烏蘇里蝮蛇血凝酶的分離純化和質(zhì)量研究

張雪玲+崔艷+崔愛湜

[摘要] 目的 建立一種分離純化烏蘇里蝮蛇血凝酶（WH）的方法并為其制定質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。 方法 先后采用分子篩層析法、離子交換色譜法、親和層析法從烏蘇里蝮蛇毒中分離純化得到一種具有凝血活性的酶成分，并采用SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳法、RP-HPLC法測定其純度，HPSEC法測定其分子量，IEF法測定其等電點，Lowry法測定其蛋白濃度，并用標(biāo)準(zhǔn)人血漿法測定該酶的比活力。 結(jié)果 從烏蘇里蝮蛇蛇毒中分離純化了一種凝血酶成分，SDS-Page顯示為一條帶、測得分子量約為34 kD，RP-HPLC得到單一的色譜峰，HPSEC法測得該酶分子量為34.7 kD，等電點為5.25，此酶具有體外凝血活性，比活力為5.40 μg/U。 結(jié)論 該方法可用于WH的分離純化，制定的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)可用于控制該血凝酶的質(zhì)量。

[關(guān)鍵詞] 烏蘇里蝮蛇；血凝酶；分離純化；質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)

[中圖分類號] R282.740.2 [文獻標(biāo)識碼] A [文章編號] 1673-7210（2017）01（a）-0020-05

[Abstract] Objective To establish a method of purification and quality standards for Wusuli haemocoagulase. Methods A component of enzyme with the clotting activity was isolated from Wusuli viper by gel filtration and anion-exchange chromatography and heparin-Sepharose affinity chromatography. SDS-Page and RP-HPLC were used to determine its purity. HPSEC was used to determine the molecular weight. IEF method was used to measure the isoelectric point while its protein concentration was determined by the Lowry method. Standard human plasma method was used to determine the specific activity of the enzyme. Results A kind of thrombin was purified from Wusuli viper. One band was displaied on SDS-Page and the molecular weight was about 34 kD. RP-HPLC got one single chromatographic peak. The molecular weight of this enzyme was measured by HPSEC method was 34.7 kD and the isoelectric point was 5.25. This enzyme possesses the characteristion of extractor clotting activity and its specific activity was 5.40 μg/U. Conclusion This method can be used for Wusuli haemocoagulase separation and purification. And this quality standards can be used to control the quality of this haemocoagulase.

[Key words] Wusuli viper； Haemocoagulase； Separation and purification； Quality standards

我國具有十分豐富的蛇類資源，全世界已知的蛇種有10科2200多種，而我國擁有7科175種之多，而且我國也是最早將蛇毒應(yīng)用于醫(yī)療的國家[1]。蛇毒類凝血酶作為一種動物來源的蛋白酶類止血藥，由于其毒性低、起效快、藥效持久且不引起血管內(nèi)栓塞等優(yōu)點，近年來已經(jīng)引起了人們的極大關(guān)注[2]。烏蘇里蝮蛇（拉丁學(xué)名Gloydius Ussuriensis），主要分布在東北及內(nèi)蒙古東部地區(qū)，是一種體型較小的血循類毒蛇[3]。本文從烏蘇里蝮蛇蛇毒中提取血凝酶，且提取的酶純度高，止血效果明顯，提取純化工藝簡便可靠，可用于大批量生產(chǎn)。鑒于未檢索到有關(guān)該酶質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)方面的文獻，本文還為該酶建立了完整的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，能夠更好地控制該產(chǎn)品的質(zhì)量，也為其建立質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，為蛇毒血凝酶類新藥的開發(fā)和質(zhì)量控制提供技術(shù)依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

VFD-1000真空冷凍干燥機（北京博醫(yī)康）；ROTINA 380R冷凍高速離心機（德國Hettich）；BP 211D電子天平（德國Sartorius）；EPS 601型多功能電泳儀及電泳槽及制膠模具（美國Amersham Pharmacia Biotech公司）；Waters e2695+e2489高效液相色譜儀（美國Waters）；UV 2550紫外可見分光光度計（日本島津）；Sephadex G-50凝膠層析柱，Sephadex A-25離子交換層析柱，肝素-Sepharose親和層析柱（美國GE公司）；3.5 kD透析袋（瑞典Pharmacia）；3 kD離心超濾管（美國Millipore公司）；Vydac 208TP54-C8（5 μm，250 mm×4.6 mm）色譜柱；TSK-gel G3000Swxl（7.8 mm×300 mm）色譜柱。

