基于脂類代謝的DHFR—CHO細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程開(kāi)發(fā)與優(yōu)化

蔣金龍　范里　譚文松

摘要：通過(guò)對(duì)抗體高產(chǎn)（HP）、低產(chǎn)（LP）2個(gè)細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)，2個(gè)過(guò)程中脂類代謝差異明顯。結(jié)果表明，HP中脂類干質(zhì)量遠(yuǎn)大于LP過(guò)程，且其增速也較快，HP中最大脂類干質(zhì)量達(dá)到（83.70±0.04）×10^-9mg/cell，是LP的2.35倍；進(jìn)一步通過(guò)細(xì)胞磷脂尼羅紅熒光染色檢測(cè)細(xì)胞磷脂含量發(fā)現(xiàn)，HP、LP細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中細(xì)胞磷脂差異顯著；隨后對(duì)3種重要磷脂——磷脂酰膽堿（PC）、磷脂酰乙醇胺（PE）、磷脂酰絲氨酸（Ps）的合成前體A（氯化膽堿）、B（乙醇胺）、C（絲氨酸）、D（胞苷）4種因子通過(guò)2水平全析因試驗(yàn)設(shè)計(jì)進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)組分A對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)、抗體表達(dá)影響極顯著（P<0.01）；最后通過(guò)正交試驗(yàn)對(duì)培養(yǎng)基中組分A進(jìn)行濃度優(yōu)化，以找出基礎(chǔ)培養(yǎng)基和流加培養(yǎng)基中組分A的最適濃度。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，基礎(chǔ)培養(yǎng)基中組分A最優(yōu)濃度為95.38 mg/L，流加培養(yǎng)基中最優(yōu)濃度為189 mg/L；最終活細(xì)胞密度對(duì)時(shí)間累積積分（IVCC）達(dá)到79.16×10⁹cells·d/L，提高了74.29%；抗體產(chǎn)量為2.04g/L，增加了1.83倍；抗體比生成速率為34.07 mg/（109 cells·d），提高了18.71%。基于脂類代謝分析，建立了高效經(jīng)濟(jì)的細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程，并為培養(yǎng)基的優(yōu)化提供了依據(jù)，可為后續(xù)大規(guī)模單克隆抗體工業(yè)化生產(chǎn)奠定基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：脂類；細(xì)胞生長(zhǎng)；DHFR-CHO；單克隆抗體；中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞

中圖分類號(hào)：S188；Q952.6 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)：1002—1302（2016）01—0032—04

隨著單克隆抗體藥物市場(chǎng)的迅速發(fā)展，以及對(duì)單克隆藥物要求越來(lái)越高，對(duì)于利用動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)生產(chǎn)單克隆抗體藥物來(lái)說(shuō)既是機(jī)遇又是挑戰(zhàn)。如何在保證細(xì)胞高密度培養(yǎng)的同時(shí)生產(chǎn)出高產(chǎn)量、高質(zhì)量的單克隆抗體，將成為細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)的重點(diǎn)研究課題。作為細(xì)胞培養(yǎng)的關(guān)鍵技術(shù)環(huán)節(jié)，培養(yǎng)過(guò)程和培養(yǎng)基的開(kāi)發(fā)、優(yōu)化尤為關(guān)鍵。脂類作為細(xì)胞膜、線粒體膜等構(gòu)成的生物膜系統(tǒng)的主要組成部分，對(duì)于保證細(xì)胞及亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)的完整性和生物活性有著極其重要的作用，細(xì)胞正常運(yùn)轉(zhuǎn)和存活的先決條件就是這些亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)具有獨(dú)立的空間?？贵w的合成、分泌需要線粒體提供合成原材料和能量，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)提供合成場(chǎng)所和相關(guān)酶，分泌則與高爾基體有關(guān)。Sakai等在研究脂對(duì)產(chǎn)hIFN-γ的CHO細(xì)胞在無(wú)血清培養(yǎng)基中產(chǎn)量的影響時(shí)發(fā)現(xiàn)，加入磷脂酸（磷脂合成前體）使重組蛋白hlFN-γ產(chǎn)量提高了2.4倍。

