復(fù)方芪鷹顆粒對(duì)糖尿病周圍神經(jīng)病變大鼠Hsp70表達(dá)的影響

劉濤+盧軍+石瑩瑩

[摘要] 目的 觀察復(fù)方芪鷹顆粒對(duì)糖尿病周圍神經(jīng)病變（DPN）大鼠坐骨神經(jīng)Hsp70表達(dá)及坐骨神經(jīng)損傷纖維的影響，探討其機(jī)制。 方法 從60只Wistar大鼠中隨機(jī)取出10只為正常組，50只大鼠造DPN模型，將成模43只大鼠隨機(jī)分為模型組（11只）、復(fù)方芪鷹顆粒低劑量組（11只）、復(fù)方芪鷹顆粒中劑量組（11只）、復(fù)方芪鷹顆粒高劑量組（10只），實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，模型組死亡3只，復(fù)方芪鷹顆粒低劑量組死亡1只。復(fù)方芪鷹顆粒低、中、高劑量組分別為1.17、2.34、4.68 g/kg，模型組、正常組均灌以相應(yīng)容積的蒸餾水，1次/d。治療4周后，觀察各組Hsp70表達(dá)、坐骨神經(jīng)損傷纖維變化。 結(jié)果 復(fù)方芪鷹顆粒各劑量組及模型組坐骨神經(jīng)中Hsp70表達(dá)與正常組比較，差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.01）；復(fù)方芪鷹顆粒中、高劑量組坐骨神經(jīng)中Hsp70表達(dá)與模型組比較，差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.01），而中劑量及高劑量組間比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P > 0.05）；復(fù)方芪鷹顆粒各劑量組及模型組與正常組在在坐骨神經(jīng)損傷纖維百分比方面比較，差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.01）；復(fù)方芪鷹顆粒低、中、高劑量組與模型組在坐骨神經(jīng)損傷纖維百分比方面比較，差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.01）。 結(jié)論 復(fù)方芪鷹顆?？赡芡ㄟ^(guò)調(diào)節(jié)DPN大鼠坐骨神經(jīng)Hsp70水平，從而改善受損坐骨神經(jīng)。

[關(guān)鍵詞] 復(fù)方芪鷹顆粒；中藥復(fù)方；糖尿病周圍神經(jīng)病變；Hsp70

[中圖分類號(hào)] R259 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 1673-7210（2017）01（a）-0028-04

[Abstract] Objective To observe the effect of Compound Qiying Granule on the expression of Hsp70 and the injury of sciatic nerve in sciatic nerve of rats with diabetic peripheral neuropathy （DPN） and explore its mechanism. Methods From 60 Wistar rats， 10 rats were taken randomly as normal group， 50 rats were made DPN model， the model of 43 rats were randomly divided into model group （n=11）， low dose group of Compound Qiying Granule （n=11）， medium dose group of Compound Qiying Granule （n=11）， high dose group of Compound Qiying Granule （n=10）， in the course of the experiment， 3 rats died in the model group，1 rat died in low dose group of Compound Qiying Granule. The dose of low， middle and high group were 1.17， 2.34 and 4.68 g/kg respectively. Normal and model groups were given equal volume of distilled water once daily. After 4 weeks treatment， the expression of Hsp70 and the change of sciatic nerve fiber damage were observed. Results The expression of Hsp70 in each dose Compound Qiying Granule group and model group compared with the normal group， the difference was statistically significant （P < 0.01）； the expression of Hsp70 in medium and high dose groups of Compound Qiying Granule compared with the model group， the difference was statistically significant respectively （P < 0.01）， and had no significant difference between medium dose and high dose group （P > 0.05）. The sciatic nerve fiber percentage in each dose Compound Qiying Granule group and model group compared with the normal group， the difference was statistically significant （P < 0.01）； the sciatic nerve fiber percentage in low， medium and high dose group of Compound Qiying Granule compared with the model group， the difference was statistically significant （P < 0.01）. Conclusion The Compound Qiying Granule can improve the Hsp70 of sciatic nerve in DPN rats and improve the injured sciatic nerve.

