局部應用辛伐他汀對家兔下頜骨骨折愈合的影響

劉屹嵩+牛恒+符增濤

[摘要] 目的 研究局部應用辛伐他汀對家兔下頜骨骨折愈合的影響，為辛伐他汀在口腔頜面部骨折愈合的臨床應用提供相應的理論依據(jù)。方法 選擇24只成年雄性新西蘭家兔，所有家兔均在左側(cè)下頜骨體處做線性骨折模型后行鈦板鈦釘內(nèi)固定，將實驗家兔隨機分成實驗組和對照組。實驗組家兔下頜骨骨折區(qū)局部覆蓋含有辛伐他汀的明膠海綿緩釋膜，對照組骨折區(qū)局部覆蓋不含辛伐他汀的明膠海綿緩釋膜。分別于術后第2、4、8周處死實驗動物，通過HE染色和免疫組化法分析辛伐他汀對家兔下頜骨骨折愈合的影響。結(jié)果 實驗組骨痂形成與改建速率快于對照組；術后2、4周實驗組骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2陽性表達率明顯高于對照組（P < 0.05），在第8周時兩組差異無統(tǒng)計學意義（P > 0.05）。結(jié)論 局部應用辛伐他汀能促進新骨的形成，加速骨折的愈合。

[關鍵詞]辛伐他??；下頜骨骨折；骨折愈合；骨形態(tài)蛋白-2

[中圖分類號] R782 [文獻標識碼] A [文章編號] 1673-7210（2017）01（a）-0024-04

[Abstract] Objective To investigate the effect of Simvastatin on repairing mandibular fracture in rabbits， in order to provide a theoretical basis for the clinical application of Simvastatin in the treatment of oral and maxillofacial fracture. Methods 24 adult male New Zealand rabbits made into fracture model with titanium plate fixation were divided into two groups randomly， including experimental group and control group. The rabbits of experimental group were covered by Simvastatin in form of slow-release gelfoam at local lesion and those of control group were covered by gelfoam without Simvastatin at local lesion. After 2， 4， 8 weeks of surgery， rabbits were executed. The effects of Simvastatin on bone fracture repairing were evaluated by HE staining and immunohistological staining. Results The rate ofbone callus reaction in the experimental group was faster than that of control group. The expression of bone morphogenetic protein-2 in the experimental group was higher than that in control group at 2 and 4 weeks after surgery， and the expression of bone morphogenetic protein-2 in two groups had no significant difference at 8 weeks after surgery （P > 0.05）. Conclusion Simvastatin can promote the formation of new bone and accelerate fracture healing.

[Key words] Simvastatin； Mandibular fracture； Fracture healing； Bone morphogenetic protein-2

人體頜面部突出于體表且直接暴露于外界，易受外力致傷。有文獻記載口腔頜面部外傷占全身創(chuàng)傷的7%～20%[1]，而下頜骨骨折又占頜面部骨折的大部分。長期以來如何更快更好地促進頜面部骨折的愈合，使其恢復原有的形態(tài)和功能，一直是口腔科醫(yī)生的追求。辛伐他汀是臨床上常用的一類降脂藥。Mundy等[2]研究表明，他汀類藥物具有增強骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2（BMP-2）啟動因子的活性。Sugiyama等[3]研究發(fā)現(xiàn)，親脂性他汀藥物如辛伐他汀比親水性的他汀藥物更能促進BMP-2啟動因子活性。有實驗證實局部應用辛伐他汀能促進新骨形成[4]，因而辛伐他汀一直是研究成骨作用的熱點藥物之一。本實驗主要研究局部應用辛伐他汀對家兔下頜骨骨折愈合的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

選用24只6月齡健康雄性新西蘭家兔，體重（3.0±0.2）kg，清潔度良好，合格證號：SCXK（黑）2012-002，由哈藥集團中藥二廠提供。在清潔干燥的飼養(yǎng)條件下入圈飼養(yǎng)觀察1周后，將所有家兔進行編號（1～24號），將編號所對應的紙條采取抽簽的方式隨機抽取12個作為實驗組，剩下12個作為對照組。

1.2 實驗藥物

將10 mg辛伐他?。ㄉ綎|羅欣藥業(yè)有限公司）碾碎溶于10 mL無水乙醇（遼寧泉瑞試劑有限公司）中混勻，制備辛伐他汀溶液，吸取1 mL溶液完全浸入明膠海綿（江西省祥恩醫(yī)療科技發(fā)展有限公司，批號15110801）中，恒溫箱烘干，即制備成含有1 mg辛伐他汀的明膠海綿。取1 mL不含辛伐他汀的無水乙醇完全浸入明膠海綿，恒溫箱烘干，即制備成不含辛伐他汀的明膠海綿。60Co輻射滅菌。

