種子或帶菌土壤傳播稻曲病菌的可能性研究

胡茂林，羅來鑫，李志強(qiáng)，陳竹鋒，溫 凱，唐曉艷，李華平，李健強(qiáng)

（1.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，廣東 廣州 510642；2. 中國農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院，北京 100193；3. 深圳市作物分子設(shè)計(jì)育種研究院，廣東 深圳 518107；4. 深圳市農(nóng)業(yè)科技促進(jìn)中心，廣東 深圳 518055）

稻曲病是由稻綠核菌（Ustilaginoidea virens）引起的水稻穗部真菌性病害［1-2］，在全世界不同稻作區(qū)均有發(fā)生，且呈加重趨勢［3-5］。該病害不僅降低水稻的產(chǎn)量，而且所產(chǎn)生的病菌毒素對人畜均有毒副作用，使其成為近年來備受關(guān)注的水稻病害之一［6-7］。雖然國內(nèi)外學(xué)者圍繞稻曲病已開展了大量的研究工作，但由于該病菌主要危害水稻穗部［8-10］，自然條件下在水稻穗部呈零星、不規(guī)律發(fā)生，現(xiàn)有的病菌分離培養(yǎng)周期較長等致使研究難度相對較大。稻曲病的初侵染來源至今尚不明確，其在自然條件下如何造成穗期侵染仍無合理的解釋，深入探究稻曲病菌侵染途徑對于有效防控該病害具有重要意義。

早在20世紀(jì)60年代，Ikegami就對稻曲病菌的苗期侵染進(jìn)行了組織學(xué)研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，稻曲病菌可以成功侵染水稻萌發(fā)初期的幼嫩胚芽鞘，并沿著韌皮部中的篩管外表面進(jìn)行擴(kuò)展直至分蘗的中晚期。該研究表明稻曲菌侵染的潛在部位并不局限于花器內(nèi)，且其并不像黑粉菌那樣能夠抵達(dá)植株莖尖部的穗原基［12-13］。Ditmore等通過細(xì)胞學(xué)觀察發(fā)現(xiàn)，稻曲病菌可侵染水稻幼嫩的胚根，但對是否最終引發(fā)病害并無完整結(jié)論［14］。鄭大偉等通過對移栽后35 d的水稻苗期樣品和灌漿期病株不同組織進(jìn)行檢測發(fā)現(xiàn)，在苗期水稻的根和葉鞘組織以及灌漿期發(fā)病植株的莖組織中，均可檢測到稻曲病菌［15］，但由于其所采集的水稻樣品生長在病圃中，其檢測結(jié)果是否受到樣品表面稻曲病菌殘留有待進(jìn)一步論證。

本研究在前期調(diào)查中發(fā)現(xiàn)，水稻收獲脫粒時健康谷粒和稻曲病侵染的病粒?；祀s在一起，稻曲球上的厚垣孢子能夠污染到健康的谷粒；同時，還發(fā)現(xiàn)四川的水稻種子岡優(yōu)188調(diào)運(yùn)到河南信陽地區(qū)后稻曲病田間危害明顯加重；此外，在實(shí)際生產(chǎn)中，發(fā)病田亦存在隔年發(fā)病的現(xiàn)象。基于此，我們提出“水稻種子帶菌或土壤帶菌是稻曲病初侵染來源”的假設(shè)。本研究通過人工接種處理土壤、水稻種子，基于稻曲病菌EGFP標(biāo)記和借助超微結(jié)構(gòu)觀察以及激光共聚焦顯微觀察，以期系統(tǒng)探究稻曲病病菌在種子、秧苗或植株及新形成的花器、籽粒中的侵染和擴(kuò)展行為，分析水稻種子、土壤帶菌傳播稻曲病的可能性，旨在為進(jìn)一步明確稻曲病的初侵染來源及病害綜合防治提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

