一種新型火雞皰疹病毒細(xì)菌人工染色體的構(gòu)建與鑒定

王志勝，劉　芳，許夢微，喬永峰，侯繼波，王繼春*

(1.江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院/ 國家獸用生物制品工程技術(shù)研究中心，南京 210014；2.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院，南京 210095；3.江蘇省動物重要疫病與人獸共患病防控協(xié)同創(chuàng)新中心，揚(yáng)州 225009)

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一種新型火雞皰疹病毒細(xì)菌人工染色體的構(gòu)建與鑒定

王志勝1，3，劉芳1，2，許夢微1，2，喬永峰1，3，侯繼波1，3，王繼春1，3*

(1.江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院/ 國家獸用生物制品工程技術(shù)研究中心，南京 210014；2.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院，南京 210095；3.江蘇省動物重要疫病與人獸共患病防控協(xié)同創(chuàng)新中心，揚(yáng)州 225009)

擬構(gòu)建一種新型火雞皰疹病毒(HVT)全基因組細(xì)菌人工染色體(BAC)，通過同源重組方法將mini-F載體插入HVT基因組的糖蛋白C(glycoprotein C，gC)基因的等位位點(diǎn)得到mini-F重組HVT，提取重組病毒的DNA轉(zhuǎn)入大腸桿菌DH10B細(xì)胞，再轉(zhuǎn)入GS1783細(xì)胞獲得BAC，拯救病毒獲得mini-F重組病毒和gC恢復(fù)病毒后，與親本病毒(HVT FC126)比較生長動力學(xué)和對雞馬立克病的免疫效力。結(jié)果：獲得數(shù)個BAC陽性克隆，取其中一個克隆(BACHVT-G)成功拯救出HVT mini-F重組病毒(HVTBAC-ΔgC)，并成功獲得了gC恢復(fù)毒株(HVTBAC-gC-R)。生長特性和免疫效力試驗(yàn)表明HVTBAC-gC-R與HVT FC126無顯著差異，而HVTBAC-ΔgC增殖能力和免疫效力均明顯下降。成功構(gòu)建了HVT全基因組的感染性BAC；HVT的gC基因是一個非必需基因，但對病毒的增殖能力和免疫效力有重要影響。

火雞皰疹病毒；細(xì)菌人工染色體；糖蛋白C；生長動力學(xué)；免疫效力

火雞皰疹病毒(herpesvirus of turkey，HVT)屬于甲型皰疹病毒亞科馬立克病毒屬，研究發(fā)現(xiàn)，在遺傳學(xué)和血清學(xué)上，HVT與馬立克病病毒(Marek’s disease virus，MDV)具有相關(guān)性[1]，且HVT對雞不致病，HVT FC126株被廣泛用于預(yù)防雞的馬立克病(Marek’s disease，MD)[2]。

HVT 病毒顆粒大小約為160 nm，核衣殼呈二十面體，HVT基因組為雙鏈 DNA，大小約為158 kb (GenBank：AF291866)[3]。HVT基因組大，有許多非必需基因和非編碼區(qū)，能夠容納大片段外源基因序列的插入；HVT對雞極為安全，不產(chǎn)生任何副反應(yīng)；可以進(jìn)行胚內(nèi)接種或1日齡早期接種免疫；不但能避免母源抗體的干擾而且啟動免疫快；病毒接種雞后可以持續(xù)長達(dá)72周的病毒血癥[4-5]，因此，HVT是一種較理想的雞用活疫苗載體。目前，國外已成功應(yīng)用HVT構(gòu)建了多種病毒載體活疫苗，其中包括表達(dá)雞新城疫病毒(Newcastle disease，NDV)F抗原的HVT載體活疫苗，如Innovax?-ND-SB (MSD Animal Health)和Vectormune?HVT-NDV (Ceva)，還有表達(dá)雞傳染性法氏囊病病毒(infectious bursal disease virus，IBDV)VP2抗原的HVT載體活疫苗，如 Vaxxitek?HVT+IBD (Merial) 和 Vectormune?HVT-IBD (Ceva)等，展現(xiàn)了HVT作為活疫苗載體的優(yōu)良效果[6-12]。

