不同因子對藥用植物毛狀根產量和次生代謝產物積累影響的研究進展△

孫晶，楊洪一，隋春

(1.東北林業(yè)大學 生命科學院，黑龍江 哈爾濱 150040； 2.中國醫(yī)學科學院 藥用植物研究所，北京 100193； 3.中草藥物質基礎與資源利用教育部重點實驗室，北京 100193)

綜 述

不同因子對藥用植物毛狀根產量和次生代謝產物積累影響的研究進展△

孫晶1，2，楊洪一1，隋春2，3*

(1.東北林業(yè)大學 生命科學院，黑龍江 哈爾濱 150040； 2.中國醫(yī)學科學院 藥用植物研究所，北京 100193； 3.中草藥物質基礎與資源利用教育部重點實驗室，北京 100193)

以根為藥用部位的藥材占中藥材種類的30%左右。毛狀根培養(yǎng)體系是藥用植物生產次生代謝產物的新途徑、新方法。影響毛狀根生長及其次生代謝物形成的因素有很多，如：物理因素、化學因素、前體物的添加、誘導子等。通過優(yōu)化毛狀根培養(yǎng)條件及培養(yǎng)基配比，可提高毛狀根和次生代謝產物產量。本文就藥用植物毛狀根誘導形成及大規(guī)模生產中的根產量和次生代謝產物積累的影響因素與作用機理做一綜述，為相關研究和應用提供參考。

毛狀根，次生代謝產物，因素

毛狀根培養(yǎng)是20世紀80年代發(fā)展起來的基因工程和細胞工程相結合的一項技術，通過將發(fā)根農桿菌Agrobacteriumrhizogenes中Ri質粒含有的T-DNA整合到植物細胞的DNA上，誘導植物細胞產生毛狀根[1]。相對于常規(guī)細胞培養(yǎng)和組織培養(yǎng)，毛狀根培養(yǎng)系統具有生長快速、無需外源植物激素、合成次生代謝物質能力強而且穩(wěn)定等優(yōu)點。通過優(yōu)化培養(yǎng)條件，毛狀根甚至可以合成比原植物中高出數倍的活性物質，或原植物不合成的活性成分[2]。由于毛狀根體系在生物量增加和生物有效成分積累方面表現出獨特的優(yōu)越性，使得利用毛狀根生產植物次生代謝產物具有很大潛力。因此人們對其應用于藥物生產進行了探究和開發(fā)。目前，應用毛狀根培養(yǎng)技術已成功誘導出南非醉茄WithaniaSomnifera[3]、丹參Salviamiltiorrhiza[4-5]、短小蛇根草Ophiorrhizapumila[6]、人參Panaxginseng[7]、青蒿Artemisiaannua[8]和黃芩Scutellariabaicalensis[9]等26科96種[10]藥用植物的毛狀根。人參皂苷、黃酮類[11-12]等也已通過毛狀根培養(yǎng)體系得以工業(yè)化生產應用。

實現藥用植物毛狀根大規(guī)模培養(yǎng)的前提是低成本、高產出。通常需要在一定培養(yǎng)時間內盡可能提高有效藥用成分積累量。藥用成分積累量包括兩方面內容：一是要提高毛狀根的產量，二是要增加目標產物含量比率。目前藥用廣泛的植物代謝產物包括生物堿類、皂苷類、黃酮類、醌類，以及蛋白質和一些重要的生物酶[2,13-14]，其中既有初生代謝產物，又有次生代謝產物。通常毛狀根產量的提高與目標產物含量比率的提高存在矛盾。有效權衡多方面影響因素才能達到理想的效果[15]。毛狀根誘導條件研究進展有多篇綜述報道[3,7,10,13,16]，本文對影響毛狀根生長及其次生代謝物積累的各種理化因子以及毛狀根大規(guī)模生產條件的研究做一綜述。

1 物理因素

影響毛狀根生長與次生代謝物質積累的物理因素有：光照、pH、溶氧狀況、接種量和溫度等[17]，藥用植物毛狀根工業(yè)化生產中，有效調控這些物理因素，針對不同植物摸索出具體培養(yǎng)條件，對毛狀根生產意義重大，可以有效增加毛狀根生物量和次生代謝產物積累量[18]。

1.1 光照

光照對誘導分化通常是必要的，可激活某些酶的活性以及光誘導的葉綠體或葉綠體代謝產物的存在[15]。光照對毛狀根的生長和次級代謝產物積累具有一定的作用效果。楊睿等[19]研究表明，光強為3 500 lx，光周期為18 h·d-1時，雪蓮毛狀根生長量達到12.4 g·L-1(DW)，是全黑暗時的2.1倍，是全光照時的1.2倍；總黃酮合成量為1 179 mg·L-1，比全黑暗時提高了160%，比全光照時提高了20%。然而，對不同的植物而言，選擇吸收的光源和光照強度等是需要摸索的條件，不同的植物存在一定差異。如歐紹云等[17]研究表明，黑暗培養(yǎng)的南美蟛蜞菊毛狀根顏色淺白，根較纖細，分枝較多，而光照培養(yǎng)的毛狀根顏色呈墨綠色，明顯老化，根較粗壯但分枝較少，并且暗培養(yǎng)毛狀根的生物量增長倍數約是光照培養(yǎng)的1.3倍，表明暗培養(yǎng)對南美蟛蜞菊毛狀根的生長較為有利。Yu等[20]通過研究人參毛狀根在暗培養(yǎng)、熒光燈光、金屬鹵素燈光、紅光、藍光、紅加藍發(fā)光二極管燈光等6種光照條件下毛狀根生長和人參皂苷積累的情況，表明：人參毛狀根液體培養(yǎng)分為兩個階段，第一階段毛狀根在黑暗條件下培養(yǎng)，這有利于人參毛狀根產量的增加，第二階段轉入熒光燈下培養(yǎng)，這有利于人參皂苷含量的積累。同時，光照對于提高毛狀根生物量和增加次級代謝產物的積累所要求的條件是不相一致的，因此我們應該綜合考慮這兩方面的因素，找到合適光照條件。

