冷誘導RNA結合蛋白通過激活NF-κB信號通路影響H1N1甲型流感病毒的復制

聶培婷，湯　承，岳　華

(西南民族大學生命科學與技術學院，成都 610041)

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冷誘導RNA結合蛋白通過激活NF-κB信號通路影響H1N1甲型流感病毒的復制

聶培婷，湯承，岳華*

(西南民族大學生命科學與技術學院，成都 610041)

冷誘導RNA結合蛋白(CIRP)是NF-κB和ERK信號通路的上游調控因子，而這兩條信號通路是甲型流感病毒復制和機體起始免疫所必需的，為探討CIRP對H1N1甲型流感病毒復制的影響及可能的分子機制，構建了CIRP過表達BHK-21細胞系(Cirp+BHK-21)，用Western blot檢測NF-кB和ERK1/2的磷酸化水平，研究CIRP對NF-кB和ERK1/2的調節(jié)作用；用Real-time RT-PCR檢測H1N1甲型流感病毒感染后Cirp+BHK-21和對照細胞中病毒拷貝數(shù)的動態(tài)變化，以及在特異性阻斷劑PDTC阻斷NF-кB通路的Cirp+BHK-21細胞中病毒拷貝數(shù)的動態(tài)變化。Western blot檢測結果顯示：過表達CIRP顯著促進了BHK-21細胞中NF-κB的磷酸化水平(P<0.05)，而對ERK1/2的磷酸化水平無顯著影響；病毒定量檢測結果顯示：過表達CIRP能顯著促進H1N1甲型流感病毒的增殖，感染后3、9、15、21 h 病毒在Cirp+BHK-21細胞中的拷貝數(shù)分別為對照組的111%、103%、167%和235% (P<0.05)；阻斷NF-κB信號通路后病毒的拷貝數(shù)顯著下降，在感染后3、9、15、21 h分別為未阻斷組的98%、42%、19%(P<0.05)和7%(P<0.05)。從本研究結果可見，CIRP可通過活化NF-κB信號通路促進H1N1甲型流感病毒的復制。

冷誘導RNA結合蛋白；H1N1甲型流感病毒；病毒復制；NF-κB；BHK-21細胞

甲型流感病毒(influenza A virus)為正黏病毒科(orthomyxoviridae)成員，基因組為分節(jié)段的單股負鏈RNA[1]。甲型流感病毒感染后觸發(fā)了宿主細胞一系列的分子事件，一方面幫助病毒完成復制周期，同時也激活了機體的免疫應答以抵抗病毒感染[2-7]。最近，有三個研究團隊利用全基因組RNA干涉技術鑒定出一大批與流感病毒復制有關的宿主因子[4-5]。涉及病毒復制和轉錄、機體的免疫應答、機體與病毒vRNP相互作用和病毒RNA合成等相關的多種宿主因子[8-16]，其中包括一些RNA結合蛋白(RNA-binding proteins，RanBP)家族成員，如RNA結合蛋白GFSF-1與流感病毒蛋白的合成有關[17-18]，RNA結合蛋白PKR的胞內抑制劑P58IPK能促進流感病毒蛋白的合成[19]。RNA結合蛋白3(RanBP3)與甲型流感病毒的出核轉運有關[20]，在流感病毒感染過程中還存在干擾素IFN-β合成的RNA結合蛋白調控網(wǎng)絡，激酶PKR、多重剪接RNA結合蛋白(RNA-binding protein with multiple splicing，RBPMS)、白介素增強子結合因子3(interleukin enhancer-binding factor 3，ILF3)、FMR1、DHX9、ZNF346和HNRPC參與其中[11]。

冷誘導RNA結合蛋白(CIRP)是一種在脊椎動物間高度保守的多功能蛋白，參與對溫和低溫[21]、H2O2[22]、缺氧[23]、滲透壓[24]等多種應激的轉錄應答，發(fā)揮細胞保護作用[25-26]，同時參與胚胎發(fā)育、神經(jīng)調節(jié)[27]和生物鐘調節(jié)等生理過程，此外，CIRP還參與機體對新城疫病毒(NDV)[28]、細菌內毒素(LPS)[29]的轉錄應答，但未見CIRP對流感病毒感染應答的研究。業(yè)已證明，ERK通路和核因子κB通路(NF-κB)是流感病毒復制所必需的[30-34]，而CIRP作為這兩條信號通路的上游調控因子，可能通過這兩條信號通路影響病毒復制。本研究旨在探討CIRP對流感病毒復制的影響及其分子機制，為深入解析流感病毒與宿主之間相互作用的分子機制提供參考。