[Key words] Compound Qiying Granule； Chinese herbal formula； DPN； Hsp70

糖尿病周圍神經(jīng)病變（diabetic peripheral neuropathy，DPN）是糖尿病的常見并發(fā)癥，與周圍神經(jīng)軸突萎縮、脫髓鞘、再生障礙以及神經(jīng)纖維的減少有關(guān)[1-2]，其確切發(fā)病機(jī)制尚不完全清楚[3]。Yorek[4]認(rèn)為，DPN是一種常見的以神經(jīng)退行性病變?yōu)樘攸c(diǎn)的糖尿病并發(fā)癥，多種病理機(jī)制參與致病，所以很難單一用藥物控制。研究發(fā)現(xiàn)，調(diào)節(jié)分子伴侶Hsp70活性的藥物能夠通過(guò)提高DPN的感覺(jué)功能、綜合電生理、生化和形態(tài)指標(biāo)等方面來(lái)達(dá)到廣泛的細(xì)胞保護(hù)作用[5]。復(fù)方芪鷹顆粒作為新疆維吾爾自治區(qū)中醫(yī)醫(yī)院（以下簡(jiǎn)稱“我院”）院內(nèi)制劑，被廣泛應(yīng)用于DPN的治療中。前期實(shí)驗(yàn)及臨床研究顯示，該藥能加快感覺(jué)及運(yùn)動(dòng)神經(jīng)傳導(dǎo)速度，升高血清中血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子水平，降低血清同型半胱氨酸水平，增加Na+/K+-ATP酶的活性及胰島素樣生長(zhǎng)因子-1水平等多方面的作用，從而減輕患者臨床癥狀[6-11]。因此，基于該藥的多靶點(diǎn)特性，本課題通過(guò)研究復(fù)方芪鷹顆粒對(duì)DPN大鼠分子伴侶Hsp70調(diào)節(jié)，揭示其對(duì)DPN的治療途徑與作用靶點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

8周齡SPF級(jí)雄性Wistar大鼠60只，體重130～170 g，由新疆維吾爾自治區(qū)疾病控制中心提供。許可證號(hào)SCXK新2005-006。

1.2 實(shí)驗(yàn)藥物

復(fù)方芪鷹顆粒，由我院研制，批號(hào)ZJ2012006。

1.3 主要試劑與儀器

鏈脲佐菌素（STZ）購(gòu)于Sigma公司、Hsp70抗體（Sigma公司），SP-9000免疫組化試劑及DAB顯色劑（中杉金橋）、PBS、TBS緩沖液（Boster公司）。石蠟切片機(jī)（Rm-2135型，德國(guó)Leica公司）；光學(xué)顯微鏡，CX21型，日本奧林巴斯公司。顯微成像系統(tǒng)，DM-500，德國(guó)萊卡公司。血糖儀，4297A型，臺(tái)灣博士醫(yī)生。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 動(dòng)物模型

1.4.1.1 2型糖尿病模型 造模過(guò)程參考本課題組前期工作[11]。造模大鼠持續(xù)喂以高脂飼料（其中含70%碳水化合物、20%蔗糖，10%豬油）8周。8周后，大鼠禁食14 h后腹腔注射小劑量STZ 35 mg/kg（STZ溶于0.1 mol/L，pH=4.5的枸櫞酸緩沖液，配制為1%的溶液）進(jìn)行造模。之后監(jiān)測(cè)大鼠空腹血糖，選取空腹血糖高于11.1 mol/L的大鼠作為糖尿病模型大鼠。

為防止糖尿病大鼠因血糖過(guò)高而無(wú)法存活至實(shí)驗(yàn)終點(diǎn)，根據(jù)所測(cè)得的血糖水平予以精蛋白鋅胰島素注射液1～4 U，1 次/d，皮下注射，維持血糖在20.0～25.0 mmol/L（糖尿病組及各治療組均有此情況）。

1.4.1.2 DPN大鼠模型 在2型糖尿病大鼠的基礎(chǔ)上繼續(xù)高脂飲食4周，之后應(yīng)用Meditronic keypoint-4 workstation肌電圖儀測(cè)定糖尿病大鼠下肢坐骨神經(jīng)的感覺(jué)和運(yùn)動(dòng)傳導(dǎo)速度，糖尿病大鼠造模成功后測(cè)定感覺(jué)或運(yùn)動(dòng)傳導(dǎo)速度減慢超過(guò)11%，即可判定為成功的DPN大鼠模型[12-13]。

