抗Cetuximab單克隆抗體制備及其雙抗體夾心ELISA檢測方法的建立

王銳　張道旭　張雪亭　梁秋波　李鄭武

[摘 要]本研究利用Cetuximab 3次腹腔免疫6-8周齡BALB/c雌性小鼠。通過雜交瘤技術(shù)、間接ELISA 篩選技術(shù)及腹水制備等技術(shù)制備并獲得抗Cetuximab單克隆抗體。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，通過細(xì)胞融合成功得到三株能穩(wěn)定分泌抗Cetuximab單抗的雜交瘤細(xì)胞株4C5、1F8和4B12，制備的腹水單克隆抗體純化后效價為10-6以上，三株抗體重鏈均為IgG1亞類，輕鏈類型均為k鏈。利用制備的單克隆抗體（Mab）建立Cetuximab單抗雙抗體夾心ELISA檢測方法，試驗(yàn)結(jié)果顯示，該檢測方法特異性良好，不與其他抗體及蛋白發(fā)生交叉反應(yīng)。

[關(guān)鍵詞]Cetuximab 單克隆抗體 雙抗體夾心ELISA

中圖分類號：TM121.1.3 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：B 文章編號：1009-914X（2016）01-0017-01

Cetuximab是治療結(jié)直腸癌的一種治療性生物制品，其能夠與 EGFR 的內(nèi)源性配體EGF、TGF-α 競爭性地與EGFR 胞外配體區(qū)結(jié)合，抑制EGFR自身磷酸化，阻斷下游信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，抑制生長因子激活細(xì)胞有絲分裂信號的下傳，從而抑制腫瘤細(xì)胞增殖，且與抗腫瘤藥物合用具有協(xié)同作用。抗Cetuximab單克隆抗體的制備和其雙抗體檢測方法的建立為開展Cetuximab藥物代謝動力學(xué)研究奠定了基礎(chǔ)。

1、材料

佐劑購自SIGMA公司；西妥西單抗由哈藥集團(tuán)技術(shù)中心制備；6～8周齡Balb/c小鼠購自北京實(shí)驗(yàn)動物研究中心；SP2/0細(xì)胞購自中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院。

2、方法

2.1 單克隆抗體的制備

用純化的Cetuximab按照薩姆布魯克J等[1]報道的方法免疫5只Balb/c小鼠，經(jīng)過3次基礎(chǔ)免疫，選取效價最高（≥10000）的小鼠進(jìn)行強(qiáng)化免疫。3～4天后利用淋巴細(xì)胞雜交瘤技術(shù)進(jìn)行細(xì)胞融合，陽性雜交瘤篩選經(jīng)過3次克隆，挑選獲得的陽性雜交瘤細(xì)胞進(jìn)行亞克隆建庫，陽性克隆細(xì)胞株擴(kuò)大培養(yǎng)后注射Balb/c小鼠腹腔內(nèi)誘生腹水，利用親和層析方法純化所得的小鼠腹水，進(jìn)行SDS-PAGE 純度鑒定和間接ELISA 測定抗體效價。

2.2 雙抗體夾心ELISA檢測方法建立

2.2.1 雙抗體夾心ELISA最佳反應(yīng)條件確定：參考李瑞等（ 2005） 、焦奎等（ 2004） 方法。

2.2.2 雙抗體夾心ELISA方法特異性：按上述ELISA方法對鼠血清、人血清、猴血清、曲妥珠單抗及西妥昔單抗進(jìn)行檢測，以檢驗(yàn)該方法的特異性。

2.2.3 雙抗體夾心ELISA方法的靈敏度：將濃度為4ug/mL的Cetuximab連續(xù)作4倍梯度稀釋，然后按照確定的ELISA反應(yīng)條件進(jìn)行測定。根據(jù)P/N值大于2.1，陽性值大于0.2，檢驗(yàn)該方法的靈敏性。

3、結(jié)果與分析

3.1 單抗制備：通過Balb/c小鼠免疫、細(xì)胞融合、間接ELISA 篩選及細(xì)胞株克隆篩選獲得3株穩(wěn)定分泌Cetuximab單抗的雜交瘤細(xì)胞株4B12、1F8和4C5。用體內(nèi)誘生腹水法分別制備4B12、1F8和4C5三株雜交瘤細(xì)胞的單克隆抗體，電泳純度均在95%以上（電泳結(jié)果見圖1）。純化后腹水抗體效價為10-6以上?？贵w亞類鑒定結(jié)果顯示，所得的單克隆抗體重鏈為IgG1亞類，輕鏈為k鏈?？贵w特異性鑒定結(jié)果顯示，抗體均能與市售西妥西單抗發(fā)生高親和力結(jié)合，但不與鼠IgG1和人IgG1發(fā)生交叉反應(yīng)，說明其具有較好的特異性。

3.2 Cetuximab單抗雙抗體夾心ELISA方法的確定

3.2.1 包被：用碳酸鹽包被液稀釋純化的Cetuximab單抗至濃度1μg/mL，加入96孔酶標(biāo)板，每孔100 μL，4℃包被過夜；

3.2.2 封閉：用PBST洗滌3次，拍干后，每孔加入300 μl 5%脫脂奶粉，37 ℃封閉1 h；

3.2.3 一抗?jié)舛龋篜BST洗滌3次，拍干后，將待檢樣品進(jìn)行1：1000倍稀釋，Cetuximab標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行4倍稀釋（4000～1ng），每孔加入100 μL，37℃孵育1h；

3.2.4 酶標(biāo)二抗：將HRP標(biāo)記羊抗人IgG-Fc抗體1：5000稀釋，每孔加入100 μL，37℃孵育1h；

3.2.5 顯色時間：PBST 洗滌3次，拍干，加入底物液（OPD），室溫避光作用10min；

3.2.6 終止：每孔加入50 μL終止液（2M H2SO4），輕輕振搖混勻，測定OD492 值。

3.3雙抗體夾心ELISA檢測方法特異性的鑒定

試驗(yàn)結(jié)果顯示，檢測樣品中只有市售西妥西單抗出現(xiàn)強(qiáng)陽性反應(yīng)，其他均為陰性，表明此方法特異性較好。結(jié)果見表1。

3.4 雙抗體夾心ELISA 方法靈敏度的測定

將純化抗原的濃度稀釋到4ug/mL，之后連續(xù)作4倍梯度稀釋，按照確定的ELISA 反應(yīng)條件進(jìn)行測定，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，該方法能檢測出約0.89ng / mL 的抗體樣本，顯示出良好的靈敏度。

4、討論

ELISA 檢測方法常受到反應(yīng)溫度、pH、時間、酶標(biāo)板的質(zhì)量等多種因素影響，因此有關(guān)ELISA 的各種條件都需要進(jìn)行優(yōu)化。本研究對所建立的ELISA方法的各步緩沖液系統(tǒng)、溶液濃度、孵育時間等條件進(jìn)行了摸索， 并最終確立反應(yīng)條件。經(jīng)驗(yàn)證，所建立的雙抗體夾心ELISA檢測方法具有良好的靈敏性和特異性，為西妥西單抗的藥代動力學(xué)分析提供物質(zhì)基礎(chǔ)。

參考文獻(xiàn)

[1] 薩姆布魯克 J，拉塞爾 DW（黃培堂，等譯）.分子克隆實(shí)驗(yàn)指南[M].北京：科學(xué)出版社，2002，