1　材料與方法

1.1細胞株和毒株

過表達CIRP的BHK-21細胞系(Cirp+BHK-21)和對照細胞系(BHK-21 GFP)由作者實驗室構建[35]；H1N1甲型流感病毒PR/8毒株(HA效價為28)由四川省疾病預防控制中心惠贈。

1.2主要試劑和儀器

高糖DMEM培養(yǎng)基(HyClone公司)；胎牛血清(GIBCO公司)；RNA提取試劑盒(Invitrogen公司)；反轉錄試劑盒(TaKaRa公司)；NF-κB特異性抑制劑PDTC、TPCK胰酶(Sigma 公司)；BCA試劑盒、RIPA蛋白裂解液(碧云天公司)；CIRP兔抗人多克隆抗體(Proteintech公司)；一抗為鼠抗NF-κB P65、ERK1/2磷酸化抗體(p-ERK1/2)、ERK1/2抗體(碧云天公司)；二抗為HRP標記的羊抗鼠IgG抗體(北京中杉金橋公司)；ECL發(fā)光試劑盒(TransGen公司)；電泳儀、轉膜儀(Bio-Rad公司)；ABI 7300熒光定量PCR儀(美國ABI公司)；Casy TT細胞計數(shù)儀(Roche公司)。

1.3NF-κB和ERK1/2的磷酸化水平的測定

NF-кB和ERK1/2的磷酸化水平(p-ERK1/2)是判斷這兩條信號通路是否被激活的重要指標，檢測ERK磷酸化水平時需要同時檢測ERK1/2的表達水平以確保試驗結果的準確性。根據(jù)RIPA裂解液說明書提取Cirp+BHK-21和BHK-21 GFP細胞總蛋白質，BCA法蛋白質定量，并制備蛋白質含量10 μg·μL-1的電泳樣品，取8 μL(80 μg總蛋白質)蛋白質經(jīng)SDS-PAGE后轉印到PVDF膜上，5%的脫脂奶粉4 ℃封閉過夜。分別加入3 mL 1∶300稀釋一抗(NF-κB P65、p-ERK1/2和ERK1/2)，4 ℃封閉過夜，隨后加入3 mL 1∶5 000稀釋的二抗，37 ℃孵育1 h，按照ECL試劑盒說明書顯色，最后用X-膠片曝光。以β-actin作為內參，quantity one分析軟件檢測蛋白質灰度值，應用SPSS軟件進行數(shù)據(jù)處理，分析過表達CIRP對BHK-21細胞中NF-κB和ERK1/2磷酸化水平的影響。

1.4CIRP對H1N1甲型流感病毒復制的影響

1.4.1PR-8感染Cirp+BHK-21和BHK-21 GFP細胞將Cirp+BHK-21和BHK-21 GFP分別培養(yǎng)于6孔細胞培養(yǎng)板，待細胞形成致密單層時，接種1MOI (1拷貝·cell-1)PR/8，置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中孵育1 h后棄去接種物，加入2.5 mL·孔-1維持液(4%胎牛血清、5 μg·mL-1TPCK胰酶)置于37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.4.2病毒拷貝數(shù)的測定在感染后3、9、15和21 h分別收集Cirp+BHK-21和BHK-21 GFP上清各3孔，用RNA試劑盒提取總RNA，并用反轉錄試劑盒合成cDNA，用Real-time RT-PCR方法[36]檢測病毒在Cirp+BHK-21和BHK-21 GFP中的拷貝數(shù)，用Ppia作為內參基因[37]，用甲型H1N1流感病毒M基因Real-time RT-PCR方法的標準曲線公式(y=30.62-3.53x)計算病毒拷貝數(shù)。

1.5阻斷NF-κB信號通路對流感病毒復制的影響1.5.1PDTC對NF-κB信號通路阻斷效果測定將Cirp+BHK-21細胞培養(yǎng)在75 cm2培養(yǎng)瓶中，待形成致密單層后，加入DMSO溶解的25 μmol·L-1PDTC按照文獻[38]進行處理，另取3瓶加入等體積的DMSO作為對照組，37 ℃、5% CO2培養(yǎng)3 h，按“1.3”方法提取總蛋白質并檢測NF-κB的磷酸化水平，以β-actin作為內參基因，評價PDTC的阻斷效果。1.5.2阻斷NF-κB信號通路對流感病毒復制的影響待Cirp+BHK-21細胞在6孔培養(yǎng)板中長成致密單層后，按“1.5.1”方法加入PDTC，15 min后棄去上清，以阻斷劑稀釋液代替PDTC處理Cirp+BHK-21作為對照組；兩組細胞按“1.4.1”方法感染PR/8，分別于感染后3、9、15和21 h收集兩組病毒各3孔，按“1.4.2”的方法檢測病毒拷貝數(shù)。

