糖化血紅蛋白的單克隆抗體制備及鑒定

項岳暉　盧玲玲　涂斐佩等

[摘要] 目的 采用雜交瘤技術制備糖化血紅蛋白的單克隆抗體并對其進行鑒定，為開發(fā)糖化血紅蛋白ELISA 試劑盒提供特異性材料。 方法 通過用順丁烯二酰亞胺法制備免疫抗原，通過BALB/c小鼠進行多層次免疫，通過細胞培養(yǎng)融合，HAT培養(yǎng)基篩選雜交瘤細胞，使用G蛋白層析法、硫酸銨鹽析法等對細胞進行純化。單抗亞類鑒定采用小鼠單克隆抗體亞型鑒定試劑盒。 結果 通過細胞融合、培養(yǎng)、篩選、克隆等，最后篩選出1株能穩(wěn)定分泌特異性抗體的雜交瘤細胞株，命名為N5B4；細胞培養(yǎng)上清液體效價為1∶5000，腹水效價為1∶100萬；通過標準曲線計算樣品中人糖化血紅蛋白的濃度為99.2%。 結論 經過篩選獲得高特異性、高靈敏度的KET單克隆抗體細胞株。

[關鍵詞] 糖化血紅蛋白；單克隆抗體；糖尿病黃斑水腫

[中圖分類號] R446.6 [文獻標識碼] A [文章編號] 1673-9701（2015）11-0022-03

[Abstract] Objective Using hybridoma technique and screened hybridoma cell strains stably， efficiently secreted anti glycosylated hemoglobin monoclonal antibody to provide specific material for the development of glycosylated hemoglobin ELISA kit. Methods The immune antigen was prepared by maleimide method， multi-level immune mice by BALB/c， through cell culture fusion， screening of hybridoma cell culture medium HAT， ammonium sulfate salting out method and G protein chromatography. Monoclonal antibody subclasses were identified by monoclonal antibody subtype identification Kit operation. Results Through cell fusion， screening and cloning culture， etc.， the final selection screened 1 strain stably secreting specific antibody hybridoma cell line， named N5B4； cell culture supernatant liquid was 1∶5000， ascites titer was 1∶100 million； a standard curve to calculate the concentration in the sample human glycated hemoglobin was 99.2%. Conclusion After KET monoclonal antibody cell line to obtain a high specificity and high sensitivity of screening.

[Key words] Glycosylated hemoglobin； Monoclonal antibody； Diabetic macular edema

糖化血紅蛋白（HbA1c）是一種非酶糖化產物，其對氧的親和力明顯高于正常的血紅蛋白，血液中HbA1c水平增高會阻礙氧在組織中擴散，導致組織缺氧壞死。HbA1c水平增高也會加重視網膜缺氧狀態(tài)，進一步加重毛細血管擴張，滲漏明顯增加，最終導致CSME加重和治療效果不佳[1，2]。研究表明，DME治療效果僅與HbA1c水平有關，血糖水平的高低對其無明顯影響，這可能與HbA1c的水平反映測定前8～12周血糖的平均水平，血糖濃度的波動對其影響不大，因此，是一項評估糖尿病控制效果的重要指標[3]。因此檢測HbA1c的水平，對于臨床治療糖尿病性黃斑水腫有極其重要的意義。本研究利用雜交腫瘤技術制備并篩選出高特異性、高靈敏度的KET單克隆抗體細胞株，為開發(fā)糖化血紅蛋白ELISA 試劑盒提供特異性材料，現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

試驗動物為BLAB/c小鼠20只，均購自上海中科院下屬單位上海斯萊克試驗動物中心，周齡8～10周，雌雄各10只。

1.2 方法

1.2.1 抗原制備 多肽鏈N末端纈氨酸上的氨基與葡萄糖C1 發(fā)生糖基化。Cys（SH）用于偶聯(lián)載體蛋白，用順丁烯二酰亞胺法分別偶聯(lián)KLH和BSA，制備出我們所需要的免疫抗原。