1.2 試藥

蛇毒（產(chǎn)自東北黑龍江省烏蘇里蝮蛇蛇毒，采毒后經(jīng)冷凍干燥備用，批號20150702）；低分子量Maker（GE Healthcare，17-0446-01）；IEF Maker（等電點范圍pH3～10，16-39212-01）及兩性電解質(zhì)溶液均購自GE公司（批號9909-1504）；標(biāo)準(zhǔn)分子量Maker（670、158、44、17、1.3 kD）（Sigma，P0061-11）；標(biāo)準(zhǔn)人血漿（Standard Plasma，Siemens，2015-08-28）；福林酚試液（Sigma，40N5589），其余試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 Sephadex G-50凝膠層析

Sephadex G-50凝膠層析柱，用pH 7.8，0.05 mol/L Tris-HCl緩沖液平衡。稱取烏蘇里蝮蛇蛇毒凍干粉1 g，溶解于2 mL上述緩沖液中，4℃、4000 r/min離心10 min，將上清液上樣，流速0.3 mL/min，1 mL/管收集流出液，做體外凝血試驗。

2.2 Sephadex A-25離子交換層析

將上述凝血活性最強的收集液于4℃、4000 r/min離心10 min，取上清液置3 kD超濾管中超濾濃縮，待純化。Sephadex A-25柱用pH 7.6，0.05 mol/L Tris-HCl緩沖液平衡，將超濾濃縮液上柱，用上述緩沖液洗脫，流速0.5 mL/min，1 mL/管，測各管體外凝結(jié)活性，收集活性最強組分，將此溶液超濾濃縮，4℃下用水透析24 h，期間換3次水，冷凍干燥，制得純化的烏蘇里蝮蛇血凝酶（Wusuli haemocoagulase，WH），待分析。

2.3 肝素-Sepharose親和層析

肝素-Sepharose親和層析柱用pH 7.6，0.05 mol/L Tris-HCl緩沖液平衡。將上一步收集的收集液冷凍干燥，用上述緩沖液溶解，并在4℃下透析24 h，4℃、4000 r/min離心10 min，取上清液上柱，用上述緩沖液洗脫，流速1 mL/min，1 mL/管，測各管體外凝結(jié)活性，收集活性最強組分即為純化的血凝酶活性成分，將此溶液超濾濃縮，4℃下用水透析24 h，期間換3次水，冷凍干燥，制得純化的WH，待分析。

2.4 SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳法測定純度及分子量

參照Ame rsham Pharmacia 公司的蛋白電泳技術(shù)手冊[4]操作。采用SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳法，濃縮膠5%，分離膠10%，還原電泳，考馬斯亮藍染色，檢測純化組分的純度。同時以低分子量Maker蛋白繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算該組分的分子量。電泳結(jié)果見圖1。由圖可見經(jīng)純化的組分電泳顯示為一條帶，純度良好，分子量約為34 kD。

2.5 RP-HPLC法測定其純度

采用高效液相色譜法，Vydac 208TP54-C8（5 μm，250 mm×4.6 mm）色譜柱，流動相為0.05%三氟乙酸-85%乙腈（含0.05%三氟乙酸）（50∶50），流速1.0 mL/min，柱溫40℃，檢測波長為280 nm，進樣量為50 μL，注入液相色譜儀測定，色譜圖見圖2。由色譜圖可知，該色譜條件下WH顯示單一色譜峰，表明純化后得到的蛋白質(zhì)純度良好。