1.4.2 分組與給藥

從60只8周齡大鼠中隨機(jī)取10只為正常組；50只造模，造模成功43只，隨機(jī)分為4組：模型組（11只）、復(fù)方芪鷹顆粒低劑量組（11只）、復(fù)方芪鷹顆粒中劑量組（11只）、復(fù)方芪鷹顆粒高劑量組（10只）。

復(fù)方芪鷹顆粒治療組（1.17、2.34、4.68 g/kg，用純水分別配為8.45%、16.9%、33.8%的溶液），模型組、正常組均灌以相應(yīng)容積的蒸餾水，1次/d，每次2 mL灌胃。連續(xù)用藥4周，實(shí)驗(yàn)期間全部大鼠予普通飼料喂養(yǎng)，自由進(jìn)食和水。

1.4.3 留取標(biāo)本

所有實(shí)驗(yàn)大鼠均在用藥4周后處死。將大鼠予10%水合氯醛（350 mg/kg）麻醉，俯臥位固定于手術(shù)臺(tái)上。開腹、開胸暴露心臟，將針頭經(jīng)心尖處插進(jìn)左心室，剪開右心耳，給予37℃生理鹽水灌流，直至流出液無(wú)色為止。繼續(xù)給予4℃、4%多聚甲醛和2.5%戊二醛混合固定液40 mL左右灌流固定，直至大鼠身體變硬為止。固定脊椎，于股骨干后外側(cè)剪開股二頭肌與半膜肌之間的皮膚，于大鼠股外側(cè)肌間隙進(jìn)入，并沿兩股間鈍性分離，暴露坐骨神經(jīng)，沿坐骨神經(jīng)向腰椎內(nèi)將神經(jīng)用力拉出，找到膨大的背根神經(jīng)節(jié)，用銳利刀片切取神經(jīng)節(jié)組織，留取坐骨結(jié)節(jié)至遠(yuǎn)端脛腓神經(jīng)分叉處的坐骨神經(jīng)。將組織置于凍存管內(nèi)，-80°凍存，備用。

1.4.4 檢測(cè)指標(biāo)

1.4.4.1 Hsp70表達(dá)測(cè)定 Hsp70的免疫組化及平均光密度測(cè)定參考文獻(xiàn)[14-15]。

1.4.4.2 大鼠坐骨神經(jīng)損傷纖維 取大鼠左側(cè)從坐骨結(jié)節(jié)至遠(yuǎn)端脛腓神經(jīng)分叉處的坐骨神經(jīng)，4%甲醛固定，并逐級(jí)酒精脫水，12 h后取出，蠟塊包埋，切片，Kullshitzky髓鞘染色法染色，用光鏡觀察坐骨神經(jīng)髓鞘的病理變化及藥物的影響。在每一神經(jīng)標(biāo)本縱切片上觀察25根有髓神經(jīng)纖維，計(jì)數(shù)發(fā)生神經(jīng)病變（結(jié)周脫髓鞘、磷脂過(guò)度皺褶、結(jié)間隙增多、節(jié)段性脫髓鞘、髓鞘發(fā)生潰變/Wallerian變性）的纖維，計(jì)算其占總纖維數(shù)的百分率。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，各組實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，方差齊時(shí)采用t檢驗(yàn)；方差不齊時(shí)用秩和檢驗(yàn)。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05，以P < 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 一般狀況

正常組大鼠的一般狀況良好，模型組大鼠出現(xiàn)消瘦、多食、多尿癥狀，各治療組大鼠在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，癥狀均較模型組大鼠輕。在實(shí)驗(yàn)期間，模型組死亡3只，復(fù)方芪鷹顆粒小劑量組死亡1只。

2.2 各組坐骨神經(jīng)Hsp70表達(dá)水平的比較

復(fù)方芪鷹顆粒各劑量組及模型組大鼠坐骨神經(jīng)Hsp70表達(dá)與正常組比較，差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.01）；復(fù)方芪鷹顆粒中、高劑量組大鼠坐骨神經(jīng)Hsp70表達(dá)與模型組比較，差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.01），而復(fù)方芪鷹顆粒中劑量及復(fù)方芪鷹顆粒高劑量組間比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P > 0.05）。見表1。

