凝結(jié)芽孢桿菌增殖條件及抗性的研究

姚勇芳，廖延智，陳玉鋒，譚才鄧，鄺哲師

（1.廣東輕工職業(yè)技術(shù)學(xué)院食品與生物技術(shù)學(xué)院，廣東 廣州 510300；2.廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蠶業(yè)與農(nóng)產(chǎn)品加工研究所，廣東 廣州 510610）

凝結(jié)芽孢桿菌（Bacillus coagulans）又稱為芽孢乳酸菌，屬于硬（或厚）壁菌門腸道乳酸菌，是一類革蘭氏陽性、兼性厭氧、可產(chǎn)芽孢的特殊乳酸菌。胞體呈桿狀，兩端鈍圓，單個、成對、少數(shù)呈短鏈狀，芽孢端生，無鞭毛，最適生長溫度為 37～45℃，最適 pH 為 6.0～7.0［1-2］。1992年該菌種被美國食品與藥物管理局（FDA）和美國飼料控制官員協(xié)會列入可用于飼料的安全菌株名單中［3］。

凝結(jié)芽孢桿菌芽孢體可以很好的耐受胃酸以及高膽鹽環(huán)境到達(dá)腸道中復(fù)蘇，在腸道中消耗大量的游離氧進(jìn)行生長繁殖，對厭氧微生物乳酸菌和雙歧桿菌的生長起到促進(jìn)作用，從而調(diào)節(jié)腸道內(nèi)微生態(tài)的菌群平衡，提高機(jī)體免疫和抗病能力，減少腸道疾病的發(fā)生［4-5］。 除了具有傳統(tǒng)乳酸菌可調(diào)節(jié)動物腸道健康、提高消化能力和提高免疫力等作用外，其芽孢狀態(tài)對環(huán)境具有相當(dāng)?shù)目鼓嫘?，對高溫、胃酸和膽鹽都有一定的耐受能力［5-6］。

凝結(jié)芽孢桿菌制劑是無毒、無殘留、無污染的“綠色”添加劑，又因其具有芽孢桿菌的豐富的酶系統(tǒng)及抗逆性強(qiáng)、耐高溫高壓、穩(wěn)定的儲存特性而被廣大人們所青睞［7-9］。本試驗(yàn)通過凝結(jié)芽孢桿菌培養(yǎng)條件和培養(yǎng)基成分的優(yōu)化以及抗性研究，以期獲得高密度菌液，為在生物飼料中的應(yīng)用累積理論數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 種子液的制備 挑取凝結(jié)芽孢桿菌（廣東輕工職業(yè)技術(shù)學(xué)院食檢教研室提供）斜面菌種1環(huán)，接種至LB基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，37℃、180 r/min搖床培養(yǎng)4～6 h，制得種子液。

1.1.2 培養(yǎng)基 LB基礎(chǔ)培養(yǎng)基：酵母粉25 g/L，氯化鈉10 g/L，蛋白胨10 g/L，加水至100 mL，自然pH值，121℃，15 min高壓滅菌，備用。

LB改良培養(yǎng)基：酵母粉25 g/L，氯化鈉2 g/L，蛋白胨5 g/L，加水至100 mL，pH 7.4，121℃，15 min高壓滅菌，備用。

MRS培養(yǎng)基：取6.43 gMRS培養(yǎng)基于100 mL蒸餾水中，自然pH值，121℃，15 min高壓滅菌，備用。

1.1.3 試劑 氯化鈉、葡萄糖、硫酸錳、硫酸鎂、淀粉、麥芽糖、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、磷酸二氫鉀、氫氧化鈉、鹽酸，以上試劑均為分析純。

1.1.4 儀器 YX-280D壓力蒸汽滅菌鍋，合肥華泰醫(yī)療設(shè)備有限公司；JJ500A電子天平，蘇州常熟測試儀器廠；SW-CJ-2D超凈工作臺，蘇州凈化設(shè)備有限公司；HPX-9162MBE數(shù)顯電熱培養(yǎng)箱，上海楚柏實(shí)驗(yàn)室設(shè)備有限公司；SPH-200數(shù)顯恒溫?fù)u床，天津市歐諾設(shè)備儀表有限公司；TopPette移液槍，深圳市科力易翔儀器設(shè)備有限公司；DK-826電熱恒溫水浴鍋，上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 凝結(jié)芽孢桿增殖條件研究 （1）凝結(jié)芽孢桿菌培養(yǎng)條件：將1%種子液接種至100 mL的LB基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，轉(zhuǎn)速180 r/min，37℃培養(yǎng)。每隔2 h取菌液測定560 nm波長下的吸光度，0 h為對照，繪制24 h的生長曲線。得出最適生長時間后，分別測定最適的培養(yǎng)溫度、轉(zhuǎn)速以及初始pH值，見表1。