增強(qiáng)型綠色熒光蛋白標(biāo)記的稻曲病菌菌株EGFP-P3由江蘇省農(nóng)科院劉永鋒研究員提供，其中該病菌菌絲-分生孢子混合液由室內(nèi)擴(kuò)繁培養(yǎng)獲得，厚垣孢子由溫室人工接種發(fā)病后收集獲得；供試水稻品種甬優(yōu)9號（YY9）由浙江大學(xué)胡東維教授提供，晚秈98（WX98）由湖北省遠(yuǎn)安縣植保站楊守利提供；取普通稻田土，使用壓力蒸汽滅菌器濕熱滅菌（136℃、1 h），取樣分離培養(yǎng)確認(rèn)無稻曲病菌后作為本試驗(yàn)土壤。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 病菌培養(yǎng)與接種體制備 將保存于4℃冰箱的菌株取出，置于裝有馬鈴薯蔗糖瓊脂培養(yǎng)基（PSA）的直徑9 cm培養(yǎng)皿上，于培養(yǎng)箱中28℃黑暗培養(yǎng)15 d，隨后從稻曲病菌菌落邊緣用打孔器（直徑5 mm）打取菌餅6塊，置于含50 mL馬鈴薯蔗糖液體培養(yǎng)基（PS）的三角瓶中，于搖床上震蕩培養(yǎng)（120 r/min，28℃）。

1.2.2 菌絲-分生孢子混合液制備 培養(yǎng)7 d后分別過濾收集菌絲、分生孢子。將菌絲重新懸浮于培養(yǎng)濾液中，利用JYL-C022型自動攪拌機(jī)將菌絲均勻打碎，隨后將分生孢子混合到菌絲片段中，利用血球計(jì)數(shù)板計(jì)算分生孢子濃度，并將菌絲-分生孢子混合液中分生孢子濃度分別調(diào)節(jié)至 4×106、2×106個 /mL，備用。

1.2.3 種子、土壤帶菌處理 種子及土壤帶菌處理流程見圖1（封二），具體方法如下：

（1）滅菌土壤接種和水稻播種：無菌土壤接種稻曲病菌菌絲-分生孢子混合液：取滅菌土壤，將擴(kuò)大培養(yǎng)的EGFP-P3菌絲-分生孢子混合液接種到無菌土壤中，混勻后制備為接種土壤。設(shè)置3個接種濃度處理，分別將100、400、800 mL分生孢子濃度為4.0×106個分生孢子/mL的菌絲-分生孢子混合液均勻添加到對應(yīng)土樣中，均勻混合制備為接種土壤。每個處理用一次性紙杯取12杯無菌土樣。3個處理中，經(jīng)檢測1 g土樣中所含分生孢子量分別為3.17×105、1.27×106、2.54×106個。另取無菌土壤添加到直徑30 cm的桶中適度鎮(zhèn)壓，桶中央部位鉆取出直徑5 cm、深度4 cm的土柱獲得空穴5個，即桶中央1個穴位點(diǎn)，周圍4個穴位點(diǎn)，位點(diǎn)均勻分布，相互間隔約3～5 cm。將接種土樣添加到該空穴中，適度鎮(zhèn)壓與花盆無菌土壤齊平后，接種土壤中央部位使用鋼勺一次性挖取整勺接種土壤，形成倒錐字型深度2 cm的接種土壤播種穴位點(diǎn)。將經(jīng)處理的無菌種子分別播種于各個穴位點(diǎn)，隨后在其上覆蓋約2 cm的接種土壤。每處理每品種種植水稻兩桶，每穴5粒，共播種50粒水稻種子，試驗(yàn)設(shè)3個生育期重復(fù)。