1.2 pH

pH的變化會引起培養(yǎng)基成分狀態(tài)的改變，多數毛狀根生長及次生代謝產物合成適合偏酸[21]性環(huán)境，一般培養(yǎng)的最適pH為5.0～6.0。如王淑芳等[22]研究發(fā)現，粘毛黃芩毛狀根的最適生長pH為5.8，但最適黃酮類化合物的合成是在pH為6.4。許鐵峰等[23]研究表明，1/2 MS培養(yǎng)液pH在5.4～5.8最適合粟米草毛狀根的生長。人們通過研究pH對多種藥用植物毛狀根培養(yǎng)的影響，表明pH過高或過低都不利于毛狀根中次生代謝產物的積累。李博華等[24]研究了四倍體菘藍毛狀根在不同pH(4.6、5、5.4、5.8、6.2、6.6、7.0、7.4)的1/2 MS液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)毛狀根，結果表明，當pH為5.8時，毛狀根生長量達到最大，當pH大于或小于5.8時，毛狀根生長量均不同程度減少。

毛狀根培養(yǎng)液中適宜的溶氧量對毛狀根的生長和代謝具有顯著的影響作用。適宜的溶氧量可以促進毛狀根的生長。培養(yǎng)液的溶氧量一般是通過毛狀根培養(yǎng)搖瓶的體積和搖瓶中裝液量的多少控制，如在一定體積搖瓶中，裝液量越少，培養(yǎng)液中溶氧越高。蘆韋華等[25]研究發(fā)現將新疆紫草毛狀根接種在SH培養(yǎng)液中，通過培養(yǎng)容積的逐級放大和培養(yǎng)液體積的增多，毛狀根干重及增殖倍數呈上升趨勢，采用250～500 mL的錐形瓶內裝100～200 mL培養(yǎng)液有利于毛狀根的生長增殖。劉春朝等[26]研究表明青蒿毛狀根250 mL的三角瓶中搖瓶培養(yǎng)時，裝液量等于50 mL時，生物量及青蒿素合成量最優(yōu)，為其最適溶氧情況。

1.4 溫度

溫度不僅影響毛狀根生長速率，而且對生物合成中的酶活性也起著重要的調節(jié)作用，毛狀根最適生長溫度一般為20～28 ℃。不同藥用植物最適生長溫度不同，其次代謝產物的積累對溫度的依賴性也因不同培養(yǎng)系而異。李紅波等[27]研究表明在25 ℃時，黃芩毛狀根生長緩慢，僅為4 g，在26～28 ℃時生長迅速，鮮重量不斷增加，可達到18.56 g，但當溫度升至29 ℃時，毛狀根生長接近終點，甚至減少，因此黃芩毛狀根生長選擇最適溫度范圍為26～28 ℃。溫度過高或過低都會在不同程度上抑制毛狀根的生長，其中還發(fā)現高溫對毛狀根的抑制作用更為明顯，這也表明溫度是影響毛狀根生長的一個重要因子。李翠芳[28]等將新疆紫草毛狀根分別置于14 ℃、18 ℃、22 ℃、26 ℃和30 ℃下培養(yǎng)，在14 ℃時毛狀根生長量最低，26 ℃達到最高，而30 ℃時生長下降；同時他們還研究新疆紫草毛狀根40 ℃高溫下培養(yǎng)24 h、48 h、72 h和96 h后，然后置于26 ℃培養(yǎng)30 d，毛狀根增殖倍數分別減少12.71%、14.07%、16.11%、17.10%，發(fā)現高溫處理時間越長，毛狀根的生長受抑制程度越大。

2 化學因素

不同培養(yǎng)基、碳源、氮源，以及添加外源激素等化學因素都會對毛狀根的生長及次生代謝物的生物合成產生一定的影響[29-30]，可通過改變培養(yǎng)基中各種化學物質種類及配比來研究最適于毛狀根生長的化學因素，從而增加毛狀根的產量和次生代謝產物含量。