表1 培養(yǎng)溫度、轉(zhuǎn)速、初始pH值對凝結(jié)芽孢桿菌生長影響的研究

（2）凝結(jié)芽孢桿菌生長培養(yǎng)基成分優(yōu)化：分別改變LB基礎(chǔ)培養(yǎng)基中氯化鈉、蛋白胨及酵母粉含量，其他條件同“（1）凝結(jié)芽孢桿菌培養(yǎng)條件”，見表2。對凝結(jié)芽孢桿菌生長的LB基礎(chǔ)培養(yǎng)基進(jìn)行改良。

表2 LB基礎(chǔ)培養(yǎng)基的改良對凝結(jié)芽孢桿菌生長影響的研究（g/L）

在上述改良LB基礎(chǔ)培養(yǎng)基中分別添加葡萄糖 0、2、5、8、10 g/L，麥芽糖 0、2、5、8、10 g/L，淀粉 0、2、5、8、10 g/L，其他條件同“（1）凝結(jié)芽孢桿菌培養(yǎng)條件”，研究糖類添加物對凝結(jié)芽孢桿菌生長的影響。在改良LB基礎(chǔ)培養(yǎng)基中分別添加0∶10、3∶5、5∶8、8∶2、10∶0磷酸氫二納（g/L）和磷酸二氫鈉（g/L）之比，其他條件同“（1）凝結(jié)芽孢桿菌培養(yǎng)條件”，研究磷酸鹽添加物對凝結(jié)芽孢桿菌生長的影響。在改良LB基礎(chǔ)培養(yǎng)基中分別添加七水硫酸鎂 0、0.4、0.8、1.0、1.2、1.4，硫酸錳0、0.2、0.5、0.8 g/L，硫酸銨0、2、4、6、8 g/L，其他條件同“（1）凝結(jié)芽孢桿菌培養(yǎng)條件”，研究硫酸鹽添加物對凝結(jié)芽孢桿菌生長的影響。在單因素考察的基礎(chǔ)上，選取麥芽糖、磷酸氫二納：磷酸二氫鈉、硫酸錳和硫酸鎂4個因素，設(shè)計(jì)4因素3水平正交試驗(yàn)，見表3。進(jìn)行LB改良養(yǎng)基添加成分優(yōu)化的正交試驗(yàn)。

表3 凝結(jié)芽孢桿菌培養(yǎng)基優(yōu)化因素水平

1.2.2 凝結(jié)芽孢桿菌抗性研究 （1）凝結(jié)芽孢桿菌耐熱性：在3瓶50 mL的LB基礎(chǔ)培養(yǎng)基中分別加入“1.2.1”所得菌懸液5 mL，分別置于溫度為80、90、100℃的水浴鍋中保溫5、10、15、20、25 min，同時0 min作為對照；移取1 mL迅速冷卻，測定活菌數(shù)，計(jì)算D值和Z值，研究熱力致死時間曲線方程。

（2）凝結(jié)芽孢桿菌耐腸道環(huán)境：5瓶50 mL的LB基礎(chǔ)培養(yǎng)基pH 分別調(diào)至為2、3、4、5、6，加入“1.2.1”所得菌懸液5 mL，37℃，180 r/min的搖床中作用 3 h，同時0 h為對照。移取1 mL迅速冷卻，測定活菌數(shù)，按照以下公式計(jì)算存活率∶存活率=對照凝結(jié)芽孢桿菌菌落總數(shù)/作用3 h凝結(jié)芽孢桿菌菌落總數(shù)×100%。

5瓶50 mL的LB基礎(chǔ)培養(yǎng)基中分別加入0.2%、0.5%、0.8%、1.1%、1.4% 的豬膽鹽，加入“1.2.1”所得菌懸液5 mL，37℃，180 r/min的搖床中作用 4 h，同時0 h 為對照；移取1 mL迅速冷卻，測定活菌數(shù)，并計(jì)算存活率。

1.2.3 測定方法 凝結(jié)芽孢桿菌數(shù)的測定方法按GB 4789.35-2016《 食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 乳酸菌檢驗(yàn)》。