無菌土壤接種厚垣孢子：人工穗期接種病菌EGFP-P3，收集稻曲球并研磨獲得厚垣孢子。依據(jù)預(yù)試驗(yàn)結(jié)果，按照每穴均勻混合1、4、8粒稻曲球所含的厚垣孢子量接種到無菌土壤中，混勻后制備為接種土壤。設(shè)置3個接種濃度處理，每個處理使用一次性紙杯取12杯無菌土樣，分別將0.75、3、6 g厚垣孢子粉添加到對應(yīng)土樣中制備為接種土壤。定量計(jì)算結(jié)果為：1 g稻曲病菌厚垣孢子粉包含約4.23×109個厚垣孢子，對應(yīng)3個處理中1 g土壤中所含厚垣孢子量分別為 2.52×106、1.01×107、2.02×107個。將無病菌種子播種到接種土壤穴位點(diǎn)內(nèi)，其上覆蓋約2 cm的接種土壤。每處理每品種種植水稻兩桶，每穴5粒，共播種50粒水稻種子，試驗(yàn)設(shè)3個生育期重復(fù)。

（2）水稻種子接菌與播種：接種稻曲病菌菌絲-分生孢子混合液：利用JYL-C022型自動攪拌機(jī)將液體培養(yǎng)7 d擴(kuò)繁獲得的菌絲打碎均勻，隨后制備分生孢子濃度為4.0×106個/mL的菌絲-分生孢子混合液作為接種體。取適量水稻種子，浸泡在病菌混合液中，置于搖床振蕩1 h（120 r/min）后取出，于無菌操作臺中濾紙晾干，HITACHI S-3400N型掃描電子顯微鏡（Japan）觀察確證表面粘附病菌后，將上述處理的水稻種子分別播種于包含無菌土壤桶中。每個水稻品種種植兩桶，每穴5粒，共播種水稻種子50粒，試驗(yàn)設(shè)3個生育期重復(fù)。

接種稻曲病菌厚垣孢子：按照一粒稻曲球所含厚垣孢子量均勻拌1 g水稻種子，置于搖床上振蕩10 min（120 r/min），使厚垣孢子粘附于種表，于無菌超凈臺晾干。采用土壤穴點(diǎn)法播種（同上），每個水稻品種種植兩桶，每穴5粒，共播種水稻種子50粒，試驗(yàn)設(shè)3個生育期重復(fù)。

2012—2014 年接菌試驗(yàn)在中國農(nóng)業(yè)大學(xué)可控溫室進(jìn)行。經(jīng)上述接菌處理的水稻種子播種后，全生育期不施用任何殺菌劑，雜草、蟲害防治及水肥管理均按照水稻常規(guī)栽培進(jìn)行。

1.2.4 穗期接種 選擇水稻破口前7 d稻穗中部接種菌絲-分生孢子混合液，其中分生孢子濃度為2×106個/mL，每穗接種量2 mL，以含50 mL馬鈴薯蔗糖液體培養(yǎng)基（PS）接種為對照。接種后溫度控制在25～36℃、水稻破口前后濕度保持在90%左右。

1.2.5 掃描電鏡樣品制備 隨機(jī)選取稻曲病菌拌種及培養(yǎng)濾液浸種處理的水稻種子置于含2.5%戊二醛磷酸緩沖液（50 mmol/L，pH 7.2）中固定6～8 h，隨后于磷酸緩沖液中浸泡2 h，再用1%鋨酸于室溫條件下固定2 h，用雙蒸水清洗3～4次，隨后依次用梯度濃度的乙醇溶液（50%，70%，80%，90%，95%）對樣品進(jìn)行脫水處理，每步20 min，最后用100%的乙醇脫水處理3次，每次20 min。用乙醇與醋酸異戊酯的混合液（V/V=l/1）浸提樣品30 min，再換純醋酸異戊酯處理1.5 h，于Hitachi HCP-2上進(jìn)行CO2臨界點(diǎn)干燥，然后將樣品粘在樣品臺上，用Eiko IB-3型離子濺射儀上進(jìn)行離子濺射鍍金，置于HITACHI S-3400N型掃描電子顯微鏡上進(jìn)行掃描觀察。

