抗氯吡脲單克隆抗體的制備及其間接競爭ELISA方法的建立

陸健康++艾明艷++李述剛

摘要：在獲得高特異性抗CPPU單克隆抗體的基礎上，采用活性酯法將CPPU-H1與BSA、CPPU-H2與OVA偶聯(lián)制備得到免疫抗原CPPU-H1-BSA和包被抗原CPPU-H2-OVA；用CPPU-H1-BSA對小鼠進行免疫，通過雜交瘤技術篩選獲得了1株抗CPPU單克隆抗體的雜交瘤細胞株B7B6 24。經(jīng)過體內誘生腹水法制備抗體，測定抗體亞類為IgG1，效價為1∶32 000。通過對試驗條件的優(yōu)化，建立了一種檢測CPPU的方法，該方法IC50值為3.89 ng/mL；該抗體與四螨嗪、赤霉素、噻苯隆幾乎不存在交叉反應；利用所建立的間接競爭ELISA法對葡萄樣品進行檢測，平均加標回收率為91.4%～112.4%，變異系數(shù)為5.9%～14.4%。本研究所建立的間接競爭ELISA方法具有低成本、高準確性和高靈敏度的特點，可以用來對葡萄中的CPPU殘留情況進行檢測。

關鍵詞：氯吡脲；單克隆抗體；間接競爭ELISA

中圖分類號：S482.8 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2016）21-5584-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2016.21.037

Preparation of Anti-CPPU Monoclonal Antibody and Development of

an Indirect Competitive ELISA Method

LU Jian-kang，Ai Ming-yan，LI Shu-gang

（Xinjiang Production & Construction Group Key Laboratory of aricultural Products Processing in Xinjiang South，

Tarim University，Alaer 843300，Xinjiang，China）

Abstract： A method to rapidly detect forchlorfenuron（CPPU） was developed by Indirect competitive ELISA on the basis of obtaining the Anti-CPPU Monoclonal Antibody with high specificity. CPPU-H1-BSA（immunogenic antigen） and CPPU-H2-OVA（coating antigen） were prepared by coupling with CPPU-H1 and CPPU-H2 with carrier proteins using active ester method，respectively. Through a hybridoma cell line，a strain of cells B7B6 24 which can produce anti-CPPU on monoclonal antibody was obtained. Ascites was produced by mice vivo culcure，the monoclonal antibody characterized by IgG1 isotype，and the ELISA titer of ascites was 1∶32 000. A indirect competitive ELISA was developed for the detection of CPPU by optimizing experimental conditions. The IC50 value was 3.89 ng/mL，it did not react with clofentezine， gibberellic acid，thidiazuron. The average recovery rate for CPPU from grape samples were ranged from 91.4% to 112.4% and the variation coefficient were between 5.9%～14.4%. The indirect competitive ELISA allows for accurate，sensitive，and low-cost for determination of CPPU residues in grape.

Key words： CPPU； monoclonal antibody； indirect competitive ELISA

氯吡脲（forchlorfenuron）又名吡效隆、CPPU，化學名稱為1-（2-氯-4-吡啶基）-3-苯基脲，是膨大劑的主要成分，具有促進細胞增大、分化、分裂、防止落花以及提高座果率等多方面作用[1]。CPPU在西瓜[2]、葡萄[3]、獼猴桃[4，5]、菠蘿[6]等瓜果類植物中的應用研究較多。在CPPU的實際使用過程中，存在著片面追求大果形以及高產量而高劑量、高濃度噴灑的問題，從而導致各類瓜果貯藏期縮短以及營養(yǎng)物質和風味物質降低[7]。此外，殘留于瓜果以及其他食品中的CPPU還可能對人類以及環(huán)境中的其他生物造成潛在的影響，如美國環(huán)境保護署指出人類長期接觸CPPU會導致體內蛋白質代謝紊亂以及體形消瘦等問題[8]、高劑量CPPU可能誘導雌性大鼠青春期啟動延遲[9]等。因此，中國、美國、日本以及歐盟等對CPPU的最大殘留量作出了嚴格的限定，中國規(guī)定西瓜和黃瓜中的最大殘留量為0.1 mg/kg，獼猴桃和葡萄中的最大殘留量為0.05 mg/kg。