為此筆者通過(guò)檢測(cè)抗體產(chǎn)量差異顯著的高產(chǎn)（HP）、低產(chǎn)（LP）細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中細(xì)胞脂類、細(xì)胞磷脂含量，進(jìn)一步通過(guò)對(duì)幾種關(guān)鍵磷脂前體[A（氯化膽堿）、B（乙醇胺）、C（絲氨酸）、D（胞苷）]的2水平因子設(shè)計(jì)析因試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)磷脂合成前體組分A對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)、抗體表達(dá)有顯著影響。最后分別在基礎(chǔ)培養(yǎng)基、流加培養(yǎng)基中設(shè)計(jì)4個(gè)添加濃度梯度進(jìn)行正交試驗(yàn)，考察了基礎(chǔ)培養(yǎng)基、流加培養(yǎng)中組分A濃度對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)、抗體表達(dá)的影響，確定了基礎(chǔ)培養(yǎng)基、流加培養(yǎng)基中組分A的最佳添加濃度?；谥惔x的研究開(kāi)發(fā)高效細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程，可為抗體的大規(guī)模生產(chǎn)、培養(yǎng)基優(yōu)化和工藝優(yōu)化提供有力的理論基礎(chǔ)和數(shù)據(jù)支持，對(duì)于單克隆抗體工業(yè)化發(fā)展和其他動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)生產(chǎn)單克隆抗體藥物工業(yè)化具有重要意義。

1材料與方法

1.1細(xì)胞株

試驗(yàn)所用細(xì)胞株為表達(dá)單克隆抗體的DHFR-CHO細(xì)胞株。

1.2培養(yǎng)基

基礎(chǔ)培養(yǎng)基：傳代、種子細(xì)胞培養(yǎng)基為商業(yè)無(wú)血清培養(yǎng)基Hycell（購(gòu)自Thermo Scientific）；試驗(yàn)所用培養(yǎng)基為筆者所在實(shí)驗(yàn)室自主開(kāi)發(fā)的無(wú)血清培養(yǎng)基XP1-CM15。使用的基礎(chǔ)培養(yǎng)基根據(jù)試驗(yàn)要求配制。

流加培養(yǎng)基：采用筆者所在實(shí)驗(yàn)室自主研發(fā)的無(wú)血清流加培養(yǎng)基，主要含有葡萄糖、維生素、氨基酸、磷酸鹽、金屬離子等物質(zhì)的濃縮液。

1.4.3細(xì)胞組成測(cè)定 細(xì)胞脂類含量、細(xì)胞干質(zhì)量均采用Xie等的方法測(cè)定。

1.4.4細(xì)胞磷脂測(cè)定 采用GENMED細(xì)胞磷脂尼羅紅（Nile）熒光染色試劑盒測(cè)定，收集100萬(wàn)個(gè)細(xì)胞，1500 r/min離心5 min，棄上清，加入500μLPBS清洗2遍。具體操作參照說(shuō)明書(shū)。

2結(jié)果與分析

2.1高產(chǎn)、低產(chǎn)細(xì)胞脂類、磷脂檢測(cè)

本試驗(yàn)選取抗體產(chǎn)量差異較大的2個(gè)細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程進(jìn)行檢測(cè)，其中抗體產(chǎn)量高的產(chǎn)量達(dá)到了1.59g/L，是抗體產(chǎn)量低的3倍。分別在培養(yǎng)3、5、7、9、10、12 d檢測(cè)抗體產(chǎn)量差異明顯的2個(gè)細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中脂類干質(zhì)量。由圖1可以看出，隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，HP、LP細(xì)胞脂類含量一直增加；HP脂類含量明顯高于LP，最高脂類含量是LP的2.35倍；在抗體合成階段，HP的脂類合成速率是LP的2.43倍。結(jié)果表明，在抗體合成差異明顯的細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中，其細(xì)胞脂類含量差異明顯。

在HP、LP細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中，通過(guò)細(xì)胞磷脂尼羅紅熒光染色試劑盒檢測(cè)細(xì)胞磷脂含量。由圖2可見(jiàn)，隨著培養(yǎng)時(shí)間增加，細(xì)胞磷脂含量一直增加，HP細(xì)胞磷脂含量明顯高于LP，其最大磷脂含量是LP的1.46倍；在抗體合成階段（從培養(yǎng)6 d到結(jié)束），HP磷脂合成速率是LP的1.32倍。說(shuō)明在抗體合成差異明顯的細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中，細(xì)胞磷脂合成差異明顯。