1.3實驗方法

所有動物于耳緣靜脈處注射20%烏拉坦溶液（5 mL/kg）麻醉，取仰臥位固定于手術臺，備皮、消毒，于左側(cè)下頜骨體部用牙科高速渦輪機致下頜骨線性骨折，鈦板鈦釘內(nèi)固定。實驗組骨折斷端覆蓋含有辛伐他汀的明膠海綿，對照組斷端覆蓋不含辛伐他汀的明膠海綿，生理鹽水沖洗后分層縫合。使用空氣栓塞方法于術后第2、4、8周每組分別處死4只實驗動物。

1.4 標本制備

截取骨折區(qū)骨塊并去除表面軟組織，依次經(jīng)多聚甲醛固定，EDTA脫鈣，梯度乙醇脫水，石蠟包埋，制備成5 μm厚切片（每組4只標本，每只標本取20張切片，共80張）。HE染色后觀察骨折區(qū)新骨形成情況；按BMP-2免疫組化試劑盒（武漢博士德生物工程有限公司）檢測步驟對標本染色（SP法），并在顯微鏡下觀察，檢測骨折區(qū)BMP-2表達情況。

1.5 指標檢測

每張切片由3位資深的病理科醫(yī)生獨立閱片，每張切片在高倍鏡下（400×）隨機選取10個視野，每個視野計數(shù)100個細胞，根據(jù)其陽性細胞所占的比例及染色強度進行綜合評分。染色強度分為：無著色為0分，淡黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分；陽性細胞所占百分比：<5%為0分，5%～25%為1分，26%～50%為2分，51%～75%為3分，>75%為4分。兩項評分相乘，0～1分為（-），≥2分為（+）。

1.6 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 23.0軟件進行統(tǒng)計學處理，組間比較采用χ2檢驗，以P < 0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 組織形態(tài)學觀察

通過光鏡下觀察HE染色切片發(fā)現(xiàn)，術后2周時，實驗組骨折區(qū)新生骨痂內(nèi)可見大量網(wǎng)狀排列的新生骨小梁，骨小梁較粗且邊緣清晰，骨小梁周圍可見有大量成纖維細胞及成骨細胞和少量血細胞及炎癥細胞，部分地方可見少量的軟骨組織及成軟骨細胞；對照組可見骨痂區(qū)主要有疏松結(jié)締組織組成，結(jié)締組織中可見少量較細的骨小梁，骨小梁周圍有散在的成骨細胞及炎癥細胞。術后4周時，實驗組骨折區(qū)可見骨小梁進一步增多、增粗，骨小梁之間逐漸相互融合，排列趨于與牙體長軸平行的規(guī)則排列，且較大的小梁空隙被新生骨充滿，骨小梁間可見活躍的成骨細胞、成纖維細胞、破骨細胞同時存在，骨小梁部分被吸收，骨折區(qū)可見少量新生血管；對照組較2周時骨小梁明顯增多，骨小梁呈網(wǎng)狀或海綿狀排列的不規(guī)則排列，可見部分骨小梁相互融合，新生骨數(shù)量較同期實驗組減少，骨小梁周圍可見成骨細胞及少量的破骨細胞和新生血管。術后8周，實驗組骨折基本愈合，骨折區(qū)有大量致密骨組織形成，新生骨排列呈板狀，與骨長軸方向一致，兩端與骨皮質(zhì)連接；對照組骨折區(qū)愈合與實驗組大致相同，骨小梁板狀排列，可見少量未骨化的軟骨組織。不同時期骨折區(qū)HE染色情況見圖1。

2.2 骨折區(qū)內(nèi)BMP-2的表達

BMP-2免疫組織化學陽性染色呈棕黃色。術后2、4周實驗組BMP-2的陽性表達率明顯高于對照組，差異有統(tǒng)計學意義（P < 0.05）；術后8周，BMP-2在骨折區(qū)表達明顯減弱，且兩組差異無統(tǒng)計學意義（P > 0.05）。見圖2、表1。

3討論

骨折的愈合是由成骨細胞、破骨細胞以及骨形態(tài)發(fā)生蛋白、血小板衍生生長因子、成纖維細胞生長因子、轉(zhuǎn)化生長因子（TGF）、血管內(nèi)皮生長因子等眾多因子參與的一個長期復雜的生物學修復過程，而骨折愈合的速度和質(zhì)量由局部生長因子控制[5]。骨折的愈合過程分為骨折斷端直接通過哈弗系統(tǒng)重建完成的一期骨愈合，其特點是無骨痂的形成以及骨折表面無骨吸收的痕跡；通過血腫形成、血腫機化、骨痂形成、骨痂機化4個階段的二期骨愈合，其特點是有骨痂的形成。本實驗采用骨折斷端解剖式復位后，利用進行鈦釘鈦板堅強內(nèi)固定使其進行骨折的一期骨愈合，模擬臨床上對頜骨骨折常用的治療方法。在術后第2周及第4周HE染色中不難看到，實驗組中骨纖維的數(shù)量及排列、軟骨組織及破骨細胞的出現(xiàn)均早于對照組出現(xiàn)，說明實驗組骨折后骨的愈合及新骨的重塑早于對照組。