構(gòu)建皰疹病毒重組載體活疫苗的常用方法有同源重組或黏粒再生[13-14]，篩選方法通常是通過LacZ 或GFP標(biāo)記等[15]。然而，HVT基因組大，又具有較強(qiáng)的細(xì)胞結(jié)合性，使其在真核細(xì)胞中同源重組時轉(zhuǎn)染效率較低，且重組毒株的篩選和純化困難重重，通常難于獲得完全純化的重組病毒，嚴(yán)重影響重組活載體疫苗的構(gòu)建。黏粒再生是將病毒基因組分成幾個片段分別克隆后再通過共轉(zhuǎn)染進(jìn)行病毒拯救，雖然可以在原核系統(tǒng)中進(jìn)行基因改造，但操作過程繁瑣，病毒拯救效率低[13]。皰疹病毒的細(xì)菌人工染色體(bacterial artificial chromosome，BAC)及“enpassant”重組技術(shù)是近年來發(fā)展起來的一項(xiàng)新技術(shù)，能大大提高構(gòu)建重組皰疹病毒的效率[16-18]。皰疹病毒BAC是將mini-F序列通過同源重組插入病毒基因組的非功能區(qū)或者非必需基因，再將含mini-F的重組病毒基因組導(dǎo)入大腸桿菌構(gòu)建而成[19]。BAC可通過應(yīng)用原核生物大量的基因操作工具進(jìn)行基因改造，然后將重組子進(jìn)行病毒拯救獲得重組病毒，這項(xiàng)技術(shù)能大大提高對病毒進(jìn)行基因工程改造的效率，而且細(xì)菌人工染色體進(jìn)行單拷貝或低拷貝復(fù)制，不易發(fā)生變異[20-21]。由B.Tischer 等建立的基于Red 重組系統(tǒng)的“enpassant”技術(shù)與BAC 技術(shù)結(jié)合，使同源重組直接由載體菌(E.coliGS1783)表達(dá)的Red 酶系統(tǒng)來完成，重組的效率得到了更大地提高[22]。目前已在馬立克病病毒和鴨瘟病毒等多個動物皰疹病毒株成功構(gòu)建了BAC，大大加快了對相關(guān)病毒致病機(jī)制研究和活載體疫苗構(gòu)建的步伐[21，23-25]。

已報道的HVT BAC的構(gòu)建是將mini-F序列插入HVT基因組的US2區(qū)，雖然獲得了具有感染性的克隆，但是mini-F重組病毒很不穩(wěn)定，有些重組毒在傳代后即失去增殖能力，而且從感染性克隆拯救獲得的病毒的生長特性也不一致，有些病毒的增殖能力大大減弱，這些結(jié)果表明將mini-F 插入US2位點(diǎn)可能對HVT的正常復(fù)制有干擾作用[15，26]。本研究將mini-F 序列插入HVT基因組的gC基因位點(diǎn)，并替換敲除gC基因，以獲得穩(wěn)定的HVT BAC，為HVT活載體疫苗的構(gòu)建和改進(jìn)提供可靠的技術(shù)平臺。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1質(zhì)粒與細(xì)菌Mini-F質(zhì)粒和GS1783菌株由柏林自由大學(xué)病毒研究所Nikolaus Osterriender教授惠贈，GS1783菌株的感受態(tài)細(xì)胞由本室自制。DH10B感受態(tài)細(xì)胞購自Invitrogen公司。Plasmid Mini Kit 和 Midi Kit購自 QIAGEN 公司。

1.1.2病毒與細(xì)胞HVT FC126病毒株來自中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所(CVCC AV19)，制備雞胚成纖維細(xì)胞的SPF雞胚購自北京梅里亞維通實(shí)驗(yàn)動物技術(shù)有限公司。馬立克病病毒京-1株強(qiáng)毒株(CVCC AV86)來自中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，系由本室擴(kuò)繁的全血病毒，液氮保存。

1.1.3生化試劑等限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ、Hind Ⅲ、SmaⅠ、ScaⅠ、BamHⅠ和PacⅠ及 ExTaqDNA 聚合酶均購自TaKaRa公司；DMEM培養(yǎng)基、胰酶及新生牛血清購自Sigma 公司；其他試劑均購自南京生工生物有限公司。

1.1.4實(shí)驗(yàn)動物SPF雞是用購自北京梅里亞維通實(shí)驗(yàn)動物技術(shù)有限公司的SPF雞胚在本單位孵化而得，試驗(yàn)雞飼養(yǎng)于隔離環(huán)境中。

1.1.5PCR引物根據(jù)HVT FC126 株全長基因組序列(GenBank：AF291866)，應(yīng)用Vector NTI軟件設(shè)計(jì)gC基因上、下游同源臂擴(kuò)增的PCR引物和擴(kuò)增含gC基因片段序列的PCR引物(表1)，由南京金斯瑞生物科技有限公司合成。

表1PCR引物

Table 1PCR primers

引物Primers引物序列(下劃線為添加的酶切位點(diǎn))Primersequences(restrictionsitesareunderlined)HVT-BH1F5'-GTAGAATTCCAGTGTATGTTCCTTAGTGT-3'(EcoRⅠ)HVT-BH1R5'-ATCCCGGGCTTTAATTAAGTTTCGATAGATGCGTAATA-3'(SmaⅠ、PacⅠ)HVT-BH2F5'-CGGGATCCAGTTAATTAAATCAGCACCATCGCATTG-3'(BamHⅠ、PacⅠ)HVT-BH2R5-GACAAGCTTGAAATGTCTATGGTGTGATTGGA-3'(HindⅢ)HVT-gCF5'-TCGCCATGTGCGCCACTAGCAT-3'HVT-gCR5'-AACACACACAAGACGCGAGGGCTC-3'