1.2.6 激光共聚焦熒光顯微鏡樣品制備 于水稻發(fā)芽期（種植后5 d）、幼苗期（種植后20 d）、分蘗期、孕穗期分別選取上述不同接種處理的材料，不同階段分別對根系、莖稈部位生長錐、孕穗期花器部位進(jìn)行共聚焦熒光顯微觀察，觀察方法如下：

（1）水稻根和莖稈部位生長錐觀察：采用冰凍切片法進(jìn)行，具體方法為：將適量的OCT包埋劑滴入冷凍機(jī)鋁合金組織標(biāo)本臺上，隨后將固定好的新鮮組織放置于包埋劑中心部分，一起放在徠卡CM1520型切片機(jī)操作室里的速凍臺上，快速冷凍 3～5 min；利用電動馬達(dá)前進(jìn)刀片進(jìn)行粗切，當(dāng)接近組織樣品時進(jìn)行人工手動切片，切片厚度為 15～25 μm；使用毛筆將完整的片子平展后快速放置在干凈的載玻片上待觀察。每處理選取3株水稻分別對其根、莖部位生長錐進(jìn)行切片，每株水稻的根、莖部位有效切片數(shù)6個。

（2）小穗花器觀察：于水稻孕穗期取樣，每處理選取3株稻穗，每株稻穗上隨機(jī)選取6個小穗，每個小穗表面使用無菌水沖洗3次，用鑷子將兩片穎殼分開后，輕輕取出小穗內(nèi)花器，均勻鋪展于載玻片上，利用0.25%的瓊脂糖封片。借助激光共聚焦掃描顯微鏡（Nikon D-eclipse C1，Japan），調(diào)節(jié)激發(fā)光波長至488 nm，觀察組織中有無稻曲病菌存在。

1.2.7 調(diào)查統(tǒng)計(jì) 于稻穗成熟期，調(diào)查各處理發(fā)病狀況，并統(tǒng)計(jì)發(fā)病率。運(yùn)用SPSS軟件（版本 V17.0，SPSS Inc.，Chicago，IL，USA），采用鄧肯新復(fù)極差檢驗(yàn)（DMRT，P= 0.05）與方差分析的方法進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，以綜合評估不同接種處理病害發(fā)生情況。

1.2.8 PCR分子檢測 于水稻成熟期取樣，各處理分別隨機(jī)選取水稻3株，每穗隨機(jī)取10粒稻谷進(jìn)行DNA提取，參照胡茂林建立的稻曲病菌檢測方法［16］，利用特異性引物UV279-F/UV693-R對上述提取的DNA樣品進(jìn)行PCR擴(kuò)增和電泳分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 接種體制備及其處理效果驗(yàn)證

熒光顯微鏡觀察結(jié)果（圖2，封三）顯示，人工穗期接種病菌EGFP-P3，收集獲得的厚垣孢子和該菌株液體擴(kuò)繁培養(yǎng)獲得的菌絲-分生孢子均發(fā)綠色熒光，說明所制備的初始接種體是具有活力的。掃描電鏡觀察結(jié)果（圖3，封三）顯示，經(jīng)厚垣孢子、菌絲-分生孢子混合液拌種后，種子表面粘附大量菌體。共聚焦顯微鏡觀察結(jié)果（圖4，封三）表明，土壤及種子拌菌后，在水稻發(fā)芽期均能觀察到大量菌體粘附在其根部表面，說明上述種子及土壤拌菌的方法是可行的。

2.2 稻曲病菌在水稻不同發(fā)育階段的侵染情況分析

為探究種子及土壤帶菌能否引起侵染，于水稻發(fā)芽期、苗期、分蘗期、孕穗期及抽穗期分別取樣，利用激光共聚焦熒光顯微觀察。種子拌菌和土壤接種病菌后于發(fā)芽期取樣，CLSM觀察可見水稻根部有較強(qiáng)的綠色熒光（圖4，封三），表明有大量菌體存在，但根部切片未觀察到有病菌侵入寄主根部的現(xiàn)象。