2.1 培養(yǎng)基種類

培養(yǎng)基的種類對毛狀根生長及次生代謝物質的積累也有很大的影響，不同植物種類有不同的最適培養(yǎng)基。選擇適當的培養(yǎng)基可以大幅度提高毛狀根生長量。王沖之等[31]分析了1/2 MS、改良White、SJ-1、改良Nisch、B5和B5-I等6種液體培養(yǎng)基對西洋參毛狀根生長及皂苷含量的影響，發(fā)現SJ-1和B5培養(yǎng)基較好。馬玲等[32]研究表明將假酸漿毛狀根分別接種于MS、1/2 MS、N6和B5不含激素的液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，MS液體培養(yǎng)基對毛狀根的增殖效果最佳，依次為N6﹥1/2 MS﹥B5。蘆韋華等[25]研究了新疆紫草毛狀根在無銨的液體培養(yǎng)基SH、MG-5、MS、1/2 MS及B5培養(yǎng)基中的生長狀況，發(fā)現新疆紫草毛狀根在低鹽無銨SH液體培養(yǎng)基中的增殖倍數較培養(yǎng)在其它培養(yǎng)基中有顯著提高。培養(yǎng)基對毛狀根生長和次生代謝物的積累又不完全一致，有利于毛狀根生物量增加的培養(yǎng)基，并不一定是其次生代謝物積累的最適培養(yǎng)基。因此，對不同植物的培養(yǎng)體系需根據其產量和代謝產物積累兩方面綜合考慮。高帥等[33]研究發(fā)現，金鐵鎖毛狀根在MS、1/2 MS、B5、6-7-V和White等5種培養(yǎng)的生長都很快，其中在B5培養(yǎng)基生長最好，干重增加了15.8倍；在White培養(yǎng)基的生長最慢。而對于總皂苷的積累，在1/2 MS基本培養(yǎng)基中含量最高，其總皂苷含量為0.69%；在B5培養(yǎng)基中，總皂苷的積累最少，為0.24%，所以從毛狀根產量和總皂苷產量的積累考慮，1/2 MS液體培養(yǎng)基是毛狀根生長的最佳培養(yǎng)基。

2.2 碳源

大部分農村的村莊規(guī)劃，對村民住宅的規(guī)劃規(guī)定十分粗略，相對簡單。很多村莊規(guī)劃都只是對住宅的建筑朝向進行了大致的規(guī)定，但是其他方面如建筑選址、建筑整體規(guī)劃等并沒有明確的規(guī)定。因而多數村民的住宅在建造的時候會“沿路而建”，住址建造的時候受地貌，交通的影響較大。同時住宅與住宅之間相隔較遠，空置的閑地相對較多。因為往往會出現建筑排列不夠規(guī)則、居住點相對分散的情況，這也使得土地利用率大大降低，農村土地的嚴重浪費。同時也會使得在基礎設施的建設當中，工程量變大、成本更高、利用率卻不足。

碳源作為能量物質是培養(yǎng)基中不可缺少的主要成分，毛狀根培養(yǎng)基中不同的碳源和濃度對毛狀根的生長和次生代謝產物積累有不同程度的影響。不同藥用植物種類對碳源的要求不同。田思迪等[34]發(fā)現在蔗糖作為碳源的培養(yǎng)基中，金鐵鎖毛狀根生物量最大，顏色呈淺白色；以葡萄糖、果糖為碳源的培養(yǎng)基中，金鐵鎖毛狀根生長速度下降，出現褐變現象；而以乳糖、麥芽糖、淀粉為碳源的培養(yǎng)基中，毛狀根生長嚴重受到抑制。結果表明，金鐵鎖毛狀根利用蔗糖為碳源的能力較強；其研究還發(fā)現蔗糖濃度對毛狀根生長及皂苷積累存在影響，當蔗糖濃度為30 g·L-1，皂苷產量最高。蔗糖作為培養(yǎng)基中的重要碳源，以往的研究主要集中在培養(yǎng)基中的蔗糖濃度對毛狀根生長及其次生代謝物積，發(fā)現其濃度大小與細胞或器官的生長形態(tài)及次生代謝物質的累積密切相關[35]。馬玲等[32]研究表明，在MS液體培養(yǎng)基中分別加入濃度不同的蔗糖毛狀根的增殖量呈現的是先逐漸增加，而后增殖倍數開始逐漸減少的狀態(tài)，當濃度達到30 g·L-1時，毛狀根的增殖量平均最多達到23.43倍。寧凝等[36]等研究表明，蔗糖濃度為3%時，對黃秋葵毛狀根的促進作用最強，增殖倍數最高。

2.3 氮源

目前關于氮源含量、種類及其配比對毛狀根的生長及次生代謝物質積累的影響已有較多的研究，部分結果表明在毛狀根培養(yǎng)中銨鹽與硝酸鹽是最重要的氮源之一，銨態(tài)氮(NH4+)對毛狀根主根的生長有促進，并且能夠使主根茁壯變粗，但濃度變大超出承受范圍時反而會抑制根的生長；硝態(tài)氮(NO3-)對新根的生長有促進作用，高濃度的NO3-會導致新根過多，從而使毛狀根變?yōu)榧氒洜顟B(tài)，因此，對于銨態(tài)氮和硝態(tài)氮的配比應是毛狀根培養(yǎng)基影響因素之一[37]。劉軍等[38]研究表明，液體培養(yǎng)基中NH4+：NO3-的濃度比為1：2時金鐵鎖毛狀根的生物量和皂苷積累量為最佳。氮源的種類和濃度對根系建成和發(fā)育有很大影響，除了硝酸鹽和銨鹽外，牛肉浸膏、水解乳蛋白、蛋白胨等氮源也對其有重要影響。李博華等[24]研究表明，四倍體菘藍毛狀根在含1.0 g·L-1水解酪蛋白或水解乳蛋白作為氮源的培養(yǎng)基中生長最好，毛狀根分枝多產量高，而在以1.0 g·L-1酵母、蛋白胨、牛肉浸膏為氮源的培養(yǎng)基中，毛狀根生長慢、分枝少且形態(tài)粗短。