1.2方法

1.2.1轉(zhuǎn)移載體pUC19(HVT)-H1-H2-miniF的構(gòu)建及酶切驗(yàn)證參照文獻(xiàn)所述方法[21]，提取HVT FC126基因組DNA作為模板，應(yīng)用特異性引物(表1)，通過PCR反應(yīng)擴(kuò)增gC基因的上游同源臂H1和下游同源臂H2，再通過酶切連接將H1和H2先后連接到基礎(chǔ)載體質(zhì)粒pUC19上獲得pUC19(HVT)-H1-H2；然后，再將mini-F酶切插入到pUC19(HVT)-H1-H2同源臂H1和H2之間的PacⅠ酶切位點(diǎn)處，獲得gC位點(diǎn)的轉(zhuǎn)移載體pUC19(HVT)-H1-H2-miniF。連接好的載體通過應(yīng)用ScaⅠ和EcoRⅠ進(jìn)行酶切鑒定，應(yīng)用Vector NTI軟件預(yù)測酶切后的片段應(yīng)分別為10 165與3 775 bp大小的2條和7 507、5 095與1 338 bp的3條條帶(圖1A)。

1.2.2轉(zhuǎn)移載體pUC19(HVT)-H1-H2-miniF和HVT DNA共轉(zhuǎn)染CEF根據(jù)文獻(xiàn)描述的方法[21]，首先提取感染HVT后48～72 h細(xì)胞中病毒的DNA，取約1 μg HVT DNA與5～10 μg轉(zhuǎn)移載體質(zhì)粒pUC19(HVT)-H1-H2-miniF的DNA采用磷酸鈣沉淀法共轉(zhuǎn)染原代雞胚成纖維細(xì)胞(chicken embryo fibroblast，CEF)。轉(zhuǎn)染細(xì)胞傳代培養(yǎng)，在波長為488 nm紫外光下觀察，當(dāng)出現(xiàn)發(fā)出綠色熒光的細(xì)胞病變蝕斑時，挑取綠色蝕斑傳到新鮮制備的單層CEF上培養(yǎng)擴(kuò)增重組病毒。

1.2.3Mini-F重組病毒HVT與親本病毒HVT的分離與純化Mini-F重組HVT經(jīng)連續(xù)數(shù)次挑取綠斑再接種于6孔板CEF內(nèi)純化和擴(kuò)繁后，收集6孔板內(nèi)的細(xì)胞毒采取超聲波裂解進(jìn)行細(xì)胞破碎，破碎細(xì)胞病毒液10倍倍比稀釋接種96孔新鮮制備的CEF平板上，篩選單孔出現(xiàn)單個綠斑的重組病毒，經(jīng)再次接入CEF進(jìn)行擴(kuò)繁，同時加GPT進(jìn)行加壓培養(yǎng)，即接入前1 h細(xì)胞培養(yǎng)液換成GPT加壓篩選培養(yǎng)液(含10%血清、1% S/P，350 μg·mL-1霉酚酸、80 μg·mL-1黃嘌呤和100 μg·mL-1次黃嘌呤的DMEM)，每24 h換一次加壓篩選培養(yǎng)液，以獲得純化的mini-F重組HVT。

1.2.4mini-F重組HVT DNA的轉(zhuǎn)化及其篩選驗(yàn)證根據(jù)文獻(xiàn)描述的方法[21]，提取mini-F重組HVT細(xì)胞毒DNA，取約5 μg加到50 μL電轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞E.coliDH10B中。輕輕混勻，冰浴 5 min 左右，吸入到規(guī)格為 0.1 cm經(jīng)預(yù)冷的電轉(zhuǎn)化杯中，應(yīng)用美國哈佛儀器公司 ECM630 電轉(zhuǎn)儀，電轉(zhuǎn)化條件為 1 500 V、200 Ω、25 μF，電擊完成后，加入到32 ℃預(yù)熱的SOC培養(yǎng)基中，32 ℃、220 r· min-1振蕩活化1 h，500 g 離心5 min，取細(xì)菌沉淀用150 μL LB重懸后均勻涂布于含30 μg·mL-1氯霉素的LB瓊脂平板上，32 ℃培養(yǎng)48 h 以上。然后，挑取陽性BAC克隆單菌落接種于含有 30 μg·mL-1氯霉素的LB培養(yǎng)液中，32 ℃振蕩培養(yǎng)過夜，提取DNA，應(yīng)用限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ和BamHⅠ進(jìn)行RFLP鑒定，將酶切圖譜與應(yīng)用Invitrogen軟件預(yù)測的HVT FC126株的圖譜進(jìn)行對比分析。經(jīng)鑒定正確后，再以上述相同方法將DNA通過電轉(zhuǎn)化導(dǎo)入自制的E.coliGS1783中，再次挑取陽性BAC克隆后，采用Qiagen plasmid Midi Kit提取BAC質(zhì)粒DNA后進(jìn)行RFLP鑒定。