2.6 HPSEC法測定分子量

采用空間排阻色譜法，以TSK-gel G3000Swxl（7.8 mm×300 mm）為色譜柱，以55 mmol/L枸櫞酸鈉-0.01%Tween80溶液[pH6.3±0.1（稱取二水合枸櫞酸鈉15.15 g，一水合枸櫞酸0.74 g，加入0.5 mL 20% Tween80，加水800 mL溶解，用1 mol/L枸櫞酸或10%氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH至6.3±0.1，用水定容至1000 mL，經(jīng)0.2 μm濾膜過濾）]為流動相，流速為0.5 mL/min，柱溫為室溫，檢測波長為280 nm。以標(biāo)準(zhǔn)分子量Maker（670、158、44、17、1.3 kD）（Sigma）為對照，并以保留時間為橫坐標(biāo)，以分子量對數(shù)為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。得到該酶的分子量為34.7 kD，與SDS-Page法測得的分子量相吻合。

2.7 IEF法測定等電點

采用IEF電泳法測定該酶等電點，以10%丙烯酰胺貯液-兩性電解質(zhì)-50%甘油-超純水-10%過硫酸銨（AP）-四甲基乙二胺（TEMED）-按2.5∶0.35∶0.5∶1.25∶0.025∶0.006的比例混合均勻為凝膠液制成電泳膠，200 V預(yù)電泳至電流降至1.0 mA左右，200 V恒壓電泳，使電流降至1.0 mA左右。再根據(jù)情況升高電壓，直至電流不再降低為止，固定30 min，考馬斯亮藍染色60 min，脫色液中脫色至本底無色。IEF電泳圖見圖3。結(jié)果可見WH的等電點為5.25。

2.8 Lowry法測定蛋白濃度

根據(jù)《中國藥典》中規(guī)定的Lowry法[7]，檢測WH的蛋白濃度。

堿性銅試液配制：稱取氫氧化鈉10 g，碳酸鈉50 g，加水400 mL使之溶解，作為甲液。稱取酒石酸鉀0.5 g，加水50 mL使之溶解，另取硫酸銅0.25 g，加水30 mL使之溶解，將兩液混合作為乙液。臨用前，合并甲、乙液，并加水至500 mL。

對照品儲備液的配制：取牛纖維蛋白原20 mg精密稱定，置100 mL量瓶中，加水溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為對照品儲備液。

樣品溶液的配制：取WH約10 mg精密稱定，置100 mL量瓶中，加水溶解并稀釋至刻度，搖勻。精密量取10 mL，置100 mL量瓶中，加水稀釋至刻度，搖勻。

精密量取對照品儲備液0.25、0.5、1、1.5、2 mL，置10 mL量瓶中，加水稀釋至刻度，即濃度為5、10、20、30、40 μg/mL濃度的溶液。分別精密量取上述各溶液1 mL置具塞試管中，分別加入堿性銅試液1.0 mL，搖勻，各加入福林酚試液4.0 mL，立即混勻，置55℃水浴中準(zhǔn)確反應(yīng)5 min，置冰水浴10 min，照紫外可見分光光度法，在650 nm的波長處測定吸收度。以對照品溶液濃度C為橫坐標(biāo)，其對應(yīng)的吸光度A為縱坐標(biāo)計算線性回歸方程和相關(guān)系數(shù)，得線性回歸方程和相關(guān)系數(shù)分別為：A=8.352×10-3C-1.214×10-3，r2=0.9991。見圖4。

另精密量樣品溶液1 mL，同法測定。從線性回歸方程計算溶液中的蛋白質(zhì)濃度，結(jié)果得蛋白濃度為99.9%。

2.9 酶比活力測定

1個蛇毒血凝酶單位是指在（37±0.5）℃條件下，能使1 mL標(biāo)準(zhǔn)人血漿在（60±20）s內(nèi)振搖出現(xiàn)白色絮團時蛇毒血凝酶的量。比活力公式為：比活力=供試品中蛋白的微克數(shù)/供試品中的效價。

標(biāo)準(zhǔn)人血漿的配制：取標(biāo)準(zhǔn)人血漿1支，加水1.0 mL使溶解，即得。樣品溶液的配制：稱取WH適量，加水溶解并稀釋成5.40 μg/mL的溶液，即得。精密量取標(biāo)準(zhǔn)人血漿1 mL，置小試管中（37±0.5）℃水浴中保溫2 min，精密加入樣品溶液1 mL，立即搖勻，同時計時，于（37±0.5）℃水浴中觀察血漿應(yīng)在（60±20）s內(nèi)振搖出現(xiàn)白色絮團。依據(jù)“2.8”項下測定的蛋白量，計算樣品溶液中每單位蛋白微克數(shù)，得到WH的比活力為5.40 μg/U。

