日糧營養(yǎng)水平對150～180日齡灘羊瘤胃相關微生物菌群數(shù)量、pH和VFA含量的影響

王堯悅，趙釗艷，王興濤，陳玉林，楊雨鑫

(西北農(nóng)林科技大學動物科技學院，楊凌 712100)

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日糧營養(yǎng)水平對150～180日齡灘羊瘤胃相關微生物菌群數(shù)量、pH和VFA含量的影響

王堯悅，趙釗艷，王興濤，陳玉林*，楊雨鑫*

(西北農(nóng)林科技大學動物科技學院，楊凌 712100)

本試驗旨在研究不同營養(yǎng)水平日糧對150～180日齡期間寧夏灘羊瘤胃相關微生物菌群(溶糊精琥珀酸弧菌、棲瘤胃普雷沃氏菌、反芻獸月形單胞菌、溶纖維丁酸弧菌、黃色瘤胃球菌、小韋榮球菌和產(chǎn)甲烷菌)數(shù)量、pH和VFA含量的影響。選取112只(公母各半)、體重接近(29±1.25)kg、體況良好的105日齡寧夏灘羊，采用完全隨機分組試驗設計分為4個處理組(組Ⅰ，Ⅱ，Ⅲ和Ⅳ)，每個處理組4個重復，每個重復7只羊。從處理組Ⅰ到Ⅳ，日糧能量分別為7.08、 8.09、9.10和10.11 MJ· kg-1；蛋白質(zhì)水平分別為8.04%、9.19%、10.34%和11.49%。能量與蛋白質(zhì)比值不變(約為0.88)。試驗期共75 d，其中預試期15 d。分別在150和180日齡時，每個重復隨機選取1只羊屠宰采集瘤胃內(nèi)容物，測定其pH，并利用氣相色譜法測定待測瘤胃內(nèi)容物的VFA含量；提取瘤胃內(nèi)容物基因組DNA，通過構建標準質(zhì)粒對這些相關微生物進行絕對實時熒光定量-PCR分析。結果表明，不同日齡僅對反芻獸月形單胞菌的數(shù)量有顯著影響(P<0.05)；但隨著日糧營養(yǎng)水平的提高，棲瘤胃普雷沃氏菌、黃色瘤胃球菌、溶糊精琥珀酸弧菌、溶纖維丁酸弧菌和產(chǎn)甲烷菌的數(shù)量均呈顯著上升趨勢(P<0.05)；不同日齡和不同營養(yǎng)水平日糧對瘤胃液pH均無顯著影響(P>0.05)；瘤胃液中乙酸含量隨日糧營養(yǎng)水平的提高呈顯著下降趨勢(P<0.05)，丁酸、異丁酸、戊酸和異戊酸占總揮發(fā)性脂肪酸的比例隨著日糧營養(yǎng)水平的提高呈顯著上升趨勢(P<0.05)。不同瘤胃微生物之間存在相互促進作用；丙酸含量與小韋榮球菌的數(shù)量呈顯著正相關(r=0.42，P<0.05)，而戊酸與小韋榮球菌的數(shù)量呈極顯著負相關(r=-0.53，P<0.01)。與日齡相比，不同營養(yǎng)水平的日糧相關瘤胃微生物數(shù)量以及VFA的含量影響更大；瘤胃VFA、pH與相關瘤胃微生物之間存在相關關系。

灘羊；瘤胃微生物；qRT-PCR；pH；VFA

瘤胃是一個復雜的微生物生態(tài)系統(tǒng)，在反芻動物飼料消化以及維持反芻動物健康方面起著至關重要的作用[1]。瘤胃微生物通過厭氧發(fā)酵產(chǎn)生的揮發(fā)性脂肪酸(VFA，包括乙酸、丙酸、丁酸、戊酸等)和菌體蛋白，為反芻動物供應能量和蛋白質(zhì)[2-4]，影響反芻動物的生產(chǎn)性能。日糧營養(yǎng)水平是影響瘤胃微生物發(fā)酵的重要因素[5]。

VFA是反芻動物攝入碳水化合物后，經(jīng)瘤胃厭氧發(fā)酵產(chǎn)生的，可為反芻動物提供65%～75%的能量需要[6]。瘤胃中產(chǎn)甲烷菌能夠發(fā)酵碳水化合物，生成的甲烷通過噯氣形式排出體外，造成飼料能量浪費及大氣污染。甲烷的產(chǎn)生量與VFA的生成量密切相關[7]。另外，瘤胃微生物在降解日糧蛋白質(zhì)的過程中，會產(chǎn)生過多的氨氣，造成飼料蛋白質(zhì)的浪費并引起環(huán)境污染。