2.4 磷源

磷源是毛狀根生長發(fā)育及其次生代謝調節(jié)的必需元素之一。無機磷作為毛狀根培養(yǎng)基重要磷源，發(fā)現其濃度大小與毛狀根的生長形態(tài)及次生代謝物質的累積密切相關，無機磷不僅影響毛狀根的生長速度，還影響毛狀根的次生代謝。歐少云等[17]研究表明，在不含無機磷的培養(yǎng)基中培養(yǎng)的南美蟛蜞菊毛狀根細長，分枝少，生長勢弱，而在無機磷濃度為常規(guī)MS培養(yǎng)基用量的2～3倍時，毛狀根生長較好，增長率最高。劉軍等[38]研究表明，金鐵鎖毛狀根在低磷濃度時毛狀根生長緩慢，在高磷濃度時毛狀根會出現褐化并且次生代謝能力下降，皂苷含量低，綜合考慮金鐵鎖毛狀根生長速度和次級代謝能力，選擇濃度為6.25 mmol·L-1的無機磷為最優(yōu)。

另外，添加礦質元素和有機物質也可提高毛狀根產量和次生代謝產物含量。沈雙[39]等研究發(fā)現減少丹參毛狀根培養(yǎng)基中MgSO4·7H2O的含量，可以促進毛狀根的生長和丹參酮ⅡA的釋放。呂春茂等[40]發(fā)現鹽酸硫氨素、L-半胱氨酸、甲硫氨酸、L-亮氨酸和L-α-丙氨酸可促進煙草毛狀根的生長和輔酶Q10的合成，而酵母膏不利于煙草毛狀根的生長和輔酶Q10的合成。

2.5 外源激素

NAA、IAA、IBA、GA、KT、ZT等是植物組織培養(yǎng)中的關鍵因子，不僅影響細胞生長，還影響細胞次生代謝產物的合成[37]。盡管植物的毛狀根具有激素自主性，能在無激素的培養(yǎng)基上正常生長，但適當的加入激素仍能促進毛狀根中次生代謝產物的合成[41]。楊世海等[42]研究了5種激素6-BA、NAA、IBA、KT、ZT對羅勒毛狀根生長及多糖和總黃酮合成的影響，結果表明經過外源激素KT、ZT處理的毛狀根生長旺盛，而經IBA、NAA、6-BA處理的毛狀根生長緩慢，對毛狀根的生長有輕微的抑制作用。并且5種激素對總黃酮的積累有明顯的促進作用，其中經KT處理的毛狀根總黃酮量可達原植物的3.2倍，是未加激素處理毛狀根的2倍。綜合生物量和次生代謝產物合成兩方面，確定KT為羅勒毛狀根培養(yǎng)最適外源激素。楊睿等[19]研究表明GA3對水母雪蓮毛狀根側根的產生有強烈促進作用，GA3濃度為0.5 mg·L-1時，毛狀根生長量達到9.1 g·L-1(DW)，是基本培養(yǎng)條件下的1.2倍；總黃酮合成量達到936 mg·L-1，是基本培養(yǎng)條件下的1.5倍。0.5 mg·L-1GA3和0.5 mg·L-1IBA組合對毛狀根生長和總黃酮合成最有利，生長量為12.6 g·L-1(DW)，比基本培養(yǎng)條件時提高了70%；總黃酮合成量為1 287 mg·L-1，比基本培養(yǎng)條件下提高了一倍。寧凝等[36]研究表明，添加0.5 mg·L-16-BA培養(yǎng)的黃秋葵毛狀根增殖倍數比不添加任何外源激素培養(yǎng)的毛狀根增殖倍數低，添加0.5 mg·L-1NAA或IAA培養(yǎng)的毛狀根增殖倍數比不添加任何外源激素培養(yǎng)的狀根增殖倍數高，尤其是添加0.5 mg·L-1IAA培養(yǎng)的毛狀根增殖倍數更為顯著。外源激素對毛狀根的生長和次級代謝產物積累并不同步。徐大衛(wèi)等[41]研究表明，2，4-D、6-BA、NAA、KT均能不同程度地影響圓葉牽牛毛狀根的生長及其咖啡酸、咖啡酸乙酯的積累，其中2，4-D明顯抑制圓葉牽牛毛狀根的生長，NAA、KT對圓葉牽牛毛狀根的生長及其咖啡酸和咖啡酸乙酯均有促進作用，最適宜培養(yǎng)濃度分別為0.5 mg·L-1和1.0～1.5 mg·L-1。ABA是植物重要的脅迫響應信號，植物會在脅迫響應敏感部位合成大量ABA，有研究顯示，ABA能夠誘導植物萜類成分的積累。盛東峰等[43]研究表明，隨著ABA處理時間的延長，丹參毛狀根的生長被抑制，但其丹參酮類的含量和終產量增加，ABA能夠促進毛狀根丹參酮類的積累。

3 前體物質的應用

在植物組織和細胞培養(yǎng)中，添加前體物質是提高培養(yǎng)物中次級代謝產物含量有效的手段[30]。前體物質作為細胞次生代謝合成中的起始或中間產物，可以促進目標產物的生物合成。Sykowska-Baranek等[44]研究了在紅豆杉毛狀根中添加L-苯丙氨酸、P-氨基苯甲酸、茉莉酸甲醋、使紫杉醇、10-DAB Ⅲ含量大幅增加，證明前體物質對次生代謝起到一定影響。馬琳等[45]研究表明，不同濃度的丙酮酸鈉對人參毛狀根的生長起到明顯的促進作用，其中最佳濃度為5 mmol·L-1，而L-苯丙氨酸對毛狀根的生長的促進作用并不明顯，不同濃度的P-氨基苯甲酸對人參毛狀根的生長起到了抑制作用。馮慧娜等[15]研究表明，煙酸和異亮氨酸能促進雷公藤毛狀根的生長及干重的增加，但是煙酸、異亮氨酸和天冬氨酸對其內酯醇的產生，以及異亮氨酸和天冬氨酸的產生則具有不同程度的抑制作用，因此，需要綜合考慮前體物質種類和用量。