為進(jìn)一步探究在水稻生長期地上部位是否存在病菌侵染，于苗期、分蘗期分別取水稻植株生長點(diǎn)部位，孕穗期、抽穗期取小穗花器進(jìn)行激光共聚焦熒光顯微觀察，結(jié)果表明，各處理均未觀察到有病菌侵入。以菌絲-分生孢子拌種后水稻苗期至抽穗期觀察為例（圖5A，封三），苗期莖部生長點(diǎn)觀察結(jié)果表明，接種處理（圖5Aa，封三）及對照（圖5Ac，封三）外側(cè)植物自發(fā)熒光現(xiàn)象較強(qiáng)，內(nèi)側(cè)相對較少；分蘗期（圖5Ab、d，封三）取樣觀察，除氣孔邊緣部位之外，其他部位無熒光現(xiàn)象。孕穗期、抽穗期取水稻小穗，用鑷子將穗部穎殼分開，觀察結(jié)果表明（圖5Ae、f，封三），小穗內(nèi)部及灌漿子?？v切面均無綠色熒光。然而，孕穗至破口期對稻穗部位進(jìn)行人工注射接種，在小穗花器及小穗灌漿期縱切面觀察均有大量熒光（圖5Ag、h，封三）。為進(jìn)一步驗(yàn)證激光共聚焦觀察結(jié)果，對各時期對應(yīng)觀察部位的組織器官取樣，提取DNA，利用稻曲病菌基因組DNA特異引物進(jìn)行PCR分析，結(jié)果表明（圖5B，封三），除人工穗部接種樣品擴(kuò)增出陽性條帶之外，其他處理均未擴(kuò)增出陽性條帶。

2.3 成熟期病癥調(diào)查統(tǒng)計(jì)分析

于灌漿至成熟期對各個處理進(jìn)行癥狀觀察與結(jié)果統(tǒng)計(jì)。結(jié)果（表1，圖6，封三）表明，水稻種子和土壤拌菌播種，成熟期穗部無典型稻曲球形成（圖6A，封三）。針對晚秈98、甬優(yōu)9號兩個品種分別進(jìn)行種子拌菌、土壤接種試驗(yàn)，三次生育期重復(fù)試驗(yàn)均未觀察到典型發(fā)病癥狀。然而，在水稻孕穗至破口期分別進(jìn)行人工穗部接種，則2個品種的穗部形成大量稻曲球（圖6B，封三）。

表1 不同處理水稻成熟期癥狀調(diào)查結(jié)果

2.4 水稻成熟期種子帶菌檢測驗(yàn)證

于水稻成熟期分別取樣，用PCR方法進(jìn)行種子帶菌檢測分析。結(jié)果表明，水稻品種甬優(yōu)9號經(jīng)種子拌菌及土壤接種處理后，成熟期谷粒均未檢測到有病菌存在，3個生育期重復(fù)試驗(yàn)結(jié)果一致（圖7）；水稻品種晚秈98經(jīng)種子拌菌及土壤接種處理后，成熟期谷粒分子檢測結(jié)果與甬優(yōu)9號結(jié)果相同（未顯示）。

圖7 對應(yīng)表1中各處理成熟期種子帶菌PCR檢測

3 結(jié)論與討論

本研究利用稻曲病菌不同菌體對種子及土壤進(jìn)行接種，激光共聚焦觀察結(jié)果顯示，各處理在水稻不同生長期均未觀察到有病菌侵入現(xiàn)象，各處理水稻成熟期均未出現(xiàn)癥狀，PCR檢測亦未擴(kuò)增出陽性條帶，綜合分析現(xiàn)有試驗(yàn)結(jié)果認(rèn)為，尚不能證實(shí)稻曲病菌經(jīng)由水稻幼嫩組織部位侵入并引起穗期花器發(fā)病，該結(jié)論與Li和Tang等已有研究結(jié)果一致［17-18］。盡管有報道，稻曲病能夠偶發(fā)性侵染水稻幼嫩組織［12，19］，但均無導(dǎo)致穗期發(fā)病的直接證據(jù)。