2.3復(fù)方芪鷹顆粒對(duì)大鼠坐骨神經(jīng)損傷神經(jīng)纖維的影響

復(fù)方芪鷹顆粒各劑量組及模型組坐骨神經(jīng)損傷纖維百分比與正常組比較，差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.01）；復(fù)方芪鷹顆粒低、中、高劑量組坐骨神經(jīng)損傷纖維百分比與模型組比較，差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.01）。見表2。

3 討論

Hsp70是一個(gè)重要的神經(jīng)保護(hù)分子伴侶，其蛋白結(jié)構(gòu)主要包括一個(gè)N端約450個(gè)氨基酸殘基的高度保守的ATPase功能域和一個(gè)C端約200個(gè)氨基酸殘基的相對(duì)保守的區(qū)域（肽鏈結(jié)合區(qū)），主要是通過(guò)幫助蛋白質(zhì)復(fù)性的作用機(jī)制，減少神經(jīng)退行性疾病[16]。在應(yīng)激條件下，Hsp70可快速轉(zhuǎn)移至細(xì)胞核、核仁等附近區(qū)域，并可經(jīng)細(xì)胞質(zhì)進(jìn)入細(xì)胞核，與變性蛋白疏水區(qū)結(jié)合，限制其相互聚合并解聚已聚合蛋白，恢復(fù)正常三級(jí)結(jié)構(gòu)。研究表明，Hsp70主要通過(guò)抑制炎癥信號(hào)通路（核因子-κB）而抑制腦內(nèi)炎癥反應(yīng)，從而發(fā)揮保護(hù)神經(jīng)元的作用[17]。盡管DPN的病因沒(méi)有與某一個(gè)特定的錯(cuò)誤折疊或聚集蛋白聚合相關(guān)，高血糖會(huì)增加氧化應(yīng)激，氨基酸的氧化修飾，可妨礙蛋白質(zhì)折疊，降低線粒體功能和蛋白導(dǎo)入，增強(qiáng)與分子伴侶的相互作用[18-19]。分子伴侶的調(diào)節(jié)可以改善DPN中因營(yíng)養(yǎng)受損的周圍神經(jīng)的胰島素信號(hào)[20]。因此，調(diào)節(jié)分子伴侶Hsp70對(duì)于治療DPN有重要作用。