1.2.5HVT BAC的病毒拯救和gC恢復(fù)毒株的獲得HVT BAC的病毒拯救參照文獻(xiàn)方法進(jìn)行[21]，采用Qiagen plasmid Midi kit 按照說明書提取HVT BAC的 DNA，取約500 ng DNA按上述相同的磷酸鈣沉淀法轉(zhuǎn)染新鮮制備的單層CEF。次日將培養(yǎng)液換成含10%胎牛血清的培養(yǎng)液，培養(yǎng)48～72 h后用胰酶將細(xì)胞消化成單個細(xì)胞，傳代到新鮮制備的CEF細(xì)胞平板板上，繼續(xù)培養(yǎng)48～72 h后，在波長為488 nm紫外光激發(fā)下觀察發(fā)出綠色熒光的病毒蝕斑。

gC恢復(fù)病毒的獲得：應(yīng)用HVT-B H1 F和HVT-B H2 R為引物，以HVT DNA為模板，PCR擴(kuò)增帶有上、下游同源臂和gC基因的DNA片段，取此DNA片段2～3 μg與約500 ng HVT BAC的DNA共轉(zhuǎn)染CEF，轉(zhuǎn)染后96 h取感染細(xì)胞接種到新鮮制備的單層 CEF上培養(yǎng)，24～48 h 后，用甲基纖維素培養(yǎng)基覆蓋，觀察在紫外光激發(fā)下不發(fā)出綠色熒光的病變蝕斑 (白斑)，挑取白斑接種到新的CEF，如此重復(fù)多個循環(huán)直至純化成功。提取純化病毒 DNA為模板，用一對引物HVT-gC F和HVT-gC R(表1)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，并對擴(kuò)增片段進(jìn)行序列測定，驗(yàn)證gC是否恢復(fù)成功。

1.2.6親本毒株、BAC拯救毒株和gC恢復(fù)毒株體外生長特性的測定與比較病毒體外生長特性參照文獻(xiàn)所述方法進(jìn)行[21，26]，將病毒按0.01 感染復(fù)數(shù)(multiplicity of infection，MOI)分別接種到生長24 h的單層原代CEF上培養(yǎng)。測定接種前和接種后6、12、24、36、48和72 h感染細(xì)胞經(jīng)胰酶消化成單個細(xì)胞的病毒滴度。收集病毒時，首先去除細(xì)胞上清液，經(jīng)PBS洗滌3次，用0.1%胰酶消化后再用2 mL DMEM 重懸細(xì)胞。對單個細(xì)胞的病毒滴度，取100 μL細(xì)胞懸液10倍倍比系列稀釋至10-7，接種到新鮮制備的單層CEF上，培養(yǎng)72 h后計(jì)數(shù)蝕斑形成單位(plaque forming unit，PFU)。對細(xì)胞結(jié)合性病毒的滴度，將重懸細(xì)胞離心后，傾去上清，將沉淀用SPGA再次重懸后，經(jīng)50 Hz 5 min超聲裂解后接種CEF測定滴度，試驗(yàn)共重復(fù)3次，根據(jù)PFU計(jì)數(shù)結(jié)果繪制病毒生長曲線。

1.2.7親本毒株、BAC拯救毒株和gC恢復(fù)毒株對MD保護(hù)性試驗(yàn)的比較將3種病毒分別以4 000 PFU接種1日齡SPF雛雞20只，于接種后21 d，與對照雞20只，腹腔注射馬立克病病毒京-1株強(qiáng)毒株(CVCC AV86)0.2 mL，觀察2個月，對病死雞和存活雞剖檢觀察病變，出現(xiàn)坐骨神經(jīng)、臂神經(jīng)叢等腫大，肝、腎、心、性腺、肺等臟器出現(xiàn)淋巴瘤的病理變化則判為馬立克病陽性，按文獻(xiàn)所述方法統(tǒng)計(jì)馬立克病發(fā)病比例[15，26]，比較3種病毒對MD的免疫保護(hù)效力。