綜上可知，在抗體產(chǎn)量差異明顯的HP、LP細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中，細(xì)胞脂類代謝（磷脂代謝）表現(xiàn)出明顯差異。Sakai等研究也發(fā)現(xiàn)，脂類物質(zhì)在細(xì)胞生長(zhǎng)和抗體表達(dá)中有重要作用，如細(xì)胞磷脂可作為細(xì)胞信號(hào)分子介導(dǎo)調(diào)控多種細(xì)胞生長(zhǎng)增殖，促進(jìn)抗體表達(dá)分泌。推測(cè)磷脂在細(xì)胞生長(zhǎng)、抗體表達(dá)中有顯著影響，因而進(jìn)一步對(duì)3種重要磷脂的合成前體組分A（氯化膽堿）、B（乙醇胺）、C（絲氨酸）、D（胞苷）進(jìn)行析因分析。

2.2 2水平因子設(shè)計(jì)試驗(yàn)

試驗(yàn)選取3種重要磷脂（磷脂酰乙醇胺、磷脂酰膽堿、磷脂酰絲氨酸）合成前體A、B、C、D 4種試驗(yàn)因子，采用高（1）、低（-1）2個(gè)水平濃度進(jìn)行2水平全析因試驗(yàn)設(shè)計(jì)，進(jìn)行主效應(yīng)因子析因試驗(yàn)。表1為2水平全析因試驗(yàn)設(shè)計(jì)，以IVCC、抗體產(chǎn)量為響應(yīng)值?？梢钥闯?，4種因子對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的IVCC值影響差別不大，但對(duì)抗體產(chǎn)量的影響差異明顯。根據(jù)方差分析（表2）可知，組分A的P值<0.01，說(shuō)明組分A為極顯著影響因子。圖3為2水平因子設(shè)計(jì)試驗(yàn)殘差的正態(tài)分布。點(diǎn)越偏離圖中的線，說(shuō)明影響效應(yīng)越顯著?？梢钥闯?，4種因子中只有組分A為顯著影響因子。

2.3組分A對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)、抗體表達(dá)的影響及濃度優(yōu)化

通過(guò)在基礎(chǔ)培養(yǎng)基（0～200 mg/L）、流加培養(yǎng)基（0～756 mg/L）中分別設(shè)計(jì)4個(gè)濃度兩兩正交來(lái)考察組分A對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)、抗體表達(dá)的影響，并搜尋出組分A的最優(yōu)濃度。試驗(yàn)設(shè)計(jì)見(jiàn)表3。

從表4、圖4可以看出，在培養(yǎng)0～10 d期間，細(xì)胞生長(zhǎng)大致一樣；但在培養(yǎng)10、12 d的2 d內(nèi)，A₁（基礎(chǔ)培養(yǎng)基、流加培養(yǎng)基中均沒(méi)有添加組分A）細(xì)胞密度迅速下降，細(xì)胞大量死亡，從5.32×10⁶ cells/mL降低到0.26×10⁶ cells/mL，下降了95.11%。

除A₁外，在其余試驗(yàn)中細(xì)胞生長(zhǎng)差異不大，說(shuō)明細(xì)胞前期生長(zhǎng)可能對(duì)胞外組分A的需求不大或者不需要胞外組分A；但從培養(yǎng)10 d開(kāi)始，由于組分A的缺失，導(dǎo)致細(xì)胞開(kāi)始表現(xiàn)出不能正常生長(zhǎng)增殖，因此對(duì)細(xì)胞后期生長(zhǎng)維持來(lái)說(shuō)，組分A是不可或缺的，此時(shí)必須有組分A的補(bǔ)充。

隨著組分A濃度的增加，細(xì)胞生長(zhǎng)差異不大，但對(duì)抗體表達(dá)、抗體比生成速率卻有明顯的影響。從圖4中可以看出，抗體產(chǎn)量最高的是C₂處理（基礎(chǔ)培養(yǎng)基中組分A添加濃度為100 mg/L，流加培養(yǎng)基中組分A添加濃度為189 mg/L）。抗體產(chǎn)量高于1g/L的處理大部分集中在中間（B、C 2組），A組（除A₂、A₃處理外）、D2組產(chǎn)量較低，特別是在D組，其抗體產(chǎn)量普遍偏低，說(shuō)明當(dāng)組分A濃度不足或過(guò)高時(shí)，對(duì)細(xì)胞抗體表達(dá)是有抑制作用的。