灘羊主要分布于寧夏回族自治區(qū)，其二毛裘皮被列為寧夏“五寶”之一；肉質(zhì)鮮嫩，膻味較小，口感好。飼養(yǎng)灘羊是當?shù)剞r(nóng)民的主要經(jīng)濟來源方式[8]。但隨著生態(tài)環(huán)境的壓力，灘羊飼養(yǎng)方式由放牧、半放牧轉(zhuǎn)變?yōu)樯犸曫B(yǎng)殖，隨之日糧的類型也在逐漸發(fā)生改變。因此，探究灘羊瘤胃微生物與寄主之間的關系對提高灘羊的飼料消化率，改善其生產(chǎn)性能具有重要的生產(chǎn)實際意義。但是目前，有關灘羊瘤胃微生物菌群數(shù)量的研究較少，特別是日糧營養(yǎng)水平對灘羊瘤胃微生物菌群影響的研究更少。

因此，本試驗應用實時熒光定量-PCR (qRT-PCR)分子技術探究了日糧營養(yǎng)水平對150～180日齡灘羊瘤胃微生物菌群數(shù)量的影響，并通過氣相色譜法檢測了瘤胃液VFA隨日糧營養(yǎng)水平的變化趨勢，為進一步了解灘羊瘤胃發(fā)酵機理以及瘤胃微生物與灘羊機體健康之間的關系奠定了理論基礎。

1　材料與方法

1.1試驗設計及試驗動物

在寧夏紅寺堡天源良種羊繁育養(yǎng)殖有限公司選取112只(公母各半)體況良好、105日齡、平均體重為(29±1.25)kg的寧夏灘羊，完全隨機分為4個處理組(組Ⅰ，Ⅱ，Ⅲ和Ⅳ)，每個處理組4個重復，每個重復7只羊。預飼15 d后正式開始試驗。共分2個飼喂時期，每期30 d。預飼15 d，即到120日齡時正式開始試驗。每天08：00和17：00等量飼喂2次，自由飲水。在試驗羊150和180日齡時，每個處理組的每個重復中隨機選取1只羊，共選取16只羊進行屠宰。收集并過濾瘤胃內(nèi)容物，利用便攜式pH計(testo-206-pH2)測定上清液pH后-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2試驗動物日糧及飼養(yǎng)管理

日糧參照肉羊飼養(yǎng)標準(NY/T 816-2004)配制，從處理組Ⅰ到Ⅳ飼喂的日糧能量分別為7.08、 8.09、9.10和10.11 MJ· kg-1；蛋白質(zhì)水平分別為8.04%、9.19%、10.34%和11.49%。能量與蛋白質(zhì)水平比值不變(約為0.88)。其他營養(yǎng)水平保持一致。從處理組Ⅰ到Ⅳ，粗纖維的含量分別為17.05%、20.98%、21.97%和23.96%，日糧精粗比保持不變。日糧混合后制作成顆粒飼料，每天定時等量飼喂，自由飲水，其他飼養(yǎng)管理按羊場正常程序進行。日糧組成及營養(yǎng)水平詳見表1。

表1日糧的組成及營養(yǎng)水平

Table 1Dietary composition and nutrient levels

%

1).每千克預混料含有：VA 7 500 IU，VD31 050 IU，VE 10 IU，F(xiàn)e 5 500 mg，Cu 500 mg，Mn 5 000 mg，Zn 4 000 mg，Se 32.5 mg，I 100 mg，Co 32.5 mg。2).DM和CP含量為實測值，DE和CF含量為計算值

1).Premix contained the following per kg of premix：VA 7 500 IU，VD31 050 IU，VE 10 IU，F(xiàn)e 5 500 mg，Cu 500 mg，Mn 5 000 mg，Zn 4 000 mg，Se 32.5 mg，I 100 mg，Co 32.5 mg.2).The contents of DM and CP were measured values，the contents of DE and CF were calculated values

1.3細菌基因組DNA 的提取和PCR擴增

將瘤胃上清液于冰上解凍，并用渦旋混勻器HYQ-3111進行混勻。用stool DNA kit (OMEGA，USA) 試劑盒提取細菌基因組DNA，用超微量核酸蛋白測定儀(Thermo Fisher，上海)測定其濃度，并利用1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測所提取的細菌基因組DNA的質(zhì)量。

利用16S rDNA通用引物V338F：5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3′，和 V806R：5′-GGA-CTACHVGGGTWTCTAAT-3′擴增不同樣品的基因組DNA。擴增條件：95 ℃ 3 min；95 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 45 s，27個循環(huán)；72 ℃ 10 min。總體系20 μL，每個體系中每個引物為0.8 μL，模板DNA 10 ng，5×FastPfu 反應緩沖液 4 μL，2.5 mmol·L-1寡核苷酸底物(dNTPs 混合液)2 μL，F(xiàn)astPfu聚合酶0.4 μL。