2　結(jié)　果

2.1轉(zhuǎn)移載體pUC19(HVT)-H1-H2-miniF的構(gòu)建及其驗(yàn)證

通過特異性引物PCR擴(kuò)增獲得HVT FC126 gC上下同源臂并成功連接到pUC19載體質(zhì)粒上獲得pUC19(HVT)-H1-H2；然后將mini-F序列連接到pUC19(HVT)-H1-H2質(zhì)粒上獲得轉(zhuǎn)移載體pUC19(HVT)-H1-H2-mini-F(圖1A)。通過EcoR Ⅰ和ScaⅠ酶切驗(yàn)證符合理論預(yù)測結(jié)果(圖1B)。

A.轉(zhuǎn)移載體質(zhì)粒pUC19(HVT)-H1-H2-miniF(13 940 bp)結(jié)構(gòu)；B.轉(zhuǎn)移載體質(zhì)粒pUC19-H1-H2-miniF酶切驗(yàn)證圖譜：其中泳道1為 限制性內(nèi)切酶ScaⅠ酶切結(jié)果，條帶大小分別為10 165、3 775 bp；泳道2為限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ酶切結(jié)果，條帶大小分別為7 507、5 095、1 338 bp；泳道3為未酶切的pUC19(HVT)-H1-H2-miniF質(zhì)粒DNA對照；M.15 000 bp DNA相對分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)A.Predicted map of transferring vector pUC19(HVT)-H1-H2-miniF(13 940 bp)；B.Gel map of pUC19(HVT)-H1-H2-miniF with restriction digestion：Lane 1 show fragments of 10 165 bp and 3 775 bp after digestion with ScaⅠ；Lane 2 show fragments of 7 507 bp，5 095 bp and 1 338 bp after digestion with EcoRⅠ；Lane 3 show the DNA of pUC19(HVT)-H1-H2-miniF without digestion；M.15 000 bp DNA marker圖1　轉(zhuǎn)移載體質(zhì)粒pUC19(HVT)-H1-H2-miniF的構(gòu)建與鑒定Fig.1　Construction and identification of transferring vector pUC19-H1-H2-miniF

2.2Mini-F重組HVT的獲得與純化

轉(zhuǎn)移載體pUC19(HVT)-H1-H2-miniF和HVT病毒DNA共轉(zhuǎn)染原代CEF后72 h盲傳一代后再培養(yǎng)72 h后在紫外光激發(fā)下觀察到發(fā)出綠色熒光的蝕斑(圖2)，連續(xù)2次挑取綠斑接種于6孔板CEF擴(kuò)繁后，收集6孔板內(nèi)的細(xì)胞毒采取超聲波裂解進(jìn)行細(xì)胞破碎，破碎細(xì)胞病毒液倍比稀釋接種96孔新鮮制備的CEF平板上，篩選5個單孔出現(xiàn)單個綠斑的重組毒株，消化傳代接入CEF擴(kuò)繁，經(jīng)過3輪GPT加壓篩選后可見所有蝕斑在熒光顯微鏡下都發(fā)綠光，成功獲得了含mini-F 的HVT重組病毒。

A.波長為488 nm紫外光下觀察到的發(fā)出綠色熒光的病毒蝕斑；B.在白光下觀察到的蝕斑A.Green plaques observed under UV excitation of 488 nm wavelength；B.Plaques of phase control圖2　Mini-F重組HVT病毒蝕斑Fig.2　Plaque formation by mini-F recombinant HVT

2.3HVT BAC陽性克隆的獲得與驗(yàn)證

取提純的 mini-F重組HVT的DNA電轉(zhuǎn)化到E.coilDH10B 感受態(tài)細(xì)胞中，獲得10個克隆(C1～C10)，取其中一個克隆(BACHVT-C1)，用堿裂解法提取BACHVT-C1質(zhì)粒DNA后用限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ和BamHⅠ酶切，進(jìn)行RFLP分析，結(jié)果表明，酶切圖譜是典型的BAC譜型，條帶分布與軟件分析結(jié)果基本吻合，但并不完全一致，這可能是由于本研究中所用HVT FC126株與參考序列毒株的來源不同，其基因組序列不完全相同所致(圖3)。然后，再提取BACHVT-C1的DNA電轉(zhuǎn)化自制的E.coliGS1783感受態(tài)細(xì)胞，獲得了15個陽性克隆，取其中一個命名為BACHVT-G，經(jīng)RFLP驗(yàn)證與BACHVT-C1完全一致，表明成功獲得了HVT FC126株的細(xì)菌人工染色體。

圖3　BACHVT-C1 DNA RFLP圖譜Fig.3　RFLP map of BACHVT-C1

2.4HVT BAC的病毒拯救及gC恢復(fù)毒株的獲得

將BACHVT-G的DNA轉(zhuǎn)染CEF后，72 h傳代一次，再培養(yǎng)48 h后，在波長為488 nm紫外光激發(fā)下觀察到發(fā)出綠色熒光的病毒蝕斑，挑取其中一個蝕斑，進(jìn)行純化，獲得了HVT BAC拯救的重組毒株，命名為HVTBAC-ΔgC。