2 結(jié)果與分析

2.1 凝結(jié)芽孢桿菌增殖條件研究

圖1 凝結(jié)芽孢桿菌生長曲線的研究

2.1.1 凝結(jié)芽孢桿菌培養(yǎng)條件 由圖1～圖4可知，依據(jù)不同培養(yǎng)時間計(jì)數(shù)結(jié)果，繪制凝結(jié)芽孢桿菌生長曲線所示。培養(yǎng)0～20 h，經(jīng)過很短的延滯期后，進(jìn)入對數(shù)生長期，菌落總數(shù)的增長幅度較大，培養(yǎng)20 h活菌數(shù)OD值達(dá)到2.361。培養(yǎng)20 h后吸光度穩(wěn)定，活細(xì)菌數(shù)保持相對穩(wěn)定，所以選取20 h為最佳培養(yǎng)時間。31～40℃之間，溫度對凝結(jié)芽孢桿菌生長影響不大，液體菌密度在108數(shù)量級以上，37℃相對較高。凝結(jié)芽孢桿菌的總數(shù)隨著搖床轉(zhuǎn)速的增加而增加，當(dāng)轉(zhuǎn)速為180～220 r/min時總數(shù)達(dá)到109數(shù)量級，考慮到設(shè)備能耗，選擇180 r/min為最適轉(zhuǎn)速。隨著初始pH的增大，凝結(jié)芽孢桿菌數(shù)不斷增加。初始培養(yǎng)基為中性偏堿性環(huán)境促進(jìn)凝結(jié)芽孢桿菌生長。初始pH=7.4時的菌落總數(shù)達(dá)到最大9.4×109CFU/mL。凝結(jié)芽孢桿菌培養(yǎng)基生長過程中，持續(xù)產(chǎn)生乳酸，造成培養(yǎng)基pH值逐漸下降，初始培養(yǎng)基酸性越大，越不適應(yīng)凝結(jié)芽孢桿菌的生長。

圖2 培養(yǎng)溫度對凝結(jié)芽孢桿菌生長的影響

圖3 轉(zhuǎn)速對凝結(jié)芽孢桿菌生長的影響

圖4 初始pH值對凝結(jié)芽孢桿菌生長的影響

2.1.2 凝結(jié)芽孢桿菌生長培養(yǎng)基成分優(yōu)化 （1）凝結(jié)芽孢桿菌生長LB基礎(chǔ)培養(yǎng)基的改良LB基礎(chǔ)培養(yǎng)基的改良對凝結(jié)芽孢桿菌生長影響見圖5～圖7。圖5顯示，添加氯化鈉含量2g/L時凝結(jié)芽孢桿菌菌密度達(dá)到1.0×1010CFU/mL。圖6顯示，凝結(jié)芽孢桿菌總數(shù)5g/L時達(dá)到最大值2.4×1010CFU/mL。蛋白胨含量在0～20 g/L范圍時，培養(yǎng)菌液pH值維持在7.4～6.9之間，蛋白胨是由酸、堿或蛋白酶水解蛋白質(zhì)的不完全水解產(chǎn)物，是含?、胨、肽和氨基酸等的有機(jī)混合物。 圖7顯汞，酵母粉含量為0～30 g/L時，隨著酵母粉含量逐漸增加，培養(yǎng)液pH逐漸下降至中性范圍，有利酸性環(huán)境及充足的C源及微量元素，凝結(jié)芽孢桿菌在25g/L時菌密度達(dá)到最大。

圖5 氯化鈉含量對凝結(jié)芽孢桿菌生長的影響

圖6 蛋白胨含量對凝結(jié)芽孢桿菌生長的影響

圖7 酵母粉含量對凝結(jié)芽孢桿菌生長的影響

（2）改良LB基礎(chǔ)培養(yǎng)基添加物質(zhì)對凝結(jié)芽孢桿菌生長的影響：改良LB基礎(chǔ)培養(yǎng)基添加物質(zhì)對凝結(jié)芽孢桿菌生長的影響見圖8～圖12。如圖8所示，添加葡萄糖含量在2g/L時，菌密度達(dá)到最大值8.4×1010CFU/mL；添加麥芽糖含量在8.0 g/L時，菌密度達(dá)到最大值1.36×1011CFU/mL；添加淀粉含量10.0 g/L時菌密度達(dá)到8.4×1010CFU/mL，并呈上升趨勢。從凝結(jié)芽孢桿菌高殖化培養(yǎng)的影響效果上看，影響效果麥芽糖＞淀粉＞葡萄糖。由圖9可知，磷酸氫二納添加量為3 g/L、磷酸二氫鈉添加量為5g/L時凝結(jié)芽孢桿菌數(shù)達(dá)到8×10 CFU/mL。磷酸氫二鈉水溶液顯弱堿性，其水解產(chǎn)物HPO4-，具有還原性，并且較高濃度時具有一定抑菌作用，因此磷酸氫二納∶磷酸二氫鈉為0g/L∶10g/L、3g/L∶5g/L、5g/L∶8 g/L 較為合適，數(shù)量達(dá)到1010數(shù)量級。如圖10～圖12所示，硫酸鎂添加量為1.0 g/L時，菌密度達(dá)到最大，8.8×1010CFU/mL；硫酸錳添加量為0.2 g/L時，菌密度達(dá)到最大，為9.0×1010CFU/mL；硫酸銨添加量為0 g/L時，菌密度達(dá)到最大，為3.6×1010CFU/mL。