1.2.2 動物免疫 取8～10周齡BALB/c小鼠20只，將免疫抗原采用多層次動物免疫方法進行免疫，融合前3 d進行1次強化免疫，增加劑量，不要使用佐劑。

1.2.3 細胞融合 細胞融合過程中應注意幾個問題：①細胞的比例：骨髓瘤細胞與脾細胞的比值可從1∶2～1∶10不等。常用1∶4。②反應時間。③培養(yǎng)液的成分。實驗具體操作如下：將Sp2/o細胞和脾細胞混合，離心，取上清，輕輕搖散底部細胞，慢慢加入PEG（150%，0.7 mL）加完后迅速加入25 mL不含血清的培養(yǎng)基以稀釋PEG（37℃水浴進行），PEG可以造成細胞膜一定程度的損傷，使細胞易于相互黏連而融合在一起，800 rpm/min離心7 min，棄上清，加入HAT培養(yǎng)基，再加到含有飼養(yǎng)細胞的96孔板內，100 μL/孔，5%CO2、37℃培養(yǎng)。

1.2.4 雜交瘤細胞篩選及克隆化培養(yǎng) 采用間接ELISA法對融合后的細胞進行陽性雜交瘤細胞篩選，將篩選出來的細胞進一步使用有限稀釋法進行克隆，然后進行擴大培養(yǎng)，收集并凍存，對其進行鑒定。

1.2.5 單克隆抗體的制備及效價測定 選擇20只小鼠，使用1 mL注射器將0.5 mL液體石蠟注入小鼠腹腔，培養(yǎng)1周后，將雜交瘤細胞注射進入小鼠腹腔，劑量為（1～2）×106個/只，1周后觀察小鼠腹腔腹水生成情況，使用注射器抽取1～2 mL腹水，離心，取上清液。采用間接ELISA法測定效價，以A值大于陰性的2.1倍的稀釋比例的倒數(shù)為該抗體效價，-20℃凍存腹水。

1.2.6 單克隆抗體的純化及亞類鑒定 使用硫酸銨鹽析法和G蛋白層析法對小鼠腹水進行純化，按照小鼠單克隆抗體亞型試劑盒說明書進行操作鑒定。

1.3 統(tǒng)計學方法

使用SPSS21.0軟件包對數(shù)據(jù)進行處理，計數(shù)資料采用χ2檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1細胞融合及篩選

通過細胞融合、培養(yǎng)、篩選、克隆等，最后篩選出1株能穩(wěn)定分泌特異性抗體的雜交瘤細胞株，命名為N5B4。見表1。

2.2單抗的最大稀釋度和腹水效價的測定

細胞培養(yǎng)上清液體效價為1∶5000，腹水效價為1∶100萬。

2.3單克隆抗體鑒定

用酶標儀在450 nm波長下測定吸光度OD值。通過標準曲線計算樣品中人糖化血紅蛋白的濃度為99.2%，不同濃度樣品存放-20℃放置3個月穩(wěn)定性較高，見表2。

3 討論

HbA1c是人體血液中紅細胞內的血紅蛋白與血糖結合的產物，在血液中的濃度與血糖濃度呈正比，且不能進行可逆性結合，其隨著紅細胞消亡而消失，通過檢查HbA1c可以評估采血前2～3個月血糖的平均水平。HbA1c與人體內的代謝有密切關系，當其濃度升高時，可影響紅細胞對氧的親和力，其與氧結合能力較強，容易引起組織與細胞缺氧，導致組織與毛細血管壞死，加速心腦血管并發(fā)癥的形成。HbA1c濃度升高可引起腎小球增厚，引發(fā)糖尿病腎病。另外其還能引起血脂和血粘滯度增高，增加心血管疾病發(fā)生的風險。因此監(jiān)測HbA1c在糖尿病患者病情控制、并發(fā)癥預測、糖尿病患者篩選等方面具有非常重要的作用。國際上已經明確將HbA1c作為糖尿病監(jiān)測的金標準，由于檢測方法尚未完全統(tǒng)一，我國還未將其作為糖尿病的診斷標準。目前臨床上對確診的糖尿病患者進行HbA1c檢測，主要目的在于了解患者近期血糖控制效果，為臨床治療提供參考。將HbA1c檢測結果作為糖尿病病情控制的指標，對糖尿病高危人群開展HbA1c檢測，可以早期發(fā)現(xiàn)糖尿病患者，并對其進行早期治療。

本研究通過采用雜交瘤技術制備糖化血紅蛋白的單克隆抗體并對其進行鑒定，為開發(fā)糖化血紅蛋白ELISA 試劑盒提供特異性材料[4]。本實驗所制備的1株糖化血紅蛋白單克隆抗體具有較強的特異性，經腹水效價測定和競爭ELISA法試驗，結果提示本研究制備篩選出來的HbA1c單克隆抗體具有較好的特異性和敏感性。