2.10 對牛纖維蛋白原作用方式分析

纖維蛋白原是一種由肝臟合成的具有凝血功能的蛋白質(zhì)，是纖維蛋白的前體。分子量約34 kD，血漿中參考值2～4 g/L。纖維蛋白原由α、β、γ三對不同多肽鏈所組成，多肽鏈間以二硫鍵相連。在凝血酶作用下，α鏈或β鏈分別釋放出A肽與B肽，生成纖維蛋白單體。在此過程中，由于釋放了酸性多肽，負電性降低，單體易于聚合成纖維蛋白多聚體。但此時單體之間借氫鍵與疏水鍵相連，尚可溶于稀酸和尿素溶液中。進一步在Ca2+與活化的因子作用下，單體之間以共價鍵相連，則變成穩(wěn)定的不溶性纖維蛋白凝塊，完成凝血過程。本試驗采用SDS-Page法考察了該酶對牛纖維蛋白原的作用方式，反應(yīng)時間為5、10、30 min，電泳結(jié)果見圖5。由結(jié)果可見牛纖維蛋白原的β和γ鏈在整個反應(yīng)過程中沒有發(fā)生變化，而反應(yīng)5 min時，原本α鏈的位置條帶消失，在分子量較小的位置（α與β鏈之間）出現(xiàn)一個新的條帶，且作用效果與20、30 min幾乎相同，這可能是WH作用于纖維蛋白原α鏈，并釋放出一個肽段的結(jié)果。由此得知，WH只作用于纖維蛋白原的α鏈，且作用時間非?？?，5 min內(nèi)即發(fā)生作用，由于該反應(yīng)專屬性強，因此該性質(zhì)可以作為該酶的特異性鑒別。

3 討論

蛇毒是一類復(fù)雜的混合物，因此應(yīng)用單一的層析方法很難將蛇毒血凝酶分離純化。另外，蛇毒來源的不同，血凝酶的分離純化方式也多種多樣。本文先后采用Sephadex G-50凝膠層析、Sephadex A-25離子交換層析法、肝素-Sepharose親和層析法從烏蘇里蝮蛇毒中分離純化得到一種具有有凝血活性的酶成分，且純度良好，體外凝血試驗效果明顯。

我國蛇資源十分豐富，其中有蛇島蜊蛇、白眉蝮蛇、尖吻蝮蛇、黑眉蝮蛇、江浙蝮蛇等，蛇毒類藥物的研究和應(yīng)用目前也受到大家的廣泛關(guān)注[6-15]，并且有很多蛇毒類藥物已被應(yīng)用于臨床且收到了很好的臨床療效[16-21]。而生長在東北及內(nèi)蒙古東部地區(qū)的烏蘇里蝮蛇蛇毒是生產(chǎn)蛇毒類血凝酶的優(yōu)質(zhì)原料，其蛇毒類血凝酶含量高，原毒的毒副作用小，藥用價值高。但是長期以來因技術(shù)原因，不能大規(guī)模生產(chǎn)應(yīng)用，加之使用粗提物的傳統(tǒng)習(xí)慣，限制了我國蛇毒資源的深入研究和科學(xué)利用。本文方法所收集的酶組分純度高，且該方法具有效果穩(wěn)定、重復(fù)性較好、分辨率較高、簡便、經(jīng)濟、操作周期較短等優(yōu)點。該技術(shù)的成功對我國蛇毒資源的利用和蛇毒類血凝酶學(xué)研究均有深遠的意義。

本論文還針對WH的分子量、純度、蛋白濃度、比活力、等電點、對牛纖維蛋白原作用方式等性質(zhì)進行了研究，為該酶質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的制定提供了科學(xué)依據(jù)。其中對牛纖維蛋白原作用方式可作為鑒別項，分子量、純度、等電點可作為檢查項，蛋白濃度、比活力可作為該酶的含量測定項，已能較全面地控制該酶的質(zhì)量。

[參考文獻]

[1] 陳建智.蛇毒的研究和應(yīng)用[J].蛇志，1989，1（1）：22-23.