1.6數(shù)據(jù)分析

所有待檢樣本均進行3次平行重復試驗，并用SPSS18.0軟件進行分析。

2　結　果

2.1過表達CIRP 顯著提高了NF-κB的磷酸化水平

對Cirp+BHK-21中和BHK-21 GFP細胞中NF-κB P65、ERK1/2和p-ERK1/2的表達磷酸化水平的檢測結果顯示，Cirp+BHK-21中ERK1/2(圖1A、1B)和p-ERK1/2(圖1C)的磷酸化水平略升高，但與對照組無顯著差異(P>0.05)；而NF-κB P65(圖1D)的表達水平顯著提高(P<0.05)，說明過表達CIRP能顯著提高BHK-21細胞中NF-κB的磷酸化水平，激活NF-κB信號通路，但其對ERK信號通路無明顯影響。

A.Western blot 檢測結果；B.ERK1/2半定量測定結果；C.p-ERK1/2半定量測定結果；D.NF-κB p65半定量測定結果；*.差異顯著(P<0.05) A.The result of Western blot；B.The semi-quantitative result of ERK1/2；C.The semi-quantitative result of p-ERK1/2；D.The semi-quantitative result of NF-κB p65；*.Significant difference (P<0.05)圖1　Crip+BHK-21和BHK-21 GFP細胞中ERK1/2、P-ERK1/2和 NF-κB P65的表達水平Fig.1　Expression of NF-κB P65，P-ERK1/2，ERK1/2 in Crip+BHK-21 whole-cells and control whole-cells

2.2過表達CIRP促進流感病毒的增殖

病毒定量檢測結果顯示，在感染后3、9、15和21 h，Crip+BHK-21中病毒的拷貝數(shù)分別為對照組的111%、103%、167%和235%(P<0.05)(表1)，說明過表達CIRP促進了H1N1甲型流感病毒在BHK-21細胞中的增殖。

細胞系Cellline時間/hTimespostinfection(h)391521Cirp+BHK-211.29±0.103.46±1.589.76±2.2421.8±3.30*BHK-21GFP1.16±0.433.35±2.145.97±2.949.64±1.76

*.P<0.05

2.3PDTC對NF-κB信號通路的阻斷效果

阻斷試驗結果表明，PDTC顯著抑制了NF-κB的磷酸化作用，阻斷了NF-κB信號通路(圖2)。

2.4阻斷NF-κB信號通路抑制了流感病毒的復制

阻斷NF-κB信號通路，導致H1N1甲型流感病毒在Cirp+BHK-21細胞中的拷貝數(shù)明顯降低，在感染后3、9、15和21 h分別為對照組的98%、42%、19%(P<0.05)和7%(P<0.05)(圖3)?？梢?，CIRP通過激活NF-κB信號通路促進H1N1甲型流感病毒在BHK-21細胞中的復制。

圖2　PDTC對NF-κB信號通路的阻斷效果Fig.2　The blocking effect of PDTC

圖3　阻斷NF-κB抑制了CIRP過表達引起的H1N1甲型流感病毒滴度增加Fig.3　Inhibition of NF-κB p65 expression blocked the increase of virus titers caused by CIRP overexpression

3　討　論

3.1過表達的CIRP能顯著促進流感病毒在BHK-21細胞中的增殖

本研究中，在感染后21 h病毒拷貝數(shù)在過表達的BHK-21細胞中極顯著升高，病毒滴度提高1倍以上，說明CIRP可能是通過激活細胞中一系列分子事件最終促進流感病毒增殖。BHK-21對多種動物病毒敏感，是包括流感病毒在內的多種動物病毒疫苗生產(chǎn)常用的培養(yǎng)系統(tǒng)，篩選和培育病毒高產(chǎn)細胞系一直是疫苗生產(chǎn)最迫切追求的目標，本研究證實穩(wěn)定過表達CIRP能大大提高流感病毒在BHK-21中的滴度，為培育病毒高產(chǎn)細胞系提供了新思路。