1.4qRT-PCR分析

1.4.1選取的微生物以及引物設計本試驗由處理組Ⅰ到Ⅳ的日糧蛋白質(zhì)水平是逐漸增加的(能量與蛋白質(zhì)比值保持不變，約為0.88)，且反芻動物對飼料粗纖維降解效果的研究也是近年研究的熱點課題。因此，本研究選取了有關蛋白質(zhì)降解菌和纖維素降解菌進行探究，其中包括：①棲瘤胃普雷沃氏菌(Prevotellaruminicola，即P.ruminicola)：一種典型的蛋白質(zhì)降解菌，能夠選擇性利用日糧中的蛋白質(zhì)；②黃色瘤胃球菌(Ruminococcusflavefaciens，即R.flavefaciens)、溶纖維丁酸弧菌(Butyrivibriofibrisolvens，即B.fibrisolvens)及溶糊精琥珀酸弧菌(Succinivibriodextrinisolvens，即S.dextrinisolvens)均為纖維素降解菌，且溶纖維丁酸弧菌也是一種蛋白質(zhì)降解菌。③反芻獸月形單胞菌(Selenomonasruminantium，即S.ruminantium)與小韋榮球菌(Veillonellaparvula，即V.parvula)：均為丙酸生成菌，能維持瘤胃內(nèi)環(huán)境酸堿度穩(wěn)態(tài)且能為反芻動物提供能量。④產(chǎn)甲烷菌(Methanogens)：一種甲烷生成菌，能夠利用纖維降解過程中釋放的氫和CO2。

參考已發(fā)表的文獻，查找出7類菌種的特異性引物序列，同時使用NCBI BLAST(www.ncbi.nih.gov/BLAST)比對引物特異性(表2)。

表2qRT-PCR 試驗所用引物

Table 2qRT-PCR primers used in this study

菌種Targetbacterium引物序列(5'-3')Primersequence擴增片段/bpProductsize退火溫度/℃Annealingtemperature棲瘤胃普雷沃氏菌P.ruminicolaF:GAAAGTCGGATTAATGCTCTATGTTGR:CATCCTATAGCGGTAAACCTTTGG7459[9]黃色瘤胃球菌R.flavefaciensF:CGAACGGAGATAATTTGAGTTTACTTAGGR:CGGTCTCTGTATGTTATGAGGTATTACC13260[10]溶纖維丁酸弧菌B.fibrisolvensF:ACACACCGCCCGTCACAR:TCCTTACGGTTGGGTCACAGA6460[11]反芻獸月形單胞菌S.ruminantiumF:CAATAAGCATTCCGCCTGGGR:TTCACTCAATGTCAAGCCCTGG13861[9]溶糊精琥珀酸弧菌S.dextrinisolvensF:TAGGAGCTTGTGCGATAGTATGGR:CTCACTATGTCAAGGTCAGGTAAGG17459[12]小韋榮球菌V.parvulaF:TCCTCTTCTTCGGAAGCCAGAR:AGAGAGTGTTTCTCGGGTTTGC27860[13]產(chǎn)甲烷菌MethanogensF:GGTGGTGTMGGATTCACACARTAYGCWACAGCR:TTCATTGCRTAGTTWGGRTAGTT49155[14]

F和R分別代表上、下游引物

F and R indicates forward and reverse primers，respectively

1.4.2標準質(zhì)粒的制備分別采用這7類菌種的特異性引物，同時以瘤胃內(nèi)容物基因組DNA為模板，PCR擴增其特異性片段，利用膠回收試劑盒(AXYGEN，USA)回收產(chǎn)物并連接pGEM-T easy載體(Promega，USA)，轉(zhuǎn)化入感受態(tài)細胞。菌落PCR鑒定擴增的特異性片段正確后，挑選陽性克隆子測序鑒定，并在BLAST基因庫進行在線比對。根據(jù)測序結果，利用質(zhì)粒提取試劑盒(OMEGA，USA)提取含有目的片段的標準質(zhì)粒，并準確測定質(zhì)粒DNA溶液濃度。1.4.3標準曲線的制備將上述制備好的標準質(zhì)粒分別進行10倍濃度梯度稀釋(103～109)，以其為DNA模板，利用對應的特異性引物，在iCycle iQ5 thermo cycler (Bio-Rad，USA)上進行qRT-PCR反應，反應結束后，以質(zhì)?？截悢?shù)的對數(shù)為橫坐標，以Ct值為縱坐標繪制標準曲線。質(zhì)?？截悢?shù)的計算公式：Copies·μL-1=[ 6.02×1023(copy·mol-1)×(DNA amour (ng·μL-1)]/[DNA length (bp) ×660(μg·mol-1·bp-1)]。

1.4.4qRT-PCR反應分別采用這7類菌種的特異性引物，同時以瘤胃內(nèi)容物基因組DNA為模板進行qRT-PCR反應。每個樣品做4個重復。將Ct值帶入相應的標準曲線，計算拷貝數(shù)。用Premix Ex Taq II (Tli RNaseH Plus) 試劑盒(TaKaRa，Japan)配制25 μL 的總反應體系，其中12.5 μL 2× SYBR Premix Ex Taq II (Tli RNaseH Plus)，2.0 mmol·L-1正、反向引物，150.0 ng細菌基因組DNA。擴增反應條件：95 ℃預變性10 min；95 ℃ 變性15 s，退火溫度(表2)退火30 s，72 ℃ 延伸45 s，40個循環(huán)；72 ℃ 10 min。