目前，對于CPPU殘留的檢測方法較多，主要包括液相色譜法[10-13]、液相色譜-質譜聯(lián)用法[14，15]、近紅外高光譜成像法[16]以及免疫分析方法[17，18]等。免疫學分析方法具有簡便、快速、高通量、靈敏以及成本低等諸多優(yōu)點，適合于大批量樣品的現(xiàn)場檢測。本研究使用單克隆抗體技術，制備抗CPPU的高特異性和靈敏度的單克隆抗體，并在此基礎上建立了果品中快速檢測CPPU的間接競爭ELISA法，為后續(xù)開發(fā)ELISA試劑盒奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 試劑 牛血清白蛋白（BSA）、卵白蛋白（OVA）、N-羥基硫代琥珀酰亞胺、二環(huán)己基碳二亞胺、弗氏完全佐劑、弗氏不完全佐劑，購自Sigma公司；單克隆抗體亞型鑒定試劑盒，購自Thermo公司；CPPU等農藥標準品，購自山東西亞化學工業(yè)有限公司；其他化學試劑均為分析純。

1.1.2 細胞株及試驗動物 鼠骨髓瘤細胞SP2/0由深圳市易瑞生物技術有限公司提供；清潔級Balb/c純種雌性小鼠及普通級雌性昆明鼠由廣東省醫(yī)學動物實驗中心提供。

1.1.3 儀器與設備 WD-2102A型酶標儀（北京市六一儀器廠）；FA/JA2004N型電子天平（上海精密科學儀器有限公司）；TDL-5-A（上海安亭科學儀器廠）；LHS-150 SC型恒溫恒濕培養(yǎng)箱（上海一恒科學儀器有限公司）。

1.2 人工抗原的合成與鑒定

按照文獻[17]的方法稍作修改后合成N-（4-羧基苯基）-N-3-氯吡啶基-2-甲酰二胺（CPPU-H1）和N-（4-乙酸苯基）-N-3-氯吡啶基-2-甲酰二胺人工半抗原（CPPU-H2），經(jīng)質譜鑒定為目標產物。然后采用活性酯法合成CPPU完全抗原，具體操作如下：稱取0.1 mmol CPPU-H1（或CPPU-H2）溶解于0.5 mL二甲基甲酰胺中，加入0.2 mmol N-羥基琥珀的酰亞胺和0.2 mmol二環(huán)己基碳二亞胺，4 ℃條件下避光攪拌反應過夜后4 000 r/min離心10 min，離心后的上清液為A液。稱取6 mmol BSA（或6 mmol OVA）溶于適量0.01 mmol/L磷酸鹽緩沖液（PBS，pH 7.4）中，攪拌溶解為B液；4 ℃攪拌條件下，將A液逐滴加入到B液中，4 ℃攪拌反應過夜；將反應液轉入透析袋中，4 ℃攪拌條件下透析3 d，每天更換透析液3次；將透析液分裝后置于-20 ℃條件下保存?zhèn)溆谩?/p>

合成的人工抗原CPPU-H1-BSA、CPPU-H1、BSA、CPPU-H2-OVA、CPPU-H2以及OVA在波長200～360 nm范圍內分別進行紫外光譜掃描，通過比對掃描曲線判斷是否合成成功。

1.3 單克隆抗體的制備

1.3.1 動物免疫 將制備好的免疫抗原CPPU-H2-OVA與等量弗氏完全佐劑乳化完全后對6～8周齡雌性Balb/c小鼠進行皮下多點免疫，100 μg/只。二、三免時采用弗氏不完全佐劑進行乳化，皮下多點以及腹腔免疫，100 μg/只，免疫間隔為2周。第4次免疫后的第7天從小鼠尾部取血測定抗體效價。細胞融合前3 d腹腔免疫CPPU-H2-OVA，50 μg/只以加強免疫。

