(shù)條毛狀根；圖1b為誘導(dǎo)2周后長(zhǎng)春花毛狀根，將作為外植體的葉片切除后，毛狀根生長(zhǎng)更為密集，圖1c為誘導(dǎo)5周后轉(zhuǎn)到液體培養(yǎng)基后毛狀根，轉(zhuǎn)入液體培養(yǎng)基后，毛狀根生長(zhǎng)迅速，圖1d為誘導(dǎo)7周后長(zhǎng)春花毛狀根，聚而成簇，多分枝，多條無(wú)向地性毛狀根。

圖1 最優(yōu)方案誘導(dǎo)毛狀根 A.侵染1周后長(zhǎng)春花毛狀根；B.侵染2周后長(zhǎng)春花毛狀根；C.侵染5周后轉(zhuǎn)入到液體培養(yǎng)基中的長(zhǎng)春花毛狀根；D.侵染7周后轉(zhuǎn)入到液體培養(yǎng)基中的長(zhǎng)春花毛狀根Fig.1 The optimal solution to induce hairy root A. Hairy roots of Catharanthus roseus 1 week after infection; B. Hairy roots of Catharanthus roseus 2 weeks after infection; C. 5 weeks after infection into liquid medium Prunella hairy roots; D. Catharanthus roseus hairy roots transferred to liquid medium after 7 weeks of infection

2.4 表達(dá)載體的農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化鑒定

將質(zhì)粒pBI121GD和pBI121分別轉(zhuǎn)化至發(fā)根農(nóng)桿菌C58C1中，以單菌落為模板進(jìn)行菌落PCR鑒定，結(jié)果如圖2所示，其中圖2為引物GUS-F和GUS-R鑒定結(jié)果，泳道1是表達(dá)載體pBI121GD單克隆鑒定結(jié)果，泳道2是表達(dá)載體pBI121單克隆鑒定結(jié)果，目的片段大小約330 bp。該實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，發(fā)根農(nóng)桿菌C58C1成功轉(zhuǎn)化。

2.5 轉(zhuǎn)化后毛狀根中GUS基因檢測(cè)

利用TRNzol法提取轉(zhuǎn)基因毛狀根RNA，將提取后的RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA。然后以反轉(zhuǎn)錄的cDNA為模板，并以GUS-F/R為引物進(jìn)行PCR檢測(cè)。GUS基因引物、PCR反應(yīng)體系及程序同1.2.3。實(shí)驗(yàn)如圖3所示，結(jié)果表明我們成功通過(guò)對(duì)發(fā)根農(nóng)桿菌進(jìn)行轉(zhuǎn)化，將GUS基因片段整合到長(zhǎng)春花毛狀根的基因組中。

3 討論

本文在幾種常見(jiàn)影響毛狀根轉(zhuǎn)化效率因素篩選基礎(chǔ)上，采用超聲輔助顯著提高長(zhǎng)春花毛狀根誘導(dǎo)效率，最終確定一種最優(yōu)的誘導(dǎo)方案。并進(jìn)一步利用發(fā)根農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化含有GUS基因質(zhì)粒，成功構(gòu)建轉(zhuǎn)基因毛狀根。

發(fā)根農(nóng)桿菌可侵染450多種高等植物，誘發(fā)植物T-DNA整合到寄主核基因組中,它本身的Ri質(zhì)粒可將其上的生成大量毛狀根[12]。本文中在相同的轉(zhuǎn)化條件下采用了發(fā)根農(nóng)桿菌C58C1與ATCC15834，發(fā)現(xiàn)發(fā)根農(nóng)桿菌C58C1與發(fā)根農(nóng)桿菌ATCC15834轉(zhuǎn)化效率相比較高，然而在黃偉劍[10]等對(duì)于發(fā)根農(nóng)桿菌誘導(dǎo)廣藿香毛狀根的研究中，發(fā)根農(nóng)桿菌C58C1對(duì)于廣藿香毛狀根的誘導(dǎo)效率沒(méi)有發(fā)根農(nóng)桿菌ATCC5834高，可能是由于不同菌種對(duì)于不同植物的誘導(dǎo)生根能力不同導(dǎo)致，對(duì)于長(zhǎng)春花毛狀根的誘導(dǎo)C58C1則更為有效。

圖2 發(fā)根農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化的PCR鑒定 1.載體pBI121GD單克隆鑒定結(jié)果；2.載體pBI121單克隆鑒定結(jié)果；M. DL5000 DNA marker(TaKaRa)Fig.2 Identification of positive Agrobacterium transformants 1. Identification of positive colonies containing pBI121GD vector by PCR; 2. Identification of positive colonies containing pBI121 vector by PCR; M. DL5000 DNA marker(TaKaRa)

圖3 農(nóng)桿菌侵染后的毛狀根GUS染色 A. pBI121與pBIGD轉(zhuǎn)化后毛狀根RNA提取結(jié)果；B. GUS-R，GUS-F引物PCR檢測(cè)結(jié)果；C. pBI121轉(zhuǎn)化毛狀根GUS染色結(jié)果；D. pBIGD轉(zhuǎn)化毛狀根GUS染色結(jié)果Fig.3 GUS staining of C.acuminate Transform hairy root after infection A. pBI121 and pBIGD hairy root RNA extraction results; B. GUS-R, GUS-F primers PCR test results; C. pBI121 hairy root transformation GUS staining results; D. pBIGD transformed hairy root GUS staining results