1.5瘤胃液VFA的測定

利用氣相色譜法[15]采用Agilent 7820A氣相色譜儀(安捷倫科技有限公司，USA)測定VFA含量。

1.6統(tǒng)計學分析

試驗數(shù)據(jù)應用統(tǒng)計軟件SPSS 20.0進行分析。其中，分析不同營養(yǎng)水平日糧對150～180日齡灘羊瘤胃微生物數(shù)量、瘤胃VFA和pH的影響時，采用GLM進行雙因素方差分析。采用Duncan氏法進行多重比較，P<0.05表示差異顯著。對灘羊瘤胃液pH、VFA和瘤胃微生物以及不同瘤胃微生物相互之間進行Pearson相關性分析，P<0.05為差異顯著，P<0.01為差異極顯著。

2　結　果

2.1qRT-PCR標準曲線的建立

由iCycle iQ5 thermo cycler (Bio-Rad，USA)生成質(zhì)粒標準品的擴增曲線。質(zhì)?？截悢?shù)的對數(shù)與Ct值呈線性關系，各菌種的標準曲線方程見表3，標準曲線的決定系數(shù)均達到0.995以上，PCR擴增效率為96.5%～120%，符合qRT-PCR試驗要求。

表3實時熒光定量PCR標準曲線及其擴增效率與決定系數(shù)

Table 3The standard curve，PCR efficiency and linear correlation coefficient (R2)

項目Item標準曲線Standardcurve決定系數(shù)(R2)Linearcorrelationcoefficient擴增效率(E%)Amplificationefficiency棲瘤胃普雷沃氏菌P.ruminicolaY=-2.920X+31.9820.998120.0黃色瘤胃球菌R.flavefaciensY=-3.408X+34.4650.99996.5反芻獸月形單胞菌S.ruminantiumY=-3.156X+34.5700.996107.5小韋榮球菌V.parvulaY=-3.069X+37.0950.998111.8溶糊精琥珀酸弧菌S.dextrinisolvensY=-3.009X+38.4500.995114.9溶纖維丁酸弧菌B.fibrisolvensY=-2.968X+32.3250.999117.2產(chǎn)甲烷菌MethanogensY=-3.229X+37.3330.997104.0

2.2日齡和日糧營養(yǎng)水平對瘤胃微生物數(shù)量的影響

由表4可知，反芻獸月形單胞菌在150和180日齡時，數(shù)量有顯著差異(P<0.05)；其他菌株在不同日齡，數(shù)量差異均不顯著(P>0.05)；當日糧營養(yǎng)水平不同時，瘤胃中棲瘤胃普雷沃氏菌、黃色瘤胃球菌、溶糊精琥珀酸弧菌、溶纖維丁酸弧菌、產(chǎn)甲烷菌的數(shù)量差異顯著(P<0.05)，反芻獸月形單胞菌和小韋榮球菌的數(shù)量差異不顯著；日齡與日糧營養(yǎng)水平的相互作用顯著影響棲瘤胃普雷沃氏菌在瘤胃中的數(shù)量(P<0.05)，而對其他6種菌株數(shù)量的影響不顯著(P>0.05)。隨著日糧營養(yǎng)水平的提高，瘤胃中棲瘤胃普雷沃氏菌、黃色瘤胃球菌、溶糊精琥珀酸弧菌、溶纖維丁酸弧菌、產(chǎn)甲烷菌的數(shù)量呈上升趨勢，而反芻獸月形單胞菌、小韋榮球菌的數(shù)量變化趨勢不明顯。

2.3日齡和日糧營養(yǎng)水平對瘤胃液pH和VFA的影響

由表5可知，試驗測定的瘤胃液pH均為6.56～7.12，且乙酸、丙酸、丁酸含量占總揮發(fā)性脂肪酸(TVFA)的比例較高。不同日齡變化對瘤胃液pH和VFA的影響均不顯著(P>0.05)。不同營養(yǎng)水平日糧對瘤胃液pH無顯著影響(P>0.05)；而隨著日糧營養(yǎng)水平的提高，乙酸占TVFA的比例呈顯著下降趨勢(P<0.05)，丁酸、異丁酸、戊酸、異戊酸占TVFA的比例呈顯著上升趨勢(P<0.05)，丙酸和TVFA的含量變化不明顯(P>0.05)。日齡和日糧營養(yǎng)水平的相互作用顯著影響乙酸和異戊酸的含量(P<0.05)，而對丙酸、異丁酸等其他幾種VFA的含量無顯著影響(P>0.05)。

表 4不同日齡、不同營養(yǎng)水平對瘤胃微生物分布的影響

Table 4Effects of different days of age and nutrient levels on the distribution of rumen microbiome