4 誘導子

誘導子(又稱激發(fā)子)是指能誘發(fā)植物產生保衛(wèi)素并能產生防御反應的物質[46-48]。現在研究發(fā)現在植物與微生物的相互作用中，誘導子能快速地、高度專一地和選擇性地誘導特異基因的表達[49-50]。人們根據誘導子來源不同可分為生物誘導子(biotic elicitor)與非生物誘導子(abiotic elicitor)。

4.1 生物誘導子

生物誘導子是指來源于微生物或者動植物細胞的化合物，主要包括病原菌(真菌、細菌、病毒與酵母)和植物細胞壁的分離物，目前應用最廣、研究最多的是真菌類誘導子[18]。沈雙等[51]研究表明，50 μg·mL-1的紅花鏈格孢菌誘導子可以促使丹參毛狀根中獲得最高的二氫丹參酮Ⅰ和丹參酮Ⅱ的產量，分別是對照的3.16和1.25倍，然而丹參毛狀根中最高的隱丹參酮和丹參酮Ⅱ的產量由250 μg·mL-1的瓜枝孢菌誘導子誘導獲得，分別是對照產量的5.24和1.43倍。結果也表明這兩種真菌誘導子不僅可以提高丹參酮類成分的含量，同時也能促進毛狀根的生長。不同真菌誘導子之間存在協同效應，按一定比例混合使用可提高毛狀根產量和次生代謝物積累。張璞等[52]將黑曲霉、米曲霉誘導子及其混合誘導子添加到M-9培養(yǎng)基中來培養(yǎng)新疆紫草毛狀根，培養(yǎng)10 d時以2.5∶ 50的比例添加混合誘導子，總萘醌含量是對照的2.28倍；混合誘導子對毛狀根增殖有促進作用，可大幅提高新疆紫草毛狀根萘醌含量。

4.2 非生物誘導子

非生物誘導子是指那些不能由生物體提供的起誘導作用的理化因子，主要包括茉莉酸甲酯(MeJA)、水楊酸(SA)及重金屬與稀土元素鹽類等[49]。非生物誘導子對植物次生代謝產物積累具有促進作用已有相關報道。楊世海[42]等研究表明，MeJA總體上對羅勒毛狀根生長起到抑制作用，濃度越高，抑制作用越明顯，但MeJA對毛狀根中總黃酮合成具有明顯的促進作用，其濃度為50 μmol·L-1作用最強，總黃酮量是原植物的3.1倍，是未加激素處理的2倍。同時，他們還研究了水楊酸(SA)對羅勒毛狀根的影響，研究發(fā)現SA對毛狀根生長的影響作用不顯著，但對總黃酮的積累有明顯促進作用，濃度為20 μmol·L-1SA可使總黃酮達到83.561 μg·mg-1，是原植物的2.9倍，是未加激素處理毛狀根總黃酮量的1.9倍。沈雙等[51]研究表明，ABA和PEG在不同處理濃度下均顯著抑制了丹參毛狀根的生長，而對于毛狀根中4種丹參酮類成分的積累卻有不同程度的促進作用，ABA和PEG促進丹參毛狀根丹參酮積累的最佳濃度分別為200 μmol·L-1和2%。靳浩淼等[53]研究表明，水楊酸對西洋參毛狀根的最佳添加濃度為0.6 mg·L-1，作用時間為144 h。茉莉酸甲酯的最佳添加濃度10 μmol·L-1，作用時間為192～240 h。幾種非生物誘導子按一定比例混合對植物次生代謝的增加有明顯的協同作用。徐立新等[54]通過向人參毛狀根培養(yǎng)基中添加誘導子茉莉酸甲酯和水楊酸，發(fā)現2種誘導子在適當的濃度下，對人參皂苷含量的增加具有明顯的協同作用，當MeJA和SA濃度均為1 μmol·L-1時，其對總皂苷和單體皂苷的積累比二者單獨作用要大。

5 生物反應器在毛狀根上的應用

生物反應器培養(yǎng)植物細胞具有工作體積大、單位體積生產能力高、物理和化學條件控制方便、不受時間和地點限制、隨時隨地規(guī)模化生產等許多優(yōu)點[55]，使用生物反應器培養(yǎng)藥用植物毛狀根已經得到廣泛推廣，我國已開始對長春花、三七、紫草、紅豆杉等珍貴藥用植物毛狀根的大規(guī)模培養(yǎng)進行了探索[56]。到目前為止，毛狀根已在攪拌式、氣升式、噴淋床、霧化式等各種形式的生物反應器中進行培養(yǎng)研究。不同植物的毛狀根根據其性狀和培養(yǎng)條件的不同而應選擇不同的生物反應器，以有利于毛狀根生物量和次生代謝產物的積累。邱德友等[57]利用10 L的球狀氣升式反應器進行了丹參毛狀根培養(yǎng)的初級放大試驗，發(fā)現球狀氣升式反應器培養(yǎng)50 d時丹參毛狀根的增殖倍數為241.71倍。李翠芳等[58]采用超聲提取法對新疆紫草固體培養(yǎng)毛狀根、液體培養(yǎng)毛狀根以及2～3年生根中的總糖和多糖進行了提取測定。結果表明，毛狀根中水溶性總糖含量為25.573%，是野生根總糖含量的3.4倍；固體培養(yǎng)的毛狀根多糖含量最高，達4.289%，是液體培養(yǎng)毛狀根的3.37倍，是野生根的4倍。