1.3.2 細胞融合及篩選 取抗血清效價好以及靈敏度高的小鼠的脾細胞與SP2/0骨髓瘤細胞進行細胞融合，然后先后采用含HAT和HT的培養(yǎng)液對融合后的細胞進行培養(yǎng)篩選；待細胞培養(yǎng)板中的細胞貼壁長滿1/2～1/3的小孔底部后，取雜交瘤細胞上清液進行間接ELISA檢測。取呈現(xiàn)強陽性的亞克隆進行擴大培養(yǎng)，如此反復2～4次，待所克隆孔中上清液中的抗體陽性率為100%時，進行擴大培養(yǎng)，建株后分裝、凍存。

1.3.3 腹水的制備及純化 Balb/c雌性小鼠提前1周腹腔注射0.5 mL降植烷；取凍存細胞株，復蘇后，大量培養(yǎng)繁殖，收集細胞，用不完全培養(yǎng)基洗滌2次后，再用10 mL不完全培養(yǎng)基懸浮，計數(shù)；每只小鼠腹腔注射1.5×107個單克隆細胞，待小鼠腹部明顯膨大時采集腹水，1 000 r/min離心10 min，去除上層脂肪和下層纖維蛋白及細胞，收集中層即為小鼠腹水，取部分腹水利用ELISA法測定其效價，其余分裝后于-70 ℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 單克隆抗體的鑒定

1.4.1 抗體效價的測定 采用間接ELISA法測定單克隆抗體的效價，分別以不同濃度的CPPU-H1-BSA包被抗原包被酶標板，將單克隆抗體從1∶2 000開始倍比稀釋作為1抗，以HRP-羊抗鼠IgG作為二抗，進行間接ELISA法測定，選擇OD450 nm為1.0左右的抗體最高稀釋倍數(shù)作為單克隆抗體的效價。

1.4.2 抗體的亞型鑒定 采用間接ELISA法對單克隆抗體的亞型進行鑒定。

1.5 間接競爭ELISA法的建立

1.5.1 標準曲線的繪制 根據(jù)間接ELISA棋盤方陣滴定法確定的最佳抗原包被濃度以及抗體稀釋倍數(shù)進行間接競爭ELISA試驗，在此過程中確定最佳競爭時間、封閉時間、酶標二抗反應時間以及競爭模式。根據(jù)最佳反應條件，用甲醇將競爭抗原濃度稀釋至0.1、0.3、0.9、2.7、8.1、24.3、72.9 ng/mL進行間接競爭ELISA試驗。以CPPU的濃度對數(shù)為橫坐標、競爭抑制率為縱坐標建立間接競爭ELISA標準曲線，計算CPPU的IC50值。

1.5.2 單克隆抗體特異性分析 選擇四螨嗪、赤霉素、噻苯隆分別代替CPPU作為競爭抗原，采用間接競爭ELISA法建立標準曲線，并分別計算IC50值，按公式計算交叉反應率CR（%）：CR=（IC50 CPPU/IC50其他藥物）×100%。

1.6 加標回收率測定

將市場上購買的葡萄經(jīng)充分破碎后，準確稱取5.0 g葡萄漿樣品，分別加入一定量的CPPU標準溶液，使其濃度分別為10、20、50 ng/g，每個濃度3個重復；分別往每個樣品中加入15 mL乙腈和3 g氯化鈉，振蕩提取10 min后，4 500 r/min離心10 min，靜置20 min，取5 mL上清液氮氣吹干后用甲醇復溶后用于ELISA檢測，計算相應的加標回收率。

2 結果與分析

2.1 CPPU完全抗原的鑒定

在波長為200～360 nm范圍內，對半抗原、載體蛋白以及人工抗原的紫外吸收特性進行分析，以鑒定完全抗原是否合成成功。由圖1可知，CPPU-H1-BSA在280 nm處有BSA的特征吸收峰，在316 nm以及260 nm處存在CPPU-H1的2個特征吸收峰，說明CPPU-H1-BSA偶聯(lián)成功；OVA在279 nm處存在特征吸收峰，CPPU-H2在291 nm處存在特征吸收峰，而CPPU-H2-OVA的特征吸收峰在283 nm處，證明CPPU-H2-OVA偶聯(lián)成功。