凝結(jié)芽孢桿菌的LB改良養(yǎng)基添加成分正交試驗(yàn)結(jié)果見表4。

圖8 不同糖類對凝結(jié)芽孢桿菌生長的影響

圖9 磷酸鹽對凝結(jié)芽孢桿菌生長的影響

圖10 硫酸鎂含量對凝結(jié)芽孢桿菌生長的影響

圖11 硫酸錳含量對凝結(jié)芽孢桿菌生長的影響

圖12 硫酸銨含量對凝結(jié)芽孢桿菌生長的影響

表4 凝結(jié)芽孢桿菌高殖化培養(yǎng)基成分的優(yōu)化試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案L9（34）

由表4極差R大小可知，影響因素主次為：B＞D＞C＞A；對表4結(jié)果進(jìn)行分析優(yōu)化組合為：A1B3C3D3，即麥芽糖6 g/L、磷酸氫二納∶磷酸二氫鈉之比 5∶8、硫酸鎂1.2 g/L、硫酸錳0.3 g/L。根據(jù)表2正交試驗(yàn)結(jié)果配制正交結(jié)果最優(yōu)培養(yǎng)基，對凝結(jié)芽孢桿菌進(jìn)行培養(yǎng)驗(yàn)證，結(jié)果凝結(jié)芽孢桿菌在100 mL搖瓶中培養(yǎng)后的菌落總數(shù)達(dá)到3.8×1011CFU/mL。

2.2 凝結(jié)芽孢桿菌抗性研究

圖13 凝結(jié)芽孢桿菌耐熱性研究

2.2.1 凝結(jié)芽孢桿菌耐熱性 以保溫時間為橫坐標(biāo)，存活率為縱坐標(biāo)，作出凝結(jié)芽孢桿菌耐熱曲線，結(jié)果見圖13。以加熱溫度為橫坐標(biāo)，D值為縱坐標(biāo)，作出凝結(jié)芽孢桿菌的熱力致死曲線，結(jié)果見圖14。

由圖13、圖14可知，D80℃= 82.24 min，R280℃= 0.9943，D90℃=4 7.92 min，R290℃= 0.9955，D100℃= 16.92 min，R2100℃= 0.9944，凝結(jié)芽孢桿菌的熱力致死曲線方程為y=- 3.266x+ 342.96。

2.2.2 凝結(jié)芽孢桿菌耐腸道環(huán)境優(yōu)化 由表5可知，凝結(jié)芽孢桿菌在pH值為2～6時環(huán)境中均可正常生長，在pH為2～6的強(qiáng)酸環(huán)境中存活率都可達(dá)到100%以上，耐受性良好。凝結(jié)芽孢桿菌在豬膽鹽濃度為0.2%～1.4%之間均可正常生長，且存活率均可達(dá)到100%以上。

圖14 凝結(jié)芽孢桿菌熱力致死曲線

表5 凝結(jié)芽孢桿菌耐腸道環(huán)境的研究

3 結(jié)論與討論

（1）通過培養(yǎng)基配方及培養(yǎng)條件的研究，得出凝結(jié)芽孢桿菌最適增殖條件為：最佳培養(yǎng)基配方：氯化鈉：2 g/L，蛋白胨：5 g/L，酵母粉：25 g/L，麥芽糖6 g/L，磷酸氫二納（g/L）∶磷酸二氫鈉（g/L）之比5∶8，硫酸鎂1.2 g/L，硫酸錳0.3 g/L，初始pH值：7.4，轉(zhuǎn)速180 r/min，37℃培養(yǎng)20 h，菌落總數(shù)可達(dá)到3.8×1011CFU/mL。

凝結(jié)芽孢桿菌生長周期進(jìn)入衰亡期不明顯，可能是后期形成芽孢對環(huán)境有較強(qiáng)的抗逆性。通過改變搖床轉(zhuǎn)速而改變培養(yǎng)基瓶內(nèi)的通氧量，凝結(jié)芽孢桿菌是兼性厭氧菌，在一定范圍內(nèi)，搖床轉(zhuǎn)速越大，不斷提高培養(yǎng)基內(nèi)溶氧水平，能夠大量繁殖，超過180 r/min，溶氧達(dá)到飽和狀態(tài)。