6 展望

農桿菌介導產生的植物毛狀根培養(yǎng)體系已成為生物技術生產和提高藥用植物次生代謝產物的一種有效途徑[59-60]。毛狀根生長速率和其代謝產物合成能力受物理和化學等因素的影響，添加有機物和誘導子也能提高毛狀根中次生代謝產物含量。已有報道龍膽、黃花蒿和丹參[61-62]等藥用植物成功誘導產生毛狀根，優(yōu)化培養(yǎng)條件，獲得環(huán)烯醚萜類、青蒿素等次級代謝產物；但是在毛狀根培養(yǎng)中，摸索出能夠能同時滿足提高毛狀根產量和次生代謝含量的培養(yǎng)條件還比較困難，因此創(chuàng)新出一套對毛狀根生物量和次級代謝產物積累均有效的培養(yǎng)篩選模式，對毛狀根生產具有重要意義。

目前通過毛狀根來生產天然活性物質還處于發(fā)展階段，并且大多處于實驗室中，要實現用毛狀根大規(guī)模工業(yè)化生產天然活性物質還有很多問題要解決[18]。一方面由于毛狀根在生長過程中培養(yǎng)液中物質的轉移，毛狀根生長時易成團，限制了營養(yǎng)和氧氣的進入，致使目前的生物反應器還難以滿足毛狀根大規(guī)模培養(yǎng)[58]；另一方面毛狀根發(fā)酵水平很低，生產的成本高，也無法滿足工業(yè)化生產的需求。為了提高生物產量，開發(fā)新型生物反應器和建立新的培養(yǎng)方法也是實現工業(yè)化的重要步驟。

此外，對毛狀根次生代謝途徑和調控機理的研究，將有利于從根本上提高毛狀根次生代謝產物的產量[18]。我們還應該著重考慮將反應器培養(yǎng)技術與工程技術、智能?？丶夹g結合起來，提高生物反應器的使用效率，從而實現大規(guī)模培養(yǎng)工業(yè)化生產，這將為毛狀根培養(yǎng)用于生產藥用植物次生代謝產物的工業(yè)化發(fā)展奠定基礎。

[1] 陳岺曦，王伯初.生物反應器與藥用植物毛狀根的大規(guī)模培養(yǎng)[J].生物技術通報，2007，4：38-41.

[2] 徐明芳.藥用植物發(fā)根培養(yǎng)及發(fā)根培養(yǎng)器[J].中草藥，2000，31(10)：798-780.

[3] Praveen N，Murthy HN.Synthesis of withanolide A depends on carbon source and medium pH in hairy root cultures ofWithaniasomnifera[J].Industrial Crops and Products，2012，1(35)：241.

[4] Wang QJ，Zheng LP，Yuan HY，et al.Propagation ofSalviamiltiorrhizafrom hairy root explants via somatic embryogenesis and tanshinone content in obtained plants[J].Industrial Crops and Products，2013，50：648-653.

[5] Kai GY，Xu H，Zhou CC，et al.Metabolic engineering tanshinone biosynthetic pathway inSalviamiltiorrhizahairy root cultures[J].Metabolic Engineering，2011，13(3)：319-327.

[6] Asano T，Kobayashi K，Kashihara E，et al.Suppression of camptothecin biosynthetic genes results in metabolic modification of secondary products in hairy roots ofOphiorrhizapumila[J].Phytochemistry，2013，91：128-139.

[7] Chen X，Zhang J，Liu JH，et al.Biotransformation ofp-，m-，ando-hydroxybenzoic acids byPanaxginsenghairy root cultures[J].Journal of Molecular Catalysis B：Enzymatic，2008，54(3-4)：72-75.

[8] Zhai DD，Supaibulwatana K，Zhong JJ.Inhibition of tumor cell proliferation and induction of apoptosis in human lung carcinoma 95-D cells by a new sesquiterpene from hairy root cultures ofArtemisiaannua[J].Phytomedicine，2010，17(11)：856-861.

[9] Park NII，Xu H，Li XH，et al.Overexpression of phenylalanine ammonia-lyase improves flavones production in transgenic hairy root cultures ofScutellariabaicalensis[J].Process Biochemistry，2012，47(12)：2575-2580.

[10] 李亞璞，閆靜輝.藥用植物毛狀根誘導及其培養(yǎng)技術研究[J].中藥材，2007，3：60-62.

[11] Srivastava S，Srivastava AK.Hairy root culture for mass-production of high-value secondary metabolites[J].Critical Reviews in Biotechnology，2007，27(1)：29-43.

[12] Fattahi M，Nazeri V，Torras-Claveria L，et al.A new biotechnological source of rosmarinic acid and surface flavonoids：hairy root cultures ofDracocephalumkotschyiBoiss[J].Industrial Crops and Products，2013，50：256-263.

[13] 張艷馥，劉偉華，姜靜，等.Ri質粒誘導的植物發(fā)根培養(yǎng)系及其應用[J].生物技術，1997，7(3)：4-6.

[14] 張輝，于榮敏.發(fā)根農桿菌Ri質粒及其在植物次生代謝產物研究中的應用[J].沈陽藥科大學學報，2000，4：306-308.