病菌初侵染來源研究是系統(tǒng)探究寄主與病原菌互作的關(guān)鍵之一。不少研究者認(rèn)為，通過厚垣孢子、子囊孢子及薄壁分生孢子都可以成功接種水稻稻穗并引起發(fā)病。而厚垣孢子、子囊孢子萌發(fā)都可以產(chǎn)生薄壁分生孢子，因此推測，越冬后的厚垣孢子或子囊孢子萌發(fā)產(chǎn)生的分生孢子是稻曲病菌初侵染的主要來源。其中，厚垣孢子萌發(fā)及萌發(fā)率的高低是探究其能否作為初侵染來源的關(guān)鍵因素。Ikegami用稻曲病菌厚垣孢子在水稻孕穗期接種獲得成功［20］。Ou認(rèn)為越冬菌源產(chǎn)生的子囊孢子是主要的初侵染菌體來源［21］。大煙等報道，菌核可在土壤中越冬，來年夏季長出子實(shí)體，子囊殼中形成的子囊孢子則隨氣流及雨水飛散，落至孕穗期水稻葉鞘內(nèi)而引起發(fā)?。?2］。Yotsuya等報道，在低溫高濕條件下，利用分生孢子在水稻孕穗期噴霧接種能夠引起水稻發(fā)?。?3］。張君成等通過對分生孢子的研究，推測稻田里的厚垣孢子可在水里萌發(fā)產(chǎn)生分生孢子并傳到穗部侵染水稻［24］。盡管國內(nèi)外學(xué)者對于引起稻曲病初次侵染的病菌菌體形態(tài)已有諸多報道，但對于造成稻曲病菌初次侵染的菌體來源尚無確切的實(shí)驗(yàn)證據(jù)。黎毓干等研究認(rèn)為帶菌種子是引起稻曲病發(fā)生的重要初侵染源［25］。劉見平等通過田間試驗(yàn)結(jié)果表明，稻曲病初侵染源主要為種子帶菌，其次是土壤中越冬的病菌，但相關(guān)結(jié)果缺乏室內(nèi)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證［26］。Ashizawa等通過檢測土壤中攜帶稻曲病菌菌源量，推測土壤帶菌可能與病害發(fā)生存在相關(guān)性［8］。自然條件下，稻曲病菌侵染主要在穗部有癥狀表現(xiàn)，同一田塊零星發(fā)病，同一稻穗上形成的稻曲球在分布上亦無明顯規(guī)律性，常出現(xiàn)稻穗的基部、上部有稻曲球形成，而中部形成健康谷粒的現(xiàn)象，這為人工可控條件下系統(tǒng)研究其侵染行為增加了難度。人工穗期接種觀察表明，病菌侵入小穗內(nèi)部后最初在花絲基部定殖，隨后形成一些特殊的侵染結(jié)構(gòu)如菌絲基座和侵染菌絲，直至侵染整個小穗［9，18］。與鐮刀菌引起的小麥病害類似［27-28］，水稻穗期花器的發(fā)育生長可能為稻曲病菌穗期侵染提供足夠的營養(yǎng)，由此推測，稻曲病菌侵染具有器官專化性。