復(fù)方芪鷹顆粒是胡曉靈主任醫(yī)師根據(jù)中醫(yī)理論，結(jié)合DPN的特點(diǎn)，長(zhǎng)期應(yīng)用于臨床，療效顯著[6-10]。它是以消渴為本，痿痹為標(biāo)，以氣陰兩虛、痰瘀阻滯、風(fēng)伏絡(luò)瘀為根本病機(jī)，以益氣養(yǎng)陰、祛瘀化痰、疏風(fēng)通絡(luò)為法組方，精選黃芪、黃精、鷹嘴豆、丹參、蟬蛻五味中藥。君藥黃芪甘而微溫，歸脾肺經(jīng)，功擅補(bǔ)中益氣健脾，向?yàn)檠a(bǔ)氣之主將?！秳e錄》謂其“補(bǔ)丈夫虛損，五勞贏瘦，止渴”；《日華子本草》稱其可“助氣，壯筋骨，長(zhǎng)肉，補(bǔ)血”。由是觀之，黃芪之補(bǔ)氣，本可生津以療消渴，亦可養(yǎng)血生肌壯筋以起痿癥，又能祛風(fēng)調(diào)營(yíng)達(dá)衛(wèi)而治痹癥。臣藥黃精甘平，歸脾肺腎經(jīng)，功可補(bǔ)氣養(yǎng)陰，健脾潤(rùn)肺益腎?！度杖A子本草》稱之可“補(bǔ)五勞七傷，助筋骨，生肌，耐寒暑，益脾胃，潤(rùn)心肺”；《本草綱目》謂其“補(bǔ)諸虛……填精髓”。本品不僅能補(bǔ)益肺腎之陰，而且能補(bǔ)益脾氣脾陰，常與黃芪合用，治療氣虛津虧之消渴。臣藥鷹嘴豆性味甘平，無(wú)毒，具有補(bǔ)中益氣、溫腎壯陽(yáng)、活血解毒、潤(rùn)肺止咳等作用。維吾爾語(yǔ)稱之為“諾胡提”，在阿維森納《醫(yī)典》及《膳食正要》《本草拾遺》等典籍中均有記述，是藥食兼用珍品。本方選用鷹嘴豆，一者與黃精相伍，協(xié)助君藥，共奏補(bǔ)中益氣之功，用作臣藥；兩者與丹參相合，助其通行血脈之力，兼充佐藥之職。佐藥丹參苦微寒，歸心肝心包經(jīng)，功可活血祛瘀止痛，涼血消癰，除煩安神。本品善能通行血脈，祛瘀止痛，廣泛應(yīng)用于各種瘀血病證。因其性偏寒涼，對(duì)血熱瘀滯之證尤為相宜。佐藥蟬蛻甘寒，歸肺肝經(jīng)，功可疏散風(fēng)熱，息風(fēng)止痙?！侗静菥V目》謂其“治頭風(fēng)眩運(yùn)，皮膚風(fēng)熱，痘疹作癢，破傷風(fēng)及疔腫毒瘡，大人失音，小兒噤風(fēng)天吊，驚哭夜啼，陰腫”。本品甘寒入肺經(jīng)，可祛肺經(jīng)風(fēng)熱，入肝經(jīng)，可通絡(luò)止痙?！锻饪普凇废L(fēng)散治風(fēng)濕浸淫肌膚血脈，皮膚瘙癢，即用本品疏散肌膚風(fēng)邪。復(fù)方芪鷹顆粒取蟬蛻為佐藥，蓋以消渴痿痹風(fēng)邪伏于四肢肌膚絡(luò)脈之內(nèi)，非輕清疏達(dá)之品不辦，蟬蛻性能功治，正可當(dāng)之?，F(xiàn)代藥理研究發(fā)現(xiàn)，黃精、黃芪、丹參、蟬衣、鷹嘴豆對(duì)本病均有一定的治療作用。

本實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，復(fù)方芪鷹顆粒中、高劑量組與模型組在大鼠坐骨神經(jīng)的Hsp70表達(dá)方面比較，差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.01），而中劑量及高劑量間比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P > 0.05），提示復(fù)方芪鷹顆粒能夠提高Hsp70的水平。而對(duì)于坐骨神經(jīng)損傷纖維的影響，復(fù)方芪鷹顆粒低、中、高劑量組與模型組比較，差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.01），提示復(fù)方芪鷹顆粒具有減少坐骨神經(jīng)損傷纖維作用，其原因可能與該藥能夠提高Hsp70的表達(dá)有關(guān)。Hsp70的表達(dá)上調(diào)能夠防止神經(jīng)細(xì)胞凋亡[21]，減少神經(jīng)退行性疾病的氧化應(yīng)激反應(yīng)[22]。最近研究支持Hsp70的表達(dá)可以通過(guò)加速c-Jun的蛋白酶體降解，防止神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白1（NRG1）誘導(dǎo)周圍神經(jīng)的脫髓鞘[23]。而Kirkegaard等[24]報(bào)道，Hsp70可通過(guò)穩(wěn)定溶酶體膜，阻止溶酶體蛋白酶釋放入胞漿，從而抑制經(jīng)溶酶體通路誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。因此，Hsp70對(duì)于神經(jīng)的保護(hù)不僅因?yàn)榉肿影閭H的作用，還有其抑制凋亡的作用。該藥物具體機(jī)制可能是高表達(dá)的Hsp70幫助受損周圍神經(jīng)細(xì)胞中錯(cuò)誤蛋白質(zhì)的折疊發(fā)揮了分子伴侶的作用，改善了線粒體功能，阻止了細(xì)胞凋亡，修復(fù)了受損的周圍神經(jīng)的胰島素信號(hào)傳導(dǎo)[18-19]，防止了周圍神經(jīng)軸突萎縮、脫髓鞘、再生障礙，從而達(dá)到治療DPN的目的。

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（收稿日期：2016-09-16 本文編輯：王紅雙）