以HVT DNA為模板，用引物HVT-B H1 F和HVT-B H2 R 進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得含有兩側(cè)同源臂和gC基因的片段，將此片段DNA與BACHVT-G的 DNA共轉(zhuǎn)染到CEF，轉(zhuǎn)染96 h后盲傳1代，繼續(xù)培養(yǎng)48 h后，在波長為488 nm紫外光激發(fā)下觀察到不發(fā)出綠色熒光的病毒蝕斑，經(jīng)數(shù)輪挑斑純化獲得一株純化病毒，命名為HVTBAC-gC-R，分別以HVTBAC-ΔgC、HVTBAC-gC-R和HVT FC126株的DNA為模板，用一對引物(HVT-gC F和HVT-gC R)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，其中HVTBAC-gC-R和HVT FC126株均擴(kuò)增出1 600～1 700 bp大小的片段，而HVTBAC-gC-R未擴(kuò)增出條帶 (圖4)，所擴(kuò)增出的片段經(jīng)序列測定證明與HVT FC-126株gC基因序列完全一致，表明gC基因成功恢復(fù)。

圖4　HVT gC片段的PCR條帶Fig.4　PCR fragments of HVT gC sequences

2.5HVT FC126、HVTBAC-ΔgC和HVTBAC-gC-R生長特性的比較

測定和比較了HVT FC126、HVTBAC-ΔgC、HVTBAC-gC-R感染 CEF的多步生長動力學(xué)，結(jié)果顯示HVT和HVT BACΔgCR接種 CEF后，無論是經(jīng)胰酶消化成單個細(xì)胞的病毒滴度(圖5A)，還是經(jīng)裂解的細(xì)胞結(jié)合性病毒的滴度(圖5B),兩株病毒的滴度都無顯著差異。而gC缺失株HVTBAC-ΔgC病毒滴度明顯下降，其經(jīng)胰酶消化成單個細(xì)胞的病毒滴度了下降了約3倍，而經(jīng)裂解的細(xì)胞結(jié)合性病毒的滴度則下降了約100倍。表明HVT的gC基因雖然不是一個必需基因，但對病毒的增殖有重要作用。

2.6HVT FC126、HVTBAC-ΔgC和HVTBAC-gC-R對MD保護(hù)效力的比較

空白對照組雞均健康，無馬立克病病變。3種HVT病毒接種1日齡雛雞后未出現(xiàn)任何不良反應(yīng)。攻毒后剖檢病死雞和存活雞觀察馬立克病的典型病變，結(jié)果表明，攻毒對照組85%(17/20)MD陽性，HVT和HVTBAC-gC-R免疫組的MD陽性率分別為15%(3/20)和10%(2/20)，MD的陽性率分別減少了70%和75%，達(dá)到了免疫保護(hù)合格的標(biāo)準(zhǔn)，表明作者所構(gòu)建的HVT BAC是HVT全基因組克隆，可以應(yīng)用于重組載體活疫苗的構(gòu)建。而HVTBACΔgC免疫組的MD陽性率為35%(7/20)，較攻毒對照組僅減少了50%(表2)，不能達(dá)到合格的標(biāo)準(zhǔn)，表明gC基因缺失后對HVT的免疫原性產(chǎn)生較大影響。

A.經(jīng)胰酶消化成單個細(xì)胞的病毒滴度；B.經(jīng)裂解的細(xì)胞結(jié)合性病毒的滴度A.Titers of trypsinized single cells after infection；B.Titer of cell-associated viruses released from infection cells圖5　HVT FC126、HVTBAC-ΔgC和HVTBAC-gC-R在CEF上的生長動力學(xué)曲線Fig.5　Growth kinetics of HVT FC126,HVTBAC-ΔgC and HVTBAC-gC-R on CEF

表2MDV強(qiáng)毒株攻擊保護(hù)率

Table 2Protection against virulent MDV challenge

組別Groups攻毒數(shù)/只Numberofchallenge發(fā)病數(shù)/只NumbershowedclinicalsignsMD陽性率/%PositiverateofMDMD保護(hù)率/%ProtectionrateagainstMDHVT2031585HVTBACΔgC2073565HVTBAC-gC-R2021090攻毒對照Challengecontrol201785/空白對照Negativecontrol2000/