外植體的選擇是能否誘導(dǎo)出毛狀根的關(guān)鍵，目前采用的外植體主要有幼苗、子葉、子葉節(jié)、葉基部、胚軸、下胚軸、真葉、野生的子葉、幼莖、莖段，采用不同的外植體部位誘導(dǎo)毛狀根對(duì)于誘導(dǎo)效率具有很大的影響，孫敏[17～21]等研究發(fā)現(xiàn)用根及葉片作為外植體誘導(dǎo)效率較高，長(zhǎng)春花真根與毛狀根差異不是非常明顯，為了便于統(tǒng)計(jì)進(jìn)而保證結(jié)果準(zhǔn)確性，因此本論文并未采用長(zhǎng)春花的根作為侵染用外植體；同時(shí)長(zhǎng)春花無(wú)菌苗的葉片在相同轉(zhuǎn)化條件下轉(zhuǎn)化效率最高，因此，毛狀根誘導(dǎo)所用外植體必須是分化能力很強(qiáng)的部位，并且不能太脆弱，這與我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果相一致。

培養(yǎng)基復(fù)雜的成分能夠影響毛狀根的生長(zhǎng)狀態(tài)，同時(shí)也會(huì)對(duì)長(zhǎng)春花毛狀根的誘導(dǎo)效率產(chǎn)生影響[1]。目前研究者們主要采用1/2 MS、MS、1/2 B5、B5這4種培養(yǎng)基進(jìn)行誘導(dǎo)轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)[22～25]，本實(shí)驗(yàn)中我們比較了相同的誘導(dǎo)的條件下長(zhǎng)春花毛狀根誘導(dǎo)效率，結(jié)果顯示1/2 MS作為誘導(dǎo)培養(yǎng)基時(shí)，其各種無(wú)機(jī)鹽的濃度對(duì)于發(fā)根農(nóng)桿菌侵染最適合，誘導(dǎo)效率較其他培養(yǎng)基較高。

超聲可以增加外植體的創(chuàng)傷面積，因此超聲輔助一直被廣泛應(yīng)用于各種植物的轉(zhuǎn)化效率。以發(fā)根農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化苦豆的子葉和下胚軸外植體，超聲波(功率120 W,震蕩頻率50 kHz)處理25 min時(shí)，轉(zhuǎn)化率達(dá)到最高峰(子葉為83.7%,下胚軸為39.1%)[7]。也有研究人員采用恒定頻率的超聲波儀處理植物15 min后再用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法侵染植物和在農(nóng)桿菌侵染過(guò)程中輔助以超聲波處理10 s兩種轉(zhuǎn)化法GUS基因的瞬時(shí)表達(dá)率最高[9]。80～100 W超聲波處理5 min的金釵石斛的類原球莖體，在轉(zhuǎn)化后GUS染色每100 mg鮮重材料上的藍(lán)色斑點(diǎn)數(shù)由常規(guī)方法處理的0～0.54提高到6.05～7.90[8]。在長(zhǎng)春花中，超聲波輔助可以有效提高其遺傳轉(zhuǎn)化率，超聲處理后的外植體經(jīng)GUS染色后顏色比未做超聲處理的顏色要深很多，一般我們認(rèn)為顏色較深的具有較高的轉(zhuǎn)化率[9]。也有報(bào)道指出超聲輔助有助于提高苦豆子毛狀根的遺傳轉(zhuǎn)化效率[7]，但對(duì)于毛狀根的誘導(dǎo)，尤其是長(zhǎng)春花毛狀根誘導(dǎo)方面尚未報(bào)道。

本文中，我們利用超聲輔助可以在其他條件優(yōu)化后提高約10%誘導(dǎo)率，并利用這一技術(shù)成功誘導(dǎo)出乳白色、較為濃密的、無(wú)向地性并且多分枝的毛狀根。進(jìn)而應(yīng)用此誘導(dǎo)方案成功構(gòu)建轉(zhuǎn)GUS基因的毛狀根，在后續(xù)研究中可將待研究基因連接表達(dá)載體，構(gòu)建含目的基因的質(zhì)粒，然后通過(guò)轉(zhuǎn)化發(fā)根農(nóng)桿菌，最終將目的基因轉(zhuǎn)入到長(zhǎng)春花的毛狀根中。

4 結(jié)論

本研究采用5 s超聲輔助顯著提高了以C58C1為侵染菌株，以無(wú)菌苗的葉片為外植體材料，1/2 MS培養(yǎng)基為誘導(dǎo)培養(yǎng)基，預(yù)培養(yǎng)時(shí)間為2天，使用共培養(yǎng)緩沖液侵染條件下長(zhǎng)春花毛狀根誘導(dǎo)率，成功獲得乳白色、較為濃密的、無(wú)向地性并且多分枝的毛狀根；并應(yīng)用此誘導(dǎo)方案成功構(gòu)建轉(zhuǎn)GUS基因的毛狀根。本文為長(zhǎng)春花生物堿合成其相關(guān)基因功能鑒定以及調(diào)控機(jī)制的解析奠定了基礎(chǔ)。