本研究在已有報道基礎(chǔ)上，利用厚垣孢子、分生孢子及菌絲體作為接種體，通過對種子拌菌、土壤接菌設(shè)置不同濃度梯度，首次綜合應(yīng)用超微結(jié)構(gòu)觀察法、激光共聚焦顯微觀察法、PCR分子檢測法和常規(guī)統(tǒng)計(jì)法，以期獲得種子帶菌或土壤帶菌作為初侵染來源的直接證據(jù)。人工處理后，盡管種子表面或土壤中有大量稻曲病菌菌體存在，但因溫室氣候條件與田間實(shí)際發(fā)病條件存在一定差異以及孢子萌發(fā)率低等因素可能導(dǎo)致病原菌無法侵入寄主的現(xiàn)象，有待進(jìn)一步在可控的環(huán)境下綜合模擬田間適宜發(fā)病的各因素氣候條件；在水稻生長期取樣進(jìn)行共聚焦顯微觀察，植物組織本身有自發(fā)熒光現(xiàn)象，在實(shí)際觀察過程中需進(jìn)行有效鑒別比較；本研究所取樣品部位、取樣時間及取樣量均會影響觀察檢測結(jié)果；同時，各處理中病菌在種子表面及土壤的存活狀況是否與后期侵染直接相關(guān)等，均需進(jìn)一步優(yōu)化并改進(jìn)現(xiàn)有試驗(yàn)方法，綜合考慮引起稻曲病發(fā)生的影響因素，探索適宜于厚垣孢子萌發(fā)的最佳條件，動態(tài)監(jiān)測土壤中孢子萌發(fā)及病菌的存活狀態(tài)，以深入探究稻曲病菌在水稻不同生育期侵染的可能性。另外，據(jù)報道，稻曲病菌菌核可安全越冬并在來年萌發(fā)產(chǎn)生子囊孢子，可作為來年的初侵染源［29-31］。由于本試驗(yàn)在溫室條件下，人工接種未收集到經(jīng)綠色熒光蛋白標(biāo)記的菌核，難以進(jìn)行土壤處理并開展水稻生育期示蹤觀察，因此仍需探究菌核能否作為病菌初侵染源最為直接的證據(jù)。

［1］胡東維，王疏. 稻曲病菌侵染機(jī)制研究現(xiàn)狀與展望［J］. 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)，2012，45（22）：4604-4611.

［2］Wang F，Zhang S，Liu M G，et al. Genetic diversity analysis reveals that geographical environment plays a more important role than rice cultivar inVillosiclava virenspopulation selection［J］. Applied and Environmental Microbiology，2014，80（9）：2811-2820.

［3］Atia M MM. Rice false smut（Ustilaginoidea virens）in Egypt［J］. Zeitschrift fur Pflanzen kran kheiten und Pflanzenschutz，2004，111（1）：71-82.

［4］Brooks S A，Anders M M，Yeater K M. Effect of cultural management practices on the severity of false smut and kernel smut of rice［J］. Plant Disease，2009，93（11）：1202-1208.

［5］Sun X，Kang S，Zhang Y，et al. Genetic diversity and population structure of rice pathogenUstilaginoidea virensin China［J］. PLoS One，2013，8（9）：e76879.

［6］Zhou L，Lu S，Shan T，et al. Chemistry and biology of mycotoxins from rice false smut pathogen［J］. Mycotoxins：Properties，Applications and Hazards，2012：109-130.

［7］Wang X，F(xiàn)u X，Lin F，et al. The contents of ustiloxins A and B along with their distribution in rice false smut balls［J］. Toxins，2016，8（9）：262.

［8］Ashizawa T，Takahashi M，Arai M，et al. Rice false smut pathogen，Ustilaginoidea virens，invades through small gap at the apex of a rice spikelet before heading［J］. Journal of General Plant Pathology，2012，78（4）：255-259.

［9］Hu M，Luo L，Wang S，et al. Infection processes ofUstilaginoidea virensduring artificial inoculation of rice panicles［J］. European Journal of Plant Pathology，2014，139（1）：67-77.

［10］Tang Y X，Jin J，Hu D W，et al. Elucidation of the infection process ofUstilaginoidea virens（teleomorph：Villosicla vavirens）in rice spikelets［J］. Plant Pathology，2013，62（1）：1-8.