菌種Species日齡/dDay營養(yǎng)水平NutrientlevelⅠⅡⅢⅣSEMP值PvalueDND×N棲瘤胃普雷沃氏菌P.ruminicola1501803.823.052.783.884.433.975.654.050.280.250.1130.0020.005黃色瘤胃球菌R.flavefaciens1501800.790.751.241.031.631.572.442.430.220.230.7620.0010.993反芻獸月形單胞菌S.ruminantium1501804.162.983.542.543.612.253.673.500.150.310.0140.4210.638小韋榮球菌V.parvula1501801.381.481.411.121.311.431.721.600.080.110.7290.2750.710溶糊精琥珀酸弧菌S.dextrinisolvens1501806.776.507.237.087.037.027.977.670.160.190.3910.0060.961溶纖維丁酸弧菌B.fibrisolvens1501801.781.912.042.252.682.792.982.840.140.120.4290.0030.654產(chǎn)甲烷菌Methanogens1501804.974.944.955.295.275.495.795.820.110.120.2540.0010.701

D.日齡；N.營養(yǎng)水平；D×N.日齡和營養(yǎng)水平的交互作用。微生物數(shù)量均用每10 ng基因拷貝數(shù)的對數(shù)值表示。下同

D. The effect of days of age；N. The effect of nutrient levels;D×N. Days of age × nutrient levels interactions.The number of microbes is showed by the logarithm of the values on gene copies per 10 ng.The same as below

表5不同日齡、不同營養(yǎng)水平日糧對灘羊瘤胃液pH和VFA的影響

Table 5Effects of different days of age and nutrient levels on pH and VFA in rumen of Tan sheep

發(fā)酵參數(shù)Fermentationparameter日齡/dDay營養(yǎng)水平NutrientlevelⅠⅡⅢⅣSEMP值PvalueDND×N乙酸/%Acetateacid15018067.3965.3264.5363.7661.4761.0556.4061.541.320.640.5130.0000.011丙酸/%Propionicacid15018016.9419.3819.2219.3519.7819.9219.7519.070.710.400.5650.5670.617異丁酸/%Isobutyric1501801.141.221.661.632.492.333.253.470.250.300.8950.0000.922丁酸/%Butyrate15018010.049.4511.0010.5011.7711.7015.6013.180.690.610.1560.0000.535異戊酸/%Isovaleric1501802.181.671.442.325.093.854.334.970.470.440.8410.0000.041戊酸/%Pentanoicacid1501800.860.790.760.891.441.151.481.490.110.100.4540.0000.274總揮發(fā)性脂肪酸/(mmol·L-1)TotalVFA15018070.6364.6861.1059.2358.5150.9237.6448.774.365.090.8660.0770.709pH1501806.716.706.566.616.967.007.127.080.070.070.1800.0700.805

2.4相關分析

2.4.1不同瘤胃微生物間的相關分析由表6可知，棲瘤胃普雷沃氏菌的數(shù)量與黃色瘤胃球菌、溶糊精琥珀酸弧菌的數(shù)量呈極顯著正相關(r=0.57，P<0.01；r=0.57，P<0.01)，與溶纖維丁酸弧菌的數(shù)量呈顯著正相關(r=0.44，P<0.05)；黃色瘤胃球菌與溶糊精琥珀酸弧菌的數(shù)量呈極顯著正相關(r=0.73，P<0.01)；產(chǎn)甲烷菌的數(shù)量與黃色瘤胃球菌、溶糊精琥珀酸弧菌及溶纖維丁酸弧菌的數(shù)量均呈極顯著正相關(r=0.65，P<0.01；r=0.46，P<0.01；r=0.46，P<0.01)。

表6不同瘤胃微生物間的關聯(lián)性分析

Table 6Correlation between different rumen microbes

項目ItemPrRuSeSuMeBuVePr1.000.57**0.260.57**0.39*0.44*0.24Ru1.000.310.73**0.65**0.44*0.40*Se1.000.44*0.040.170.31Su1.000.46**0.340.24Me1.000.46**0.17Bu1.000.19Ve1.00

Pr.棲瘤胃普雷沃氏菌；Ru.黃色瘤胃球菌；Se.反芻獸月形單胞菌；Ve.小韋榮球菌；Su.溶糊精琥珀酸弧菌；Bu.溶纖維丁酸弧菌；Me.產(chǎn)甲烷菌。*.顯著相關(P<0.05)；**.極顯著相關(P<0.01)。下表同

Pr.P.ruminicola；Ru.R.flavefaciens；Se.S.ruminantium；Ve.V.parvula；Su.S.dextrinisolvens；Bu.B.fibrisolvens；Me.Methanogens.*. Significant correlation (P<0.05)；**. Highly significant correlation (P<0.01).The same as below