3.2CIRP通過激活NF-κB信號通路促進流感病毒復制

研究證明，過表達的CIRP能引起NF-κB磷酸化水平的上調[30]，CIRP是NF-κB信號通路的上游調控因子，而這條信號通路是流感病毒復制所必需的[31，34]。NF-κB是一個具有抗凋亡活性的轉錄因子，參與免疫應答和轉錄調控，廣泛地影響參與細胞存活、分化和增殖的基因的表達[5]，并在流感病毒復制中發(fā)揮重要作用，阻斷人肺上皮細胞A549和U1752中NF-κB信號通路的激活可以抑制流感病毒的感染和增殖[30，39]。在本研究中，阻斷NF-κB信號通路也同時阻斷了由CIRP過表達引起的病毒滴度的增加，說明CIRP通過激活NF-κB信號通路促進流感病毒復制。業(yè)已證明NF-κB信號通路促進流感病毒復制的分子機制主要有以下三種：第一，NF-κB通過調控凋亡因子如腫瘤壞死因子相關凋亡誘導配體(TRAIL)或FasL[40]，隨后激活caspases途徑，從而促進病毒核糖核蛋白復合體(RNPs)的輸出[41-42]；第二，涉及NF-κB的依賴性反作用類型的干擾素誘導基因(ISG)的表達，可能會通過上調細胞因子信號轉導抑制因子3(SOCS-3)和/或通過直接抑制ISG啟動子區(qū)域[43-44]；第三，在流感病毒感染的細胞中，NF-κB抑制劑能特異性地降低病毒RNA(vRNA)水平及RNA的轉錄水平，P65亞基似乎與vRNA合成調節(jié)有關，提示NF-κB可能調節(jié)流感病毒RNA的合成[45]。但CIRP激活NF-κB通路的分子機制還不十分清楚，有待進一步研究。

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(編輯白永平)

Activation of Cold-inducible RNA-binding Protein by H1N1 Influenza Virus Contributes to Viral Replication Via Activating NF-κB Pathway

NIE Pei-ting，TANG Cheng，YUE Hua*

(CollegeofLifeScienceandTechnology，SouthwestUniversityforNationalities，Chengdu610041，China)

The cold-inducible RNA-binding protein (CIRP) is an upstream regulator of the NF-κB and ERK pathways，which are essential for the replication of the influenza virus and the initial immune response.In order to investigate the effect of CIRP on the replication of H1N1 influenza A virus and its possible molecular mechanism，in this study，CIRP overexpression BHK-21 (Cirp+BHK-21) cells were constructed，and the phosphorylation levels of NF-κB and ERK in Cirp+BHK-21 cells were detected by Western blot to confirm the effect of CIRP on regulation of NF-κB and ERK1/2；Real-time RT-PCR was used to detect the dynamic changes of virus load in Cirp+BHK-21 and control cells after infected with influenza A virus，the method was also used to detect the dynamic changes of virus load in Cirp+BHK-21 cells which were blocked by the NF-κB inhibitor PDTC.The results of Western blot exhibited that overexpressed CIRP could significantly increase the expression of phosphorylation level of NF-κB (P<0.05)，but had no significant effect on the phosphorylation level of ERK.The results of quantitative detection of virus showed that overexpressed CIRP could significantly enhance the proliferation of influenza A virus，the virus load in the Cirp+BHK-21 cells were 111%，103%，167% and 235% (P<0.05) at 3，9，15 and 21 h PI，respectively，compared to the control group；Blocking the NF-κB was significantly decreased the virus load in the Cirp+BHK-21，and the virus load in treatment group were 98%，42%，19% (P<0.05)，7% (P<0.05) at 3，9，15 and 21 h PI，respectively，compared to the unblock group.Therefore，this study confirmed that overexpressed CIRP could enhance the proliferation of influenza A virus via activation of NF-κB pathway.

cold-inducible RNA binding protein；influenza A virus；replication；NF-κB；BHK-21 cells

10.11843/j.issn.0366-6964.2016.10.020

2016-05-06

國家自然科學基金項目(31172307)；四川省教育廳創(chuàng)新團隊項目(13TD0057)

聶培婷(1989-)，女，新疆霍城人，碩士，主要從事感染與免疫相關研究，E-mail：540016852@qq.com

岳華，Tel：028-85528276，E-mail：yhua900@163.com

S852.23

A

0366-6964(2016)10-2108-07