氯化鈉含量對有效菌體維持內(nèi)外滲透壓平衡，同時有效提供 Na+、Cl-［10］，鈉含量的增加，導(dǎo)致菌體脫水同時溶氧量下降，產(chǎn)酸能力加強(qiáng)，pH降低，不適應(yīng)微生物數(shù)量增長［11］；蛋白胨富含有機(jī)氮化合物，也含有一些維生素和糖類，是作為微生物培養(yǎng)基的主要原料之一，是一種兩性電介質(zhì)，具有一定的緩沖作用，易溶于水，便于細(xì)菌生長繁殖。 當(dāng)?shù)鞍纂撕窟^高時，培養(yǎng)基中含氮化合物，造成C∶N比失調(diào)，不利于凝結(jié)芽孢桿菌的生長繁殖［12-14］。

當(dāng)培養(yǎng)基中葡萄糖含量較高時，凝結(jié)芽孢桿菌能快速利用單糖，被用于乳酸發(fā)酵產(chǎn)生L-乳酸，使pH值快速降低，反而抑制了凝結(jié)芽孢桿菌的代謝生長。麥芽糖、淀粉同樣濃度條件下，通過凝結(jié)芽孢桿菌分泌的а-淀粉酶等胞外酶，分解形成更多有效的C源物質(zhì)，促進(jìn)菌體合成代謝，利于生長。但當(dāng)?shù)矸蹪舛冗^高時，培養(yǎng)基呈粘稠度較高的糊狀，不利于培養(yǎng)基溶氧，不適合凝結(jié)芽孢桿菌的生長［15-16］。

培養(yǎng)基中添加磷酸鹽既可以為細(xì)菌的生長繁殖提供必要的磷元素，構(gòu)成核酸、磷脂、許多輔酶或輔基、各種磷酸腺苷（ADP、ATP等）、磷酸維生素B2等［17］；同時也可以利用磷酸鹽對溶液的酸堿度維持作用使培養(yǎng)基pH值穩(wěn)定，以期能進(jìn)一步促進(jìn)凝結(jié)芽孢桿菌的生長繁殖。

微生物從外界環(huán)境中以硫酸根離子態(tài)吸收硫，用于自身生長代謝，通過添加金屬硫酸鹽，既可以向培養(yǎng)基中添加硫元素，又可以添加必要的金屬元素。鎂元素是許多酶的活化劑，能促進(jìn)碳水化合物的新陳代謝、核酸的合成等。錳離子是一些生化反應(yīng)的催化劑，并且硫酸錳可以促進(jìn)芽孢桿菌產(chǎn)芽孢，添加過量造成菌體蛋白質(zhì)變性，抑制菌體生長。凝結(jié)芽孢桿菌不能利用銨鹽作為氮源，同時銨鹽對凝結(jié)芽孢桿菌胞外酶的合成有較強(qiáng)抑制作用［18-19］。

（2）通過對凝結(jié)芽孢桿菌菌液耐熱性、耐酸性以及耐膽鹽性的研究，得出凝結(jié)芽孢桿菌D80℃= 82.24 min，R80℃2= 0.9943，D90℃= 47.92 min，R90℃2= 0.9955，D100℃= 16.92 min，R100℃2= 0.9944，熱力致死曲線方程為y= -3.266x+ 342.96。飼料的制粒溫度一般為70～90℃，在調(diào)制器和制粒機(jī)內(nèi)總的時間為25～30 s。計(jì)凝結(jié)芽孢桿菌分別在80、90℃熱接觸30 s時，存活率分別為100%和95.21%。

在pH值為2～6中，存活率均超過100%。pH主要通過影響菌體細(xì)胞膜電荷、膜滲透性及營養(yǎng)物質(zhì)離子化程度，從而影響菌體對養(yǎng)分的吸收。益生菌需要進(jìn)入動物須經(jīng)過胃酸環(huán)境（pH范圍為2.6～5.83） 才能到達(dá)腸胃發(fā)揮作用。

并且對豬膽鹽也有具有良好的耐受性，在0.2% -1.4%的豬膽鹽溶液中存活率超過100%。芽孢桿菌在動物胃腸道存活和增殖的另一道屏障就是需要經(jīng)受住小腸液對菌體的破壞作用。十二指腸中的膽汁酸鹽對外源細(xì)菌具有抑制作用，菌體只有具備較高的膽鹽耐受性，才能保持足夠的活菌數(shù)，從而發(fā)揮益生作用［20-21］。

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