［11］Chao J，Jin J，Wang D，et al. Cytological and transcriptional dynamics analysis of host plant revealed stage-specific biological processes related to compatible rice-Ustilaginoidea virensinteraction［J］. PLoS One，2014，9（3）：e91391.

［12］Ikegami H. Seedling inoculation with the chlamydospores of the false smut fungus［J］.Annals Phytopathological Society of Japan，1962，27：16–23.

［13］Ikegami H. Studies on the false smut of rice X.Invasion of chlamydospores and hyphae of the false smut fungus into rice plants［J］. Res Bull FacAgric Gifu University，1963，18：54-60.

［14］Ditmore M，Moore J W，TeBeest D O.Infection of plants of selected rice cultivars by the false smut fungus，Ustilaginoidea virens，in Arkansas［J］. Arkansas Agricultural Experiment Station Research Series，2006，550：132-138.

［15］鄭大偉，張藝美，尹濤，等.Ustilaginoidea virens在自然發(fā)病水稻植株體內(nèi)分布情況的檢測［J］. 植物病理學(xué)報，2016，46（2）：145-150.

［16］胡茂林.稻曲病菌侵染水稻的行為研究［D］. 北京：中國農(nóng)業(yè)大學(xué)，2014.

［17］Li H，Ni D H，Duan Y B，et al. Quantitative detection of the rice false smut pathogenUstilaginoidea virensby real-time PCR［J］.Genetics and Molecular Research，2013，12（4）：6433-6441.

［18］Tang Y X，Jin J，Hu D W，et al. Elucidation of the infection process ofUstilaginoidea virens（teleomorph：Villosiclava virens）in rice spikelets［J］. Plant Pathology，2013，62（1）：1-8.

［19］Schroud P，TeBeest D O. Germination and infection of rice roots by spores ofUstilaginoidea virens［J］. AAES，2005，540：143-151.

［20］Ikegami H. Infection of the false smut due to inoculation with chlamydospores and ascospores at the booting stage of rice plants（studies on the false smut of rice. IV）［J］. Res Bull ForAgric Gifu University，1960，12：45-51.

［21］Ou S H. False Smut（Green Smut）//Ou SH. Rice disease［M］.2nd ed. Common wealth Mycology Institute，F(xiàn)arnham Royal，UK，1985：307-309.

［22］大煙，貫一.稻?é じ病，作物病害事典［M］.1986：22.

［23］Yotsuya，Omagari. Inoculation with conidiospores of false smut fungus to rice panicles at the booting stage［J］. Annals of the Phytopathological Society of Japan，1989，55（5）：629-634.

［24］張君成，張炳欣，陳志誼，等.稻曲病菌分生孢子的生物學(xué)研究［J］. 植物病理報，2003，33（1）：44-47.

［25］黎毓干.稻曲病研究測報［J］. 廣東農(nóng)業(yè)科學(xué)，1986 （4）：45-47.

［26］劉見平，唐濤，張松柏，等.稻曲病初侵染源及病菌侵染適期初步研究［J］.雜交水稻，2009，24（1）：74-77.

［27］Brown N A，Urban M，Van de Meene A M L，et al. The infection biology ofFusarium graminearum：Defining the pathways of spikelet to spikelet colonisation in wheat ears［J］. Fungal biology，2010，114（7）：555-571.

［28］Sella L，Gazzetti K，F(xiàn)aoro F，et al. A Fusar iumgraminearumxylanase expressed during wheat infection is a necrotizing factor but is not essential for virulence［J］. Plant Physiology and Biochemistry，2013，64：1-10.

［29］Sakurai M. On the causal fungus of rice false smut［J］. Annals of the Phytopathological Society of Japan，1934，3（1）：70-71.

［30］Singh R A，Dubey K S. Sclerotial germination and ascospore formation of Clavicepsoryzae-sativae in India［J］. Indian Phytopathology，1984，37（2）：168-170.

［31］鄧啟得. 菌核在稻曲病菌生活史中的作用研究［D］. 杭州：浙江大學(xué)，2015.