3　討　論

火雞皰疹病毒被廣泛用于雞馬立克病的預(yù)防，HVT的基因組較大，有多個非必需基因和非編碼區(qū)序列，能夠容納大片段外源基因的插入[27]，因此，被成功用作禽類疫病重組病毒活載體疫苗的載體。早在20世紀(jì)90年代以來，國外研究者就已經(jīng)開始用HVT為載體表達(dá)NDV的 F蛋白、IBDV的 VP2蛋白和禽流感病毒(avian influenza virus，AIV)的HA和NA蛋白等外源抗原，顯示了優(yōu)良的保護(hù)效果[12，28-30]。國內(nèi)不少研究者也開展了HVT活載體相關(guān)方面的研究，通常采用傳統(tǒng)的同源重組方法插入外源基因，然后選用LacZ或GFP作為遺傳標(biāo)記基因，采用有限稀釋法和蝕斑挑斑以純化重組毒株，結(jié)果表明采用這種傳統(tǒng)的方法，難于獲得真正純化的HVT重組病毒，這可能與HVT有較強(qiáng)的細(xì)胞結(jié)合性有關(guān)。自M.Messerle等報道成功構(gòu)建首個鼠巨細(xì)胞病毒(mouse cytomegalovirus，MCMV)全基因組的細(xì)菌人工染色體以來[19]，越來越多的皰疹病毒相繼構(gòu)建成功細(xì)菌人工染色體(BAC)感染性克隆，BAC技術(shù)實(shí)現(xiàn)了在大腸桿菌內(nèi)進(jìn)行皰疹病毒基因組的修飾，尤其是Red/ET克隆修飾系統(tǒng)和Cre/loxP 克隆修飾系統(tǒng)在BAC 遺傳修飾上的廣泛應(yīng)用，使得對BAC 分子克隆化病毒基因組上任何位點(diǎn)的插入、缺失、替換和點(diǎn)突變等遺傳修飾變得非常簡便、快速和準(zhǔn)確，大大提高了相關(guān)病毒致病機(jī)制和病毒活載體研究的進(jìn)展[16]。

構(gòu)建HVT全基因組感染性細(xì)菌人工染色體成功的關(guān)鍵有以下幾個方面：第一，篩選標(biāo)記基因的選擇。本課題組在篩選標(biāo)記上曾使用過EGFP作為標(biāo)記基因，但在重組病毒的純化上遇到了很大的困難，因?yàn)镠VT具有一定的細(xì)胞結(jié)合特性，因而在重組病毒挑斑純化過程中，完全去除野毒株非常困難。本研究中最終使用了mini-F載體中的Eco-gpt作為HVT重組病毒的篩選基因，在鳥嘌呤從頭合成途徑中，催化IMP到XMP反應(yīng)的是IMP脫氫酶，而MPA是該酶的不可逆阻斷劑，在恰當(dāng)濃度的MPA存在下，鳥嘌呤只能通過替代途徑，在補(bǔ)充適當(dāng)濃度的黃嘌呤和GPT的參與下合成，動物細(xì)胞本身不能合成GPT，但重組的病毒可以提供GPT從而使病毒完成核酸代謝，而野毒株感染細(xì)胞則不能進(jìn)行核酸代謝，經(jīng)過幾輪加壓篩選后，在顯微鏡下已觀察不到野毒株感染細(xì)胞，大大提高了重組病毒的純化程度。第二，mini-F載體的插入位點(diǎn)也是構(gòu)建穩(wěn)定的HVT BAC的關(guān)鍵之一，本研究也曾在US2位點(diǎn)插入mini-F 載體序列，但獲得的重組病毒很不穩(wěn)定，隨著純化過程中傳代次數(shù)的增加，重組病毒的復(fù)制能力明顯變?nèi)?未報道)。而在將mini-F載體插入gC等位位點(diǎn)后獲得的重組病毒則很穩(wěn)定，才能保證傳代純化的正常進(jìn)行。第三，在mini-F重組HVT純化的過程中，除挑斑純化之外，還將擴(kuò)繁的含重組病毒和親本病毒的混合樣品經(jīng)超聲波裂解釋放出游離狀態(tài)的病毒，再經(jīng)倍比稀釋后接種96孔新鮮制備的CEF，培養(yǎng)后選取僅出現(xiàn)單個綠斑的細(xì)胞孔中的培養(yǎng)物進(jìn)行擴(kuò)繁，此處理對重組病毒的純化也發(fā)揮了重要作用。

然而，雖然將mini-F重組HVT病毒從親本病毒中純化出來非常困難，但是在共轉(zhuǎn)染拯救gC恢復(fù)株病毒時，將gC恢復(fù)的病毒從mini-F重組病毒中純化則效率很高，僅經(jīng)過2～3輪的挑斑即獲得了純凈的恢復(fù)毒株。這可能是因?yàn)镠VT在插入外源基因后其細(xì)胞結(jié)合性增強(qiáng)，還可能是插入外源序列后影響了重組病毒的復(fù)制，使得重組毒株在與親本毒株在混合培養(yǎng)過程中處于明顯劣勢，難于將重組毒株分離純化，而gC恢復(fù)毒株則具有親本毒株的優(yōu)勢，易于純化。