BMP-2是TGF-β超家族中的一員，不但能單獨誘導骨組織形成，而且可以通過自身調(diào)節(jié)控制其他BMPs的活性[6]，在骨形成中起重要的調(diào)控作用。BMP-2由成骨細胞分泌，可通過促進成骨細胞及其前體細胞增殖，以及骨髓基質(zhì)干細胞（BMSCs）甚至是肌細胞的前體細胞向成骨細胞分化來刺激骨形成[7-8]。目前BMP-2作為BMSCs成骨定向分化的主要調(diào)控因子已經(jīng)運用于臨床[9]。但是由于BMP-2的制備過程復雜、產(chǎn)量低、活性不穩(wěn)定、體內(nèi)代謝快、骨誘導時間短，且作為外源蛋白植入體內(nèi)用量大時會引起毒副作用，甚至免疫排斥反應[10]。因而尋找一種刺激自身BMP-2分泌的藥物十分必要，而實驗證明辛伐他汀可以通過誘導BMP-2的信號轉(zhuǎn)導分子mRNA的表達來上調(diào)BMP-2的表達[11]。本實驗結(jié)果表明，在術后2、4周骨折區(qū)BMP-2均顯著表達，且同期實驗組明顯高于對照組（P < 0.05）。說明此期兩組均有活躍的成骨發(fā)生，但是實驗組較對照組更加明顯。術后8周兩組BMP-2表達明顯降低，差異無統(tǒng)計學意義（P > 0.05），說明術后8周兩組骨折均基本愈合。

辛伐他汀作為HMG-CoA還原酶抑制劑廣泛應用于臨床中，可抑制膽固醇合成，降低心腦血管疾病發(fā)生率。隨著對辛伐他汀藥物作用研究的深入，發(fā)現(xiàn)辛伐他汀既可以通過增加對信號傳導蛋白Smad1及Smad5基因的表達來增加BMP-2的信號傳遞來，并且抑制部分TGF-β/Smad3通路的凋亡，促進成骨效應[12-14]；通過增加磷脂酰肌醇-3激酶活性，從而誘導BMP-2轉(zhuǎn)錄來促進骨形成[15]；通過激活絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）途徑，誘導具有調(diào)節(jié)細胞增殖功能的成骨細胞熱休克蛋白27表達促進骨形成；并且辛伐他汀通過增加BMSCs中成骨細胞轉(zhuǎn)錄因子Runx2表達、激活p38MAPK通路途徑誘導BMSCs向成骨細胞分化[16-17]；通過上調(diào)成骨細胞連接蛋白43的基因以及其蛋白的表達來促進成骨細胞的增殖分化，從而達到促進成骨的作用[18]。本實驗采用明膠海綿為載體局部緩釋辛伐他汀，研究其對骨折愈合的影響，實驗結(jié)果表明辛伐他汀能有效誘導局部BMP-2表達，促進骨折愈合；從HE染色中發(fā)現(xiàn)成骨細胞、BMSCs實驗組均多且早于對照組出現(xiàn)，而且相同時期實驗組骨折區(qū)骨纖維從數(shù)量以及粗細均明顯優(yōu)于對照組，說明局部應用辛伐他汀能有效地誘導BMSCs向成骨細胞分化，從而促進骨折愈合。

目前辛伐他汀促進成骨的動物實驗中，在用藥方式上多數(shù)采用口服給藥和皮下注射。口服他汀類藥物需要經(jīng)過肝臟的首過效應，真正進入血液循環(huán)的藥物不足5%，且進入骨折區(qū)的藥物更少；此外辛伐他汀的半衰期為1～3 h[19]，并且在服藥后的2 h才開始在末端組織內(nèi)小劑量聚集[20]；并且口服給藥一般需要較長療程，患者依從性不能保證。皮下注射會給患者帶來附加傷害、增加感染機會。因此兩種給藥方式在臨床使用中均存在弊端。在用藥劑量上，局部應用辛伐他汀的藥物劑量一直存在一定爭議，有實驗證明局部應用含有1 mg辛伐他汀是更有利于促進新骨形成[21-22]。本實驗采用骨折復位固定手術同時，給予含有1 mg辛伐他汀的明膠海綿緩釋給藥，使藥物迅速作用于骨折部位，避免口服給藥和注射給藥的缺陷，保證長期局部所需的藥物濃度。

本次試驗表明局部緩釋應用辛伐他汀能夠加速骨折愈合，為今后辛伐他汀在促進新骨形成、加快骨折愈合方面的研究提供理論依據(jù)以及實驗基礎，為臨床上治療頜面部骨折提供一種新思路。但是辛伐他汀促進成骨機制以及局部應用藥物的用量方面需要進一步研究。本次試驗樣本量較小，具有一定局限性，需要更多高質(zhì)量、大樣本的實驗進行驗證。

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（收稿日期：2016-08-19 本文編輯：程 銘）