[15] 馮慧娜.雷公藤發(fā)狀根的鑒定和培養(yǎng)及其次生代謝物調控初步研究[D].西北農林科技大學，2013.

[16] Ono NN，Tian L.The multiplicity of hairy root cultures：prolific possibilities[J].Plant Science，2011，180(3)：439-446.

[17] 歐少云.南美蟛蜞菊毛狀根的離體培養(yǎng)及其提取液對種子萌發(fā)的影響[J].應用與環(huán)境生物學報，2010，16(4)：534-540.

[18] Ludwig-Muller J，Jahn L，Lippert A，et al.Improvement of hairy root cultures and plants by changing biosynthetic pathways leading to pharmaceutical metabolites：strategies and applications[J].Biotechnology Advances，2014，31：1-12.

[19] 楊睿，付春祥，金治平，等.不同理化因子對雪蓮毛狀根生長和總黃酮生物合成的影響[J].生物工程學報，2005，21(2)：233-238.

[20] Yu KW，Murthy HN，Hahn EJ，et al.Ginsenoside production by hairy root cultures ofPanaxginseng：influence of temperature and light quality[J].Biochemical Engineering Journal，2005，23(1)：53-56.

[21] Shin KS，Chakrabarty D，Ko JY，et al.Sucrose utilization and mineral nutrient uptake during hairy root growth of red beet(BetavulgarisL.)in liquid culture[J].Plant Growth Regulation，2003，39(2)：187-193.

[22] 王淑芳，張仁波，竇全麗.外界因子對粘毛黃芩毛狀根生長和黃酮類化合物合成的影響[J].河南師范大學學報，2012，40(4)：124-126.

[23] 許鐵峰，張漢明，李博華，等.粟米草毛狀根的研究[J].第二軍醫(yī)大學學報，1999，20(10)：764-766.

[24] 李博華，張漢明，丁如賢，等.四倍體菘藍毛狀根培養(yǎng)系統的建立及外界因子對其生長的影響[J].中草藥，2000，31(2)：132-134.

[25] 蘆韋華，潘頎，王芳，等.培養(yǎng)條件對新疆紫草毛狀根生長及紫草素含量的影響[J].西北植物學報，2012，32(8)：1686-1691.

[26] 郭晨，劉春朝，葉和春，等.溫度對青蒿毛狀根生長和青蒿素生物合成的影響[J].西北植物學報，2004，24(10)：1828-1831.

[27] 李紅波.黃芩毛狀根的誘導及黃芩苷分離純化的研究[D].齊齊哈爾大學，2012.

[28] 李翠芳，王芳，麻浩，等.培養(yǎng)基及溫度對新疆紫草毛狀根生長的影響[J].新疆農業(yè)科學，2009，46(5)：1117-1120.

[29] 楊秀淦，高帥，王洪峰.Ri質粒誘導藥用植物毛狀根技術及應用[J].廣東林業(yè)科技，2012，28(5)：67-73.

[30] Hakkinen ST，Raven N，Henquet M，et al.Molecular farming in tobacco hairy roots by triggering the secretion of a pharmaceutical antibody[J].Biotechnology and Bioengineering，2014，111(2)：336-346.

[31] 王沖之，丁家宜.不同培養(yǎng)基及外源激素對西洋參毛狀根的生長和皂甙含量的影響[J].植物資源與環(huán)境學報，2001，10(4)：1-4.

[32] 馬玲，趙雪，張海濤，等.假酸漿毛狀根培養(yǎng)條件的優(yōu)化[J].人參研究，2013，3：16-23.

[33] 高帥，王洪峰，侯麗麗，等.不同培養(yǎng)條件對金鐵毛狀根生長的影響[J].廣東林業(yè)科技，2012，28(2)：16-21.

[34] 田思迪，李云芳，張宗申，等.影響金鐵鎖毛狀根生長及皂苷積累的因素[J].時珍國醫(yī)國藥，2012，23(4)：824-826.

[35] Yu SX，Kwok KH，Doran PM.Effect of sucrose，exogenous product concentration，and other culture conditions on growth and steroidal alkaloid production bySolanumavicularehairy roots[J].Enzyme and Microbial Technololy，1996，18(4)：238-243.

[36] 寧凝，楊世海.不同因子對黃秋葵毛狀根生長的影響[J].人參研究，2013，2：20-22.

[37] Meyer HJ，Staden JV.The in vitro production of an anthocyanin from callus cultures ofOxalislinearis[J].Plant Cell Tissue and Organ Culture，1995，40(1)：55-58.

[38] 劉軍，陳顯化，金朝霞，等.氮源和磷源對金鐵鎖毛狀根懸浮培養(yǎng)的影響[J].大連工業(yè)大學學報，2013，32(6)：409-412.

[39] 沈雙，張順倉，楊東風，等.培養(yǎng)基中不同營養(yǎng)元素對丹參毛狀根生長及丹參酮類積累的影響[J].西北農林科技大學學報.2011，39(3)：130-136

[40] 呂春茂，林麗，孟憲軍，等.有機物質對煙草發(fā)狀根生長及輔酶Q10合成的影響[J].煙草科技，2010，1：47-50.

[41] 徐大衛(wèi)，王倩倩，王鵬飛，等.外源激素對圓葉牽牛毛狀根生長及次生代謝產物積累的影響[J].中國現代中藥，2012，14(10)：32-36.

[42] 楊世海，楊慧潔，聞玉莉.羅勒發(fā)根的誘導及不同因子對發(fā)根生長及次生代謝產物的影響[J].中草藥，2012，43(9)：1841-1845.