2.4.2灘羊瘤胃液pH、VFA和瘤胃微生物之間的相關性分析由表7可知，灘羊瘤胃液的pH只與溶纖維丁酸弧菌的數(shù)量呈顯著正相關(r=0.45，P<0.05)。丙酸含量與小韋榮球菌的數(shù)量呈顯著正相關(r=0.42，P<0.05)；丁酸含量與小韋榮球菌的數(shù)量呈顯著負相關(r=-0.46，P<0.05)，戊酸含量與小韋榮球菌的數(shù)量呈極顯著負相關(r=-0.53，P<0.01)，與反芻獸月形單胞菌的數(shù)量呈顯著負相關(r=-0.41，P<0.05)。

表7灘羊瘤胃液pH、VFA和瘤胃微生物的相關分析

Table 7Correlation between pH，VFA and microbes in rumen of Tan sheep

項目ItemPrRuSeVeSuBuMe乙酸Acetateacid0.020.150.310.180.21-0.18-0.02丙酸Propionicacid0.25-0.05-0.040.42*-0.080.250.08異丁酸Isobutyric0.01-0.04-0.36-0.26-0.050.120.04丁酸Butyrate-0.18-0.36-0.34-0.46*-0.240.23-0.26異戊酸Isovaleric-0.14-0.19-0.31-0.32-0.110.05-0.05戊酸Pentanoicacid-0.18-0.27-0.41*-0.53**-0.200.170.05總揮發(fā)性脂肪酸TotalVFA-0.19-0.32-0.27-0.28-0.33-0.050.00pH0.150.19-0.29-0.05-0.050.45*0.05

3　討　論

3.1不同營養(yǎng)水平的日糧對150～180日齡灘羊瘤胃微生物數(shù)量的影響

瘤胃是反芻動物不可或缺且特有的器官。瘤胃微生物是瘤胃的重要組成部分，在維持反芻動物身體健康和提高反芻動物生產(chǎn)性能方面起著重要的作用[16]。由于傳統(tǒng)的微生物培養(yǎng)方法不能準確估計瘤胃微生物的種類和數(shù)量[17]，并且D.G.Welkie 等[18]研究發(fā)現(xiàn)瘤胃液相的微生物群落結構較固相微生物群落結構更加穩(wěn)定，因此，本試驗利用qRT-PCR技術研究了不同日齡及不同營養(yǎng)水平的日糧對灘羊瘤胃液相中有關微生物的影響。

關于不同飼料原料對瘤胃微生物影響的研究很多，但結果不盡一致。金迪[19]研究發(fā)現(xiàn)，保持日糧精粗比不變，不同粗飼料類型對瘤胃微生物的影響較顯著，不同蛋白質(zhì)來源的飼料對瘤胃微生物影響不顯著。薛豐[20]的試驗結果表明，不同粗飼料來源不能顯著影響微生物的數(shù)量。而王夢芝等[21]發(fā)現(xiàn)不同來源的蛋白質(zhì)飼料顯著影響瘤胃微生物發(fā)酵及其群體結構。這說明影響瘤胃微生物數(shù)量的因素可能不只是飼料原料組成成分，也可能與飼養(yǎng)管理、品種等因素有關。而本試驗是通過不同的飼料原料以保證所配制的日糧營養(yǎng)水平不斷提高，因此主要考慮不同營養(yǎng)水平日糧對瘤胃微生物的影響。

其次，缺乏完善的成本管控體系。在現(xiàn)代建筑施工企業(yè)中，成本管控是一個十分復雜的體系，想要實現(xiàn)成本管控目標，必須構建與之相適應的管控體系。尤其是在成本核算方面，必須構建完善的制度，保障各方面工作的有效落后。但結合實際情況來看，我國部分建筑施工企業(yè)的成本管控體制都不夠健全，以至于工作混亂、賬目模糊、時效性差、資金管理不到位等情況普遍存在[2]。與此同時，成本管控工作人員的積極性也嚴重不足，工作態(tài)度敷衍，對工作質(zhì)量造成了嚴重影響。總的來講，很多建筑施工企業(yè)的成本管控都已經(jīng)落后于時代。

本試驗結果發(fā)現(xiàn)，除反芻獸月形單胞菌外，150日齡的各菌種數(shù)量和180日齡的各菌種數(shù)量無顯著變化，且日齡和日糧營養(yǎng)水平的互作僅對棲瘤胃普雷沃氏菌的數(shù)量有影響。符運勤[22]研究指出，瘤胃微生物菌群數(shù)目會隨年齡的增加而變化，但到達4～6月齡時基本保持穩(wěn)定，從而形成一個穩(wěn)定的瘤胃微生物生態(tài)環(huán)境，這與本試驗結果一致。