截止目前，研究表明所有甲型皰疹病毒的gC都是非必需基因，但對病毒粒子侵入細(xì)胞，以及從細(xì)胞中釋出都有重要作用，而且gC能激發(fā)中和抗體，是皰疹病毒的重要抗原之一，gC基因缺失后對病毒的復(fù)制和免疫效力會產(chǎn)生重要影響[31-32]。本研究中g(shù)C缺失的HVT重組病毒雖然仍能有效地在細(xì)胞與細(xì)胞之間傳播，但對病毒侵入細(xì)胞的能力損傷嚴(yán)重，且導(dǎo)致了病毒的免疫效力大大降低，與其他甲型皰疹病毒gC的功能相似。

4　結(jié)　論

作者首次將mini-F序列插入HVT基因組的gC基因等位位點(diǎn)成功構(gòu)建了HVT全基因組的細(xì)菌人工染色體，并證明該細(xì)菌人工染色體是一個穩(wěn)定的感染性克隆，可以用于重組HVT活載體疫苗的研制；HVT的gC基因是一個非必需基因，但對病毒的增殖能力和免疫效力有重要影響。

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(編輯白永平)

Construction and Identification of a Novel Bacterial Artificial Chromosome of Herpesvirus of Turkey

WANG Zhi-sheng1,3，LIU Fang1，2，XU Meng-wei1，2，QIAO Yong-feng1,3，HOU Ji-bo1,3，WANG Ji-chun1,3*

(1.NationalResearchCenterofEngineeringandTechnologyforVeterinaryBiologicals，JiangsuAcademyofAgriculturalSciences，Nanjing210014，China；2.CollegeofVeterinaryMedicine，NanjingAgriculturalUniversity，Nanjing210095，China；3.JiangsuCo-innovationCenterforPreventionandControlofImportantAnimalInfectiousDiseasesandZoonoses，Yangzhou225009，China)

This study was conducted to construct a novel bacterial artificial chromosome (BAC) of herpevirus of turkey (HVT) as a technical platform for generation of recombinant HVT live vectored vaccine.The mini-F sequences were inserted into the genome of HVT in lieu of glycoprotein C (gC) gene through homologous recombination.The mini-F recombinant HVT were selected by GFP and gpt labeling.Then the DNA of mini-F recombinant HVT was transferred intoE.coliDH10B cells to construct the HVT BAC.Following identification of correct construction of HVT whole genome BAC through RFLP method，HVT BAC DNA was transferred intoE.coliGS1783 cells for further study after checking again.Then the HVT BAC was transfected into chicken embryo fibroblasts (CEF) for rescuing of virus.And also thegCrecovered virus was generated by replacement of mini-F sequences withgCgene through homologous recombination again.Finally，the growth characteristics and protective efficacy against Marek’s disease of the gC recovered HVT，mini-F recombinant HVT and the parental virus (HVT FC126) were investigated.Five strains of mini-F recombinant HVT was obtained.One of the five recombinants (HVTmini-F/ΔgC) was selected for isolation of DNA to transfer intoE.coliDH10B cells to construct HVT BAC which was identified successfully through RFLP.Following up，DNA of HVT BAC was transferred intoE.coliGS1783 cells successfully to obtain several positive clones and one of these clones was selected and named BACHVT-G.The recombinant HVT was rescued successfully from BACHVT-G，named HVTBAC-ΔgC.And thegCrecovered virus(HVTBAC-gC-R) was successfully obtained through homologous recombination.The HVTBAC-gC-Rand HVT FC126 showed no significant difference for growth kinetics or immunity.However，the propagation ability of HVTBAC-ΔgCwas significantly decreased compared to HVT and the immunity against MD of HVTBAC-ΔgCwas also decreased.This study successfully constructed a novel HVT bacterial artificial chromosome，which was an infectious clone of the whole genome of HVT.ThegCgene of HVT is a non-essential gene，but plays an important role for propagation of virus.The deletion ofgCgene will reduce the immunity of HVT against Marek’s disease.

herpesvirus of turkey；bacterial artificial chromosome；glycoprotein C；growth kinetics；immune efficiency

10.11843/j.issn.0366-6964.2016.10.016

2016-04-11

公益性行業(yè)(農(nóng)業(yè))科研專項(xiàng)(201303046)；江蘇省農(nóng)業(yè)科技自主創(chuàng)新基金項(xiàng)目[CX(12)3061]；江蘇省自然科學(xué)基金項(xiàng)目(BK20131334)

王志勝(1982-)，男，山東濟(jì)南人，助理研究員，博士，主要從事畜禽病毒活載體疫苗的研究，E-mail：zhisheng.wang@163.com

王繼春，研究員，E-mail：jcwang@263.net，Tel：025-84392068

S852.659.1

A

0366-6964(2016)10-2071-10