[43] 盛東峰，朱自學.脫落酸不同處理時間對丹參毛狀根有效成分積累的影響[J].天然產物研究與開發(fā)，2013，25：807-811.

[45] 馬琳.前體物質對人參發(fā)根活性成分的影響[D].吉林農業(yè)大學，2011.

[46] Ge XC，Wu JY.Tanshinone production and isoprenoid pathways inSalviamiltiorrhizahairy roots induced by Ag+and yeast elicitor[J].Plant Science，2005，168(2)：487-491.

[47] Pitta-Alvarez SI，Spollansky TC，Giulietti AM.The influence of different biotic and abiotic elicitors on the production and profile of tropane alkaloids in hairy root cultures ofBrugmansiacandida[J].Enzyme and Microbial Technology，2000，26(2-4)：252-258.

[48] Cheng QQ，He YF，Li G，et al.Effects of combined elicitors on tanshinone metabolic profiling andSmCPSexpression inSalviamiltiorrhizahairy root cultures[J].Molecules，2013，18：7473-7485.

[49] 王紅.真菌誘導子對青蒿發(fā)根生長和青蒿素生物合成的影響及開花與青蒿素生物合成的相關性研究[D].中國科學院植物研究所，1999.

[50] 吳建章，郁建平，趙東亮.迷迭香酸的研究進展[J].天然產物研究與開發(fā)，2005，17(3)：383-388.

[51] 沈雙.誘導子對丹參毛狀根生長和丹參酮含量的影響[D].西北農林科技大學，2011.

[52] 靳浩淼.誘導子對西洋參發(fā)狀根的影響[D].吉林農業(yè)大學，2008.

[53] 張璞，王芳，朱查山.真菌誘導子與吸附樹脂對新疆紫草毛狀根中萘醌積累的影響[J].生物工程學報，2013，29(2)：214-223.

[54] 徐立新，趙壽經，梁彥龍，等.外源調節(jié)物質對人參毛狀根生長及皂苷合成的影響[J].吉林大學學報，2010，40(6)：1619-1623.

[55] Mehrotra S，Prakash O，Khan F，et al.Efficiency of neural network-based combinatorial model predicting optimal culture conditions for maximum biomass yields in hairy root cultures[J].Plant Cell Reports，2013，32(2)：309-317.

[56] 常鈺，劉滌，胡之璧.植物細胞和器官大規(guī)模培養(yǎng)研究的進展[J].生物技術通報，2001，1：31-36.

[57] 邱友德，宋經元，馬小軍，等.丹參毛狀根生物反應器大規(guī)模培養(yǎng)的研究[J].分子植物育種，2004，2(5)：699-703.

[58] 陳偉莉，牟旭鵬，劉冬影，等.毛狀根在植物次生代謝產物生產方面應用的研究進展[J].黑河學院學報，2010，12(4)：122-126.

[59] Wang JW，Wu JY.Effective elicitors and process strategies for enhancement of secondary metabolite production in hairy root cultures[J].Biotechnology of Hairy Root Systems，2013，134：55-89.

[60] Sharafi A，Sohi HH，Mousavi A，et al.Enhanced morphinan alkaloid production in hairy root cultures ofPapaverbracteatumby over-expression of salutaridinol 7-o-acetyltransferase gene viaAgrobacteriumrhizogenesmediated transformation[J].World Journal of Microbiology and Biotechnology，2013，29(11)：2125-2131.

[61] Huang SH，Vishwakarma RK，Lee TT，et al.Establishment of hairy root lines and analysis of iridoids and secoiridoids in the medicinal plantGentianascabra[J].Botanical Studies，2014，55：1-8.

[62] Jessing KK，Duke SO，Cedergreeen N. Potential ecological roles of artemisinin produced byArtemisiaannuaL.[J].Journal of Chemical Ecology，2014，40(2)：100-117.

ResearchProgressonVariousInfluencesinHairyRootYieldandSecondaryMetabolitesAccumulationofMedicinalPlant

SUN Jing1，2，YANG Hongyi2，SUI Chun2，3*

(1.CollegeofLifeScience，NortheastForestryUniversity，Haerbin150040，China； 2.InstituteofMedicinalPlantDevelopment，ChineseAcademyofMedicalSciencesandPekingUnionMedicalCollege，Beijing100193，China； 3.KeyLaboratoryofBioactiveSubstancesandResourcesUtilizationofChineseHerbalMedicine，MinistryofEducation，Beijing100193，China)

There are about 30% of medicinal plants with roots as effective parts.Hairy roots cultures are new approach for the production of secondary metabolites Many factors affect the growth of hairy roots and its secondary metabolites output，such as physical，chemical factors，precursors and fungal elicitors，etc.The high yield of hairy roots and metabolites could be obtained according to optimization of culture conditions and medium content.In this paper，we reviewed the factors and its relative mechanism involving in the inductive formation of hairy root，large-scale root yield，and productions of secondary metabolites，thus provides valuable references for further related research and application.

Hairy root；Secondary metabolite；Factors

10.13313/j.issn.1673-4890.2014.11.017

2014-03-19)

四川省“十二五”農作物及畜禽育種攻關項目(2011NZ0098-12-11)；國家自然科學基金項目(81072994)；北京市自然科學基金項目(5102033)

*

隋春，副研究員，研究方向：藥用植物基因資源和次生代謝調控；Tel：(010)57833363，E-mail：csui@implad.ac.cn