瘤胃微生物的數(shù)量受到品種、地域、飼喂方式、日糧等諸多因素的影響[23]，但日糧是最重要的因素[24]，且日糧蛋白質(zhì)水平的影響大于能量水平[25]。在本試驗中，當日糧營養(yǎng)水平逐漸升高(即日糧能量水平和蛋白質(zhì)水平同步增加，但能蛋比保持不變)時，除反芻獸月形單胞菌、小韋榮球菌無顯著變化外，灘羊瘤胃中棲瘤胃普雷沃氏菌、黃色瘤胃球菌、溶糊精琥珀酸弧菌、溶纖維丁酸弧菌和產(chǎn)甲烷菌的數(shù)量均顯著增加。有報道表明，棲瘤胃普雷沃氏菌能選擇性利用日糧中的蛋白質(zhì)[9]，在本試驗中組Ⅳ日糧蛋白質(zhì)含量最高，因此棲瘤胃普雷沃氏菌數(shù)量最多。本試驗所選日糧的粗纖維含量從組Ⅰ到Ⅳ是逐漸升高的，有利于黃色瘤胃球菌、溶糊精琥珀酸弧菌[26]和溶纖維丁酸弧菌這類纖維分解菌的生長，有助于其將纖維素類物質(zhì)降解為VFA[27]。

3.2不同營養(yǎng)水平日糧對150～180日齡瘤胃液pH和VFA含量的影響

瘤胃液pH主要通過影響瘤胃微生物活性來反映瘤胃發(fā)酵狀況，當瘤胃pH在6.2～7.0范圍內(nèi)時，瘤胃內(nèi)微生物生態(tài)系統(tǒng)較為穩(wěn)定，能夠保證瘤胃的正常發(fā)酵[15，28]。在本試驗中，不同日齡和日糧水平對瘤胃液pH影響均不顯著，且pH一直保持在6.56～7.12之間。說明這兩個時期內(nèi)瘤胃內(nèi)環(huán)境較為穩(wěn)定，所測得的瘤胃微生物數(shù)量能夠較為真實的反映出瘤胃微生物區(qū)系和數(shù)量，但pH不受營養(yǎng)水平的影響，這與王雅倩等[29]的研究結果一致。

瘤胃中VFA是瘤胃微生物發(fā)酵的重要產(chǎn)物之一，能為灘羊活動提供能量。在本試驗中，不同日齡對瘤胃VFA影響不顯著，但其含量受不同營養(yǎng)水平日糧的顯著影響[30]。目前，關于不同日糧蛋白質(zhì)水平對瘤胃液VFA含量影響的研究較多，但研究結果不盡相同。研究發(fā)現(xiàn)，隨日糧蛋白質(zhì)水平的提高，瘤胃液NH3-N濃度和VFA含量呈二次曲線增加[31]。但王雅倩等[29]研究發(fā)現(xiàn)，隨日糧蛋白質(zhì)水平的提高，瘤胃液NH3-N濃度和VFA含量呈線性變化趨勢。目前，關于不同日糧能量水平對瘤胃液VFA含量的研究較少。崔祥等[25]研究發(fā)現(xiàn)，不同能量水平的日糧對瘤胃液中的乙酸、丙酸、異丁酸和戊酸的含量影響顯著，其中乙酸含量隨日糧能量水平的提高而減小，丙酸、戊酸含量隨日糧能量水平的提高而增加。本試驗中，隨著日糧能量和蛋白質(zhì)水平的同步提高，乙酸占TVFA的比例呈顯著下降趨勢，丁酸、異丁酸、戊酸、異戊酸占TVFA的比例顯著上升，而丙酸的變化不顯著，與前人研究結果基本一致[32]。楊宏波等[33]研究發(fā)現(xiàn)，溶纖維丁酸弧菌不僅能降解纖維素類物質(zhì)產(chǎn)生VFA，而且能將吸收的乙酸轉(zhuǎn)化成丁酸。在本試驗中，處理組Ⅳ的纖維素含量最高且溶纖維丁酸弧菌的數(shù)量最多，因此處理組Ⅳ中丁酸占TVFA的比例顯著高于其他3組，而乙酸的比例較低。結果表明，隨著日糧營養(yǎng)水平的提高，乙酸占TVFA的比例呈下降趨勢，丁酸、異丁酸、戊酸和異戊酸占TVFA的比例均呈上升趨勢。

3.3相關分析

3.3.2灘羊瘤胃液pH、VFA和瘤胃微生物之間的相關性分析在本試驗中，灘羊瘤胃液的pH與溶纖維丁酸弧菌的數(shù)量呈顯著正相關，這與張雙雙等[37]的研究結果一致。小韋榮球菌能夠發(fā)酵乳酸生成丙酸[38]，因此隨著該菌數(shù)量的增加，瘤胃中丙酸含量也會增加，這與本試驗結果一致。丁酸、戊酸與小韋榮球菌相互之間的影響機理還有待進一步研究。毛勝勇等[39]通過體外發(fā)酵試驗證明戊酸含量對反芻獸月形單胞菌數(shù)量無顯著影響，這與本研究結果不一致，這可能與體外發(fā)酵模擬的瘤胃內(nèi)環(huán)境與瘤胃內(nèi)環(huán)境本身不完全相同有關。因此，瘤胃液pH和VFA含量與瘤胃微生物數(shù)量之間存在相關關系。