通過(guò)計(jì)算分析，最終得出基礎(chǔ)培養(yǎng)基中組分A最優(yōu)濃度C_0pt=95.38 mg/L，流加培養(yǎng)中組分A最優(yōu)濃度C′_0pt=189 mg/L。

2.4組分A最優(yōu)濃度驗(yàn)證

在2 L生物反應(yīng)器中對(duì)組分A的最優(yōu)濃度進(jìn)行驗(yàn)證，從圖5可以看出，在最優(yōu)濃度條件下，細(xì)胞最高活細(xì)胞密度達(dá)到7.16×10⁶ cells/mL，細(xì)胞后期維持也比較好，到培養(yǎng)結(jié)束時(shí)，活細(xì)胞密度仍有4.78×10⁶cells/mL，細(xì)胞活性仍在80%以上，細(xì)胞IVCC達(dá)到79.16×10⁹ cells·d/L?？贵w表達(dá)非常理想，最高抗體產(chǎn)量達(dá)到2.04 g/L；抗體表達(dá)階段q_Antibody達(dá)到34.07 mg/（10⁹cells·d）。與之前流加培養(yǎng)基沒(méi)有添加組分A的反應(yīng)器細(xì)胞培養(yǎng)相比，細(xì)胞IVCC是其1.74倍，抗體產(chǎn)量是其2.83倍，q_Antibody是其1.19倍。

3結(jié)論

利用動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)大規(guī)模開(kāi)發(fā)高產(chǎn)的單克隆抗體藥物，已經(jīng)成為當(dāng)今生物制藥的主流，具有強(qiáng)勁的市場(chǎng)競(jìng)爭(zhēng)力。但是抗體類藥物開(kāi)發(fā)成本高、周期長(zhǎng)，遠(yuǎn)不能滿足日益增長(zhǎng)的市場(chǎng)要求?；诩?xì)胞代謝研究，比較抗體表達(dá)差異顯著的2個(gè)細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程，分析培養(yǎng)過(guò)程中有顯著差異的物質(zhì)代謝，考察培養(yǎng)過(guò)程中脂類對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)、抗體表達(dá)的影響并優(yōu)化培養(yǎng)基中脂類合成前體濃度。結(jié)果表明：（1）抗體表達(dá)差異顯著的2個(gè)細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中，細(xì)胞脂類含量（磷脂含量）差異顯著，通過(guò)2水平全析因試驗(yàn)，最終發(fā)現(xiàn)磷脂合成前體組分A對(duì)抗體表達(dá)具有顯著影響。（2）當(dāng)培養(yǎng)基中缺乏組分A濃度，細(xì)胞生長(zhǎng)受到較大影響，當(dāng)培養(yǎng)至10 d時(shí)細(xì)胞密度急劇下降，死細(xì)胞大量增加；培養(yǎng)到12 d時(shí)，細(xì)胞成活率已降為50%以下；隨著組分A濃度的進(jìn)一步增加，細(xì)胞生長(zhǎng)所受影響不大。（3）適當(dāng)提高組分A濃度對(duì)抗體表達(dá)具有明顯促進(jìn)作用，當(dāng)基礎(chǔ)培養(yǎng)組分A濃度為95.38 mg/L時(shí)，流加培養(yǎng)基中組分A添加濃度在189 mg/L時(shí)，IVCC提高了0.74倍，抗體產(chǎn)量提高了1.83倍。

本研究基于脂類代謝的研究，建立了高效的細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程，實(shí)現(xiàn)了培養(yǎng)基營(yíng)養(yǎng)成分的合理設(shè)計(jì)和濃度優(yōu)化，為細(xì)胞培養(yǎng)基的開(kāi)發(fā)和優(yōu)化提供了一種新的方法和依據(jù)，對(duì)后續(xù)抗體類藥物大規(guī)模生產(chǎn)具有重要意義。