[2] 傅宏義，周磊.蛇毒類凝血酶的研究進展[J].中國藥學(xué)雜志，2008，43（4）：245-247.

[3] 李建立，刁揚.烏蘇里蝮蛇采毒周期對排毒量的影響[J].蛇志，2003，15（3）：14-16.

[4] Amer sham pharmacia biotech. Protein elect rophoresis technical manual [M]. New York：Amer sham Pha rmacia Bio tech，1999：13.

[5] 國家藥典委員會.中國藥典[M].四部.北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2015：96-97.

[6] 牟萍，尹家榮，侯瑞鵬，等.長白山白眉蝮蛇毒類凝血酶的分離純化[J].錦州醫(yī)學(xué)院學(xué)報，2015，26（5）：39-42.

[7] 鐘讀波，吳遠雙，余旭亞，等.長白山白眉蝮蛇蛇毒中類凝血酶的分離純化方法研究[J].中國藥房，2007，18（36）：2825-2828.

[8] 黃瑩.尖吻蝮蛇血凝酶的生化及免疫學(xué)特性研究[D].廣州：南方醫(yī)科大學(xué)，2013.

[9] 左軍，馬骉，姜桂榮，等.東北白眉腹蛇毒類凝血酶的分離純化[J].哈爾濱學(xué)院學(xué)報，2002，23（8）：59-61.

[10] 翟寧，陳正杰，馮軍，等.尖吻蝮蛇毒中一種新類凝血酶的分離純化[J].中國醫(yī)藥工業(yè)雜志，2005，36（10）：601-603.

[11] 石光，龐建新，孔煥育，等.尖吻蝮蛇血凝酶藥效評價及其作用機制[J].中國新藥雜志，2010，19（18）：1706-1709.

[12] 張慧.烏蘇里蝮蛇磷脂酶A2的分離、純化和性質(zhì)測定[D].長春：吉林大學(xué)藥學(xué)院，2013.

[13] 孫妙囡.烏蘇里蝮蛇去整合素ussurin制備、抗腫瘤活性及安全性研究[D].長春：吉林大學(xué)，2013.

[14] 孫德軍，劉珊珊，楊春偉，等.烏蘇里蝮蛇絲氨酸蛋白酶基因克隆和序列分析[J].吉林大學(xué)學(xué)報：醫(yī)學(xué)版，2005，31（3）：325-329.

[15] 蘇煌財，許云祿，林玉仙.五步蛇毒凝血酶樣酶分離純化[J].中南醫(yī)院藥學(xué)雜志，2013，33（23）：1943-1945.

[16] 于明帥，張科.尖吻蝮蛇血凝酶臨床止血作用及安全性研究進展[J].四川醫(yī)學(xué)，2015，36（1）：106-109.

[17] 解春艷，趙振龍，米穎.尖吻蝮蛇血凝酶對股骨干骨折術(shù)中出血的影響[J].中國藥業(yè)，2013，25（5）：24-25.

[18] 章征兵，胡華琨，謝維炎.尖吻蝮蛇血凝酶在先天性心臟病患兒術(shù)中應(yīng)用的安全性及有效性[J].藥物與臨床，2012，9（16）：90-91.

[19] 魏京霞.尖吻蝮蛇血凝酶與氨甲環(huán)酸術(shù)中止血效果比較[J].現(xiàn)代臨床醫(yī)學(xué)，2013，39（1）：16-17.

[20] 白雪，杜峻峰，苑樹俊，等.手術(shù)后應(yīng)用尖吻蝮蛇血凝酶止血的安全性評價[J].中國臨床藥理學(xué)雜志，2011，27（4）：255-258.

[21] 李鳳君，袁進，韓麗萍，等.蛇毒心臟毒素誘導(dǎo)肺癌A549細胞的凋亡機制研究[J].中國藥房，2014，25（7）：583-586.

（收稿日期：2016-07-26 本文編輯：王紅雙）