本研究采用混合多層次免疫方法（快速免疫佐劑+“油包水”佐劑+脾臟增強），即第一次采用快速免疫佐劑保護免疫原并使抗原快速吸收[5]；第二次采用“油包水”免疫有利于抗原在體內存在時間；第三次采用抗原直接注射脾臟，使短時間內滴度達到最大效果。通過試驗證明，采用混合多層次免疫具有極大的優(yōu)勢：①免疫周期短，與常規(guī)免疫相比可以節(jié)省3～5周免疫時間[5，6]；②抗原用量少，僅為傳統(tǒng)免疫方法的1/3；③不破壞抗原天然構象，易獲得針對天然構象的抗體；④抗體達到的滴度高，有利于得到高靈敏度的單克隆抗體細胞株[7，8]。本項目中通過自制抗原，采用混合多層次免疫方法進行動物免疫，經過雜交瘤融合、單克隆篩選、交叉抑制等等一系列試驗[9，10]，得到的單克隆雜交瘤細胞株應及時凍存，以防止這些細胞的染色體丟失，發(fā)生變異。經過大量的小鼠試驗，我們選擇了以甘油為誘導劑、細胞注射密度5×106為最佳的腹水生產方案[5-7，11]，得到的HbA1c單克隆抗體抗體靈敏度可達99%以上，特異性達98%以上。

總之，本課題制備特異性好、靈敏度高、穩(wěn)定性好的糖化血紅蛋白單克隆抗體，為開發(fā)糖化血紅蛋白ELISA 試劑盒及其他檢測方法提供特異性蛋白原料。

[參考文獻]

[1] Yang W，Lu J，Weng J，et al. Prevalence of diabetes among men and women in China[J]. New England Journal of Medicine，2010，362（12）：1090-1101.

[2] 謝榮榮，潘素芳，于湄. 離子交換HPLC法和親和層析HPLC法檢測糖化血紅蛋白結果的比較和分析[J]. 中國實驗診斷學，2009，10（13）：384-386.

[3] 陳鐵軍，何云霄. 糖化血紅蛋白測定診斷妊娠糖尿病的臨床意義[J]. 中國基層醫(yī)藥，2013，（22）：3130.

[4] Manley SE，Sikaris KA，Lu ZX. Validation of an algorithm combining haemoglobin A（1c） and fasting plasma glucose for diagnosis of diabetes mellitus in UK and Australian populations[J]. Diabetic Medicine，2009，（2）：115-121.

[5] Linlin QR，Li Qiurong，Jiang Haitao，et al. Effect of anti-Mou CD52 monoclonal antibody on mouse intestinal pithelial lymphocyles[J]. Transplantation，2009，88：766-772.

[6] Na Young Ji，Mi Young Park，Yun Hee Kang，et al. Evaluation of annexin Ⅱ as a potentialserum marker for hepatecellular carcinoma using a developed sandwich ELISA method[J]. International Jourhal of Molecular Medicine，2009，24：765-771.

[7] Hung Song，Robert FH，Ravy Vajravelu，et al. Radioimmunotherapy of breast cancer metastases with ot-particle emitter 225Ac：Comparing Emcacy with 213Bi and 90Y[J]. Cancer Research，2009，69（23）：8941-8948.

[8] 索艷. 糖化血紅蛋白測定方法及影響因素的研究進展[J].醫(yī)學研究生學報，2010，（2）：210-213.

[9] 梁霄. 糖化血紅蛋白與空腹血糖聯(lián)合檢測的臨床意義及相關性探討[J]. 臨床誤診誤治，2011，27（11）：87-88.

[10] 國秀芝，邱玲. 保存溫度和時間對全血及血清中腺苷脫氨酶穩(wěn)定性的影響[J]. 現(xiàn)代檢驗醫(yī)學雜志，2009，（5）：106-110.

[11] Song EY，Qu CF，Rizvi SM，et al. Bismuth-213 radioimmunotherapy with C595 anti-MUC1 monoclonal antibody in an ovarian cancer ascites model[J]. Cancer Biol Ther，2008，7（1）：76-80.

（收稿日期：2014-10-15）