2.2 抗血清效果分析

抗血清的效價與抗血清中特異性抗體濃度成正比，而活化的B淋巴細胞是抗體分泌細胞，因此，效價越高則活化的B淋巴細胞越多。在融合時選用效價高的小鼠脾細胞有利于融合出針對目標抗原的雜交瘤細胞。采用棋盤方陣滴定法確定最佳的包被抗原濃度為2 μg/mL，其中3號小鼠抗血清效價最高。分別采用濃度為0、500 ng/mL的CPPU作為競爭抗原，對不同小鼠的抗血清進行間接競爭ELISA檢測，記錄OD450 nm并計算抑制率，其結果如表1所示。從表1中可以看出在競爭抗原CPPU濃度達到500 ng/mL時，3號小鼠抗血清的抑制率超過90%，因此，選用3號小鼠的脾細胞進行細胞融合。

2.3 單克隆抗體細胞篩選

經(jīng)過細胞融合、篩選，得到了1株穩(wěn)定分泌抗CPPU抗體的雜交瘤細胞B7B6 24。經(jīng)過多次傳代、凍存和復蘇，該株雜交瘤細胞能保持很好的抗體分泌能力且效價穩(wěn)定。

2.4 單克隆抗體亞型鑒定

經(jīng)降植烷處理后的小鼠腹腔注射B7B6 24雜交瘤細胞，10～15 d后采集腹水。以2 μg/mL包被抗原包被酶標板，采用間接ELISA方法檢測腹水抗體的亞型，檢測結果顯示B7B6 24的抗體亞型為IgG1。采用間接ELISA方法測定單克隆抗體B7B6 24的腹水效價為1∶32 000。

2.5 間接競爭ELISA法的建立

2.5.1 標準曲線繪制 根據(jù)間接ELISA棋盤方陣滴定法確定的最佳抗原包被濃度以及抗體稀釋倍數(shù)進行間接競爭ELISA試驗，在此過程中確定最佳競爭時間、封閉時間、酶標二抗反應時間以及競爭模式。4 ℃包被12 h；抗原最佳包被濃度2 μg/mL，單克隆抗體稀釋倍數(shù)為1∶32 000；5%脫脂奶粉封閉120 min；板內競爭反應模式；37 ℃競爭反應90 min；酶標二抗?jié)舛葹?∶4 000；酶標二抗反應時間為60 min。

由圖2可知，線性回歸方程為y=-0.316 3Ln（x）+0.686 5（R2=0.990 1），其IC50值為3.89 ng/mL。

2.5.2 單克隆抗體特異性分析 通過間接競爭ELISA法檢測，表明B7B6 24雜交瘤細胞所產生的單克隆抗體與四螨嗪、赤霉素、噻苯隆的交叉反應率均小于0.39%（表2），表明所制備的單克隆抗體對CPPU具有高度的特異性。

2.6 加標回收率

在葡萄樣品中加入3種不同濃度的CPPU標準品溶液并進行提取，采用間接競爭ELISA法進行測定樣品加標回收率，檢測結果如表3所示。有結果可知，樣品平均加標回收率在91.4%～112.4%之間，變異系數(shù)在5.9%～14.4%之間（表3），表明該方法具有較好的準確性和靈敏度。

3 小結與討論

以活性酯法制備的CPPU-H1-OVA為免疫抗原免疫小鼠，獲得的小鼠脾細胞與SP2/0鼠骨髓瘤細胞融合，經(jīng)篩選，得到了一株穩(wěn)定分泌抗CPPU抗體的雜交瘤細胞B7B6 24；將其注射入小鼠腹腔，獲得腹水，經(jīng)鑒定腹水抗體亞型為IgG1，效價為1∶32 000；使用該抗體建立了間接競爭ELISA檢測方法，該方法中最佳包被條件為4 ℃包被12 h、抗原最佳包被濃度2 μg/mL、單克隆抗體稀釋倍數(shù)為1∶32 000、5%脫脂奶粉封閉120 min、采用板內競爭反應模式37 ℃競爭反應90 min、酶標二抗?jié)舛葹?∶4 000、酶標二抗反應時間為60 min，IC50值可以達到3.89 ng/mL；抗體與其它幾種農藥交叉反應很?。黄骄訕嘶厥章蕿?1.4%～112.4%，變異系數(shù)為5.9%～14.4%。因此可以運用本研究所建立的間接競爭ELISA方法對葡萄等果品中CPPU殘留量進行初步檢測與篩選。

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