4　結　論

4.1不同營養(yǎng)水平的日糧對150～180日齡瘤胃微生物數(shù)量的影響

隨著日糧營養(yǎng)水平的提高，棲瘤胃普雷沃氏菌、黃色瘤胃球菌、溶糊精琥珀酸弧菌、溶纖維丁酸弧菌、產(chǎn)甲烷菌的數(shù)量均顯著增加，而日齡對這幾株菌的影響不顯著。

4.2不同營養(yǎng)水平的日糧對150～180日齡瘤胃液pH、VFA含量的影響

不同日齡和不同日糧營養(yǎng)水平對灘羊瘤胃液pH無顯著影響。但隨著日糧營養(yǎng)水平的提高，瘤胃液乙酸占TVFA的比例呈顯著下降趨勢，丁酸、異丁酸、戊酸和異戊酸含量均呈顯著上升趨勢，丙酸和TVFA的含量變化不明顯，且日齡對VFA含量無顯著影響。

4.3相關分析

不同瘤胃微生物之間存在相互促進作用；瘤胃液pH僅與溶纖維丁酸弧菌的數(shù)量呈顯著正相關；丙酸含量與小韋榮球菌的數(shù)量呈顯著正相關，而戊酸含量與小韋榮球菌的數(shù)量呈極顯著負相關，與反芻獸月形單胞菌的數(shù)量呈顯著負相關。

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(編輯郭云雁)

Effect of Dietary Nutrient Levels on the Number of Related Microbes，pH and VFA Levels in Rumen of Tan Sheep Aged from 150 to 180 Days

WANG Yao-yue，ZHAO Zhao-yan，WANG Xing-tao，CHEN Yu-lin*，YANG Yu-xin*

(CollegeofAnimalScienceandTechnology，NorthwestA&FUniversity，Yangling712100，China)

The aim of this experiment was to study the effect of dietary nutrient levels on the number of related microbes，includingSuccinivibriodextrinisolvens(S.dextrinisolvens)，Prevotellaruminicola(P.ruminicola)，Selenomonasruminantium(S.ruminantium)，Butyrivibriofibrisolvens(B.fibrisolvens)，Ruminococcusflavefaciens(R.flavefaciens)，Veillonellaparvula(V.parvula) andMethanogens，pH and VFA levels in the rumen of Tan sheep aged from 150 to 180 days.One hundred and twelve 105-day-old Tan sheep(half males and half females) with the similar average body weight (BW) of (29±1.25) kg and better body condition were allotted randomly to 4 dietary treatments (group Ⅰ，Ⅱ，Ⅲ and Ⅳ).Each treatment had 4 replicated pens，with 7 sheep in each pen.From group Ⅰ to Ⅳ，energy of diets were 7.08，8.09，9.10 and 10.11 MJ· kg-1，respectively；dietary protein levels were 8.04%，9.19%，10.34% and 11.49%，respectively.The ratio of energy to protein was kept unchanged (about 0.88).The experiment lasted for 75 days，including 15 days for adaptation.On 150 and 180 days of age, one sheep was randomly selected in each replicate for slaughter and rumen contents were collected，pH was tested and VFA levels in the rumen were analyzed by gas chromatography measurement.Genomic DNA was extracted from rumen contents，qRT-PCR was used for the absolute quantification of these related microbes by the consruction of the standard plasmids.The result showed that the number ofS.ruminantiumon different days of age were significantly different (P<0.05).However，with the increasing of dietary nutrient levels，the number ofP.ruminicola，R.flavefaciens，S.dextrinisolvens，B.fibrisolvensandMethanogensincreased significantly (P<0.05).With the distinct days of age and dietary nutrient levels，pH was not significantly different (P>0.05).The content of acetate acid showed significantly downward trend from lower dietary nutrient levels to higher dietary nutrient levels(P<0.05).The ratio of butyrate，isobutyric，pentanoic acid and isovaleric to total volatile fatty acid (TVFA) showed significantly upward trends(P<0.05).There were mutually improved relationships between different rumen microbes.Propionic acid content was significantly and positively correlated with the number ofV.parvula(r=0.42，P<0.05)，while the content of pentanoic acid was extremely significantly negatively related to the number ofV.parvula(r=-0.53，P<0.01).Compared with the effect of days of age，different nutrient levels have greater effects on rumen microbes and VFA levels.There are correlations between the levels of rumen VFA，pH and related ruminal microbes.

Tan sheep；rumen microbes；qRT-PCR；pH；VFA

10.11843/j.issn.0366-6964.2016.10.015

2016-04-19

國家絨毛用羊產(chǎn)業(yè)技術體系項目(CARS-40-13)

王堯悅(1992-)，女，陜西臨潼人，碩士生，主要從事動物營養(yǎng)與飼料科學研究，E-mail：18792629437@163.com

陳玉林，教授，博士生導師，E-mail：chenyulindk@163.com；楊雨鑫，副教授，碩士生導師，E-mail：yxyang@nwsuaf.edu.cn

S811.6

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0366